Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Микро экологические и технологические аспекты производства про биотических препаратов на основе лактобактерий (обзор литературы) 10
1.1. Современные представления о микро биоценозах человека и их влиянии на макро организм 10
1.2. Лактобактерий - облигатные представители нормальной микрофлоры организма человека 14
1.3. Лактобактерий как основа пробиотиков 22
1.4. Актуальные вопросы изготовления про биотических препаратов на основе лактобактерий 27
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 33
ГЛАВА 3. Совершенствование способа получения про биотических препаратов в виде сухой биомассы во флаконе 44
3.1 Пути повышения эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков 46
3.2. Разработка универсальной защитной среды 47
3.3. Подготовка бактериальных культур к сублимационному выслушиванию 51
3.4. Универсальный режим сублимационного выслушивания 55
ГЛАВА 4. Моделирование свойств и исследование качественных характеристик лиофилизатов лактобактерий 61
4.1. Получение сухой бактериальной массы для изготовления порошковой формы лактобактерина 61
4.2. Изучение биологических параметров сухой биомассы лактобактерий 64
Сравнительное исследование технологических свойств лиофилизатов лактобактерий 65
Исследование стабильности технологических и биологических параметров сухой биомассы лактобактерий 71
Получение и стандартизация дозированных порошков с лактобактерином 79
Изучение влияния вспомогательных веществ на технологические свойства составов на основе сухой бактериальной массы 79
Особенности технологии и качественные характеристики дозированных порошков с лактобактерином 84 Оценка стабильности порошков на основе лактобактерий 89 Экономический аспект усовершенствования технологии лекарственных форм лактобактерина93
Выводы 97
Список литературы : 98
- Современные представления о микро биоценозах человека и их влиянии на макро организм
- Объекты и методы исследования
- Пути повышения эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков
Введение к работе
Актуальность проблемы
Постоянное влияние неблагоприятных техно-, био- и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы человека, характеризует современные условия жизнедеятельности детского и взрослого населения нашей страны и негативным образом отражается на состоянии его здоровья [2, 33, 126, 203]. Вызываемые ими и широкораспространенные среди всех возрастных групп нарушения микробиоценоза играют значительную роль в патогенезе различных заболеваний, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиотических состояний как общемедицинскую [10, 84, 99, 120, 133].
Первоочередной задачей для отечественного производства пробиотиков, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека, является выпуск конкурентоспособных препаратов, не уступающих по своим потребительским свойствам импортным аналогам, которые доминируют в настоящее время на российском фармацевтическом рынке. Это положение диктует необходимость интенсивного развития ряда направлений прикладных исследований, в т.ч. по расширению номенклатуры выпускаемых лекарственных форм пробиотиков, оптимизации и унификации их технологии [31, 68, 81, 111].
Лактобактерии, как важнейшие представители нормального микробиоценоза человека, давно и широко применяются для коррекции дисбиозов кишечника и родовых путей. Терапевтическая практика свидетельствует, что отечественный препарат лактобактерии, традиционно выпускаемый в виде лиофилизата во флаконах, эффективно восстанавливает микрофлору, нормализует функционирование ЖКТ, улучшает обменные процессы и повышает неспецифическую резистентность организма [18, 100, 124]. Общая тенденция расширения сферы применения данного пробиотика в
гастроэнтерологии, акушерстве и гинекологии, стоматологии, дерматологии и других областях медицины вызывает потребность в новых лекарственных формах [96, 169, 200]. Их изготовление предполагает усовершенствования технологических приемов, применяемых при стабилизации культур лактобактерий, для получения сухой биомассы с улучшенными показателями по гигроскопичности и сыпучести материала, необходимыми для организации производства порошковых и других форм препарата.
Перманентной задачей при крупносерийном производстве любых лекарственных форм пробиотиков в условиях конкуренции является необходимость повышения его эффективности за счет снижения материальных затрат на всех стадиях технологического процесса, в т.ч. и при лиофилизации. Так как защитные среды и условия сублимационного высушивания бактериальных культур в значительной степени влияют на качество и себестоимость готовой продукции, то их необходимо рассматривать в качестве постоянных объектов технологических инноваций [68]. В связи с вышеизложенным, исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологии лекарственных форм препарата на основе живых лактобактерий, являются весьма актуальными для производства, пробиотиков.
Цель настоящего исследования
Разработка и совершенствование технологии лекарственных форм пробиотического препарата на основе сухой биомассы лактобактерий.
Основные задачи:
1. На модели лактобактерина разработать эффективные технологические приемы стабилизации бактериальных культур для получения пробиотиков в виде лиофилизата во флаконах. Создать универсальные варианты защитной среды и режима сублимационного высушивания для пробиотических препаратов.
2. Исследовать влияние ксеропротекторов на технологические и
биологические свойства лиофилизата лактобактерий — основы лекарственной формы препарата в виде дозированного порошка.
3. Отработать состав и технологию, а также изучить качественные
характеристики порошковой формы лактобактерина.
Научная новизна
Полученные данные расширяют существующее представление о технологическом потенциале отечественного производства пробиотических препаратов и закономерностях процесса стабилизации бактериальных культур при изготовлении различных лекарственных форм лактобактерина.
Реализован научно-методический подход к совершенствованию производственного процесса, направленный на максимальную унификацию однотипных операций с учетом биологической специфики препаратов на; стадии лиофилизации флаконных форм лакто- и бифидумбактерина. Для указанных препаратов разработаны универсальные варианты защитной среды и режима сублимационного высушивания (Патент РФ № 2322161). Предложены приемы подготовки бактериальных суспензий к лиофилизации, включающие сочетанное использование питательных и защитных свойств"1 компонентов протективной среды для улучшения биологических показателей препаратов.
Изучено влияние различных ксеропротекторов на специфическую активность и физические свойства (гигроскопичность, сыпучесть, насыпная плотность) лиофилизированной биомассы лактобактерий. Установлено, что введение в состав защитной среды аэросила позволяет улучшить технологические параметры лиофилизатов.
При разработке состава порошка определены наполнители (лактоза, аэросил) для лиофилизата лактобактерий, позволяющие получать однородную смесь с удовлетворительными показателями сыпучести и гигроскопичности для дозирования в пакеты.
8 Практическая значимость работы определяется предложенными
эффективными и экономичными технологическими приемами,
позволяющими адаптировать процессы стабилизации биомассы
лактобактерий к условиям массового производства различных
лекарственных форм лактобактерина. Расширение номенклатуры последних,
включающее разработанный дозированный порошковый вариант в пакетах,
' направлено на улучшение потребительских свойств лактобактерина и
повышение его конкурентоспособности на фармацевтическом рынке.
Технологические новации, связанные с производственным применением экономичной защитной СЖМ среды и сокращенного по длительности процесса сублимационного высушивания при изготовлении флаконных форм лакто- и бифидумбактерина, позволяют получать указанные препараты, отвечающие всем требованиям соответствующих ФСП по биологическим и. физическим свойствам.
Результаты представленной работы отражены в НД: регламент производства № 1567-04 «Лактобактерий сухой» (ведомость изменений), регламент производства № 1551-04 «Бифидумбактерин сухой» (ведомость изменений), регламент производства «Лактобактерий порошок» (проект), ФСП «Лактобактерий порошок» (проект).
Основные положения, выносимые на защиту
Усовершенствование способа стабилизации бактериальных культур, включающее использование универсального ксеропротектора и единого режима сублимационного высушивания» при получении флаконных форм лакто- и бифидумбактерина.
Получение лиофилизата лактобактерий с технологическими и биологическими свойствами, пригодными для организации массового производства препарата в виде дозированного порошка в пакетах.
Производственный вариант состава и технологии порошка на основе биомассы лактобактерий, отвечающего требованиям нормативной документации по совокупности биологических и физических параметров.
9 Связь работы с научными программами
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-
' исследовательских работ филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ
«Пермское НПО «Биомед» и ГОУ ВПО «Пермская государственная
фармацевтическая академия Росздрава» (номер государственной регистрации
темы 0191.0018876).
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006; Российской научно-практической конференции «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных форм», Пермь, 2007; Международной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники», Египет, 2007; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург, 2008. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на Межкафедральной научной конференции кафедр^ промышленной технологии с курсом биотехнологии, организации и экономики фармации, фармацевтической химии очного факультета ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава».
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Получен 1 Патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации
I Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 17
таблиц и 15 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных
г исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 243
литературных источника, из них 131 отечественных и 112 зарубежных авторов, приложения.
Современные представления о микро биоценозах человека и их влиянии на макро организм
С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей макроорганизма [124]. В пределах каждого микробиоценоза различают индигенную (аутохтонную, облигатную, резидентную) микрофлору, которая характерна для данного вида макроорганизма и участвует в эволюции вида, и временную (аллохтонную, транзиторную) микрофлору, широко распространенную в окружающей среде [147, 191, 231]. Благодаря наличию сложной и разветвленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма хозяина, в котором она локализована [125, 224, 237].
Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки, рта и носоглотки. В полости рта встречается более 300 видов микробов [231], в кишечнике - более 1000 [18, 25, 140, 149]. Общая численность бактериальных клеток у взрослого человека достигает 1014, что на порядок больше числа клеток всех органов и тканей макроорганизма [16, 189]. Максимальное количество бактерий присутствует в. толстом кишечнике, где оно составляет 400 млрд микробных клеток на 1 г содержимого [7, 228]. Биомасса микробов, заселяющих кишечник взрослого человека, достигает 3 кг [191].
Основу нормальной микрофлоры кишечника составляют облигатно-анаэробные бактерии (в т.ч. бифидобактерии), на долю которых приходится 90% всех микроорганизмов. Остальные 10% микроорганизмов - аэробные: и факультативно-анаэробные бактерии: лактобактерии, кишечная; палочка, энтеробактерии, стрептококки и другие [ 140, 178, 231 ],
Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) представляет собой сложно организованную систему, в структуре которой можно выделить две основные популяции: просветную; и пристеночную. [219];. Формирование просветного микробиоценоза зависит от многих экзогенных и эндогенных факторов, а его окончательный: состав; является результатом смешивания транзиторных и индигенных микроорганизмов [59]. Наибольшее количество микробов составляет пристеночную микрофлору, содержащуюся в муциновом слое [21, 124].
Нормальная микрофлора кишечника выполняет и регулирует многие процессы в организме человека [17, 25, 131, 140, 191]; Одной из важнейших функций нормофлоры является поддержание колонизационной резистентности, под которой понимают совокупность механизмов, придающих стабильность индигенной микрофлоре и предотвращающих заселение макроорганизма посторонними микробами; [97, 217, 240]. К факторам, обеспечивающим колонизационную резистентность относятся: эффект «экранирования» слизистой от проникновения условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой адгезивной: активности индигенных бактерий [146, 220, 231]; выработка нормальной микрофлорой комплекса веществ, оказывающих антагонистическое действие [140, 149, 237, 242]; стимуляция: местного иммунитета, активация синтеза: секреторного IgA, который препятствует адгезии;условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам [117, 147, 212]; конкуренция с экзогенными микробами за питательные субстраты [204].
Микроорганизмы нормальной микрофлоры принимают активное участие в процессах переваривания и всасывания пищи. Они усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, метаболизируют жиры и клетчатку [149, 160, 222, 235]. Нормофлора регулирует перистальтику ЖКТ через образование и катаболизм биогенных аминов (брадикинина и гистамина); продукцию простагландинов; метаболизм желчных кислот с образованием метаболитов, ускоряющих моторику [124]. Индигенные микроорганизмы способствуют всасыванию и участвуют в синтезе витаминов группы В, витамина К, фолиевой, никотиновой, аскорбиновой кислоты и ряда незаменимых аминокислот, способствуют абсорбции в кишечнике солей железа, кальция и витамина D [124, 191]. Микроорганизмы ЖКТ участвуют в водно-солевом обмене [104, 191], в рециркуляции желчных кислот, обмене холестерина, стероидов и других макромолекул [175, 235]. Продуктами жизнедеятельности индигенных бактерий являются летучие жирные кислоты, гормоны и медиаторы, влияющие на функцию печени, сердечнососудистой системы, кроветворения, обмен веществ и т.д. [124, 135, 138, 208, 224].
Нормофлора оказывает морфокинетическое действие [25]. Стимуляция роста эпителиальных клеток микроорганизмами, по мнению W. Roediger [220], обусловлена тем, что продукты микробного метаболизма служат дополнительным важным источником питания клеток слизистой оболочки. Кроме того, жирные кислоты, продуцируемые анаэробами, стимулируют регенерацию эпителия. Их отсутствие в просвете кишечника приводит к развитию язвенного колита и других заболеваний [12].
Симбионтная микрофлора осуществляет детоксикацию экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов, утилизируя непереваренные пищевые вещества и инактивируя канцерогенные соединения [124]. Ряд индигенных бактерий имеет высокую активность нитратредуктазы (пропионибактерии, пептококки, вейлонеллы, грамотрицательные энтеробактерии и другие), за счет чего они предотвращают развитие метгемоглобинемии при высоком содержании нитратов. Особенно это важно у детей раннего детского возраста, имеющих высокую долю фетального гемоглобина [191].
Объекты и методы исследования
В работе использовали производственные штаммы лакто- и бифидобактерий: 2; Г.Г. Штамм Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ; депонирован в коллекции РИСК им . Л;А.. Тарасевича, относится к семейству Lactobacillaceae, роду Lactobacillus виду plantarum: Бактериальные клетки- штамма представляют собой- неподвижные грамположительные палочки длиной от 0,7 до 3,0 мкм, располагающиеся? беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками. Жгутиков не имеют, капсул и спор не образуют. Лактобациллы — факультативные анаэробы,, растут в атмосфере углекислого газа или азота; at также в присутствии кислорода... На плотной среде МРС-4 образуют, выпуклые, непрозрачные, белые, колонии. На жидкой среде МРС-1 вырастают в виде равномерной мути и гомогенного белого1 осадка на дне пробирки. Активность кислотообразования на этой же среде должна-; быть не ниже 230 по Тернеру (Т); На среде МРС-2 образуют колонии в; виде: "тяжей". Оптимальная температура для роста составляет (37+1) С. 2.1.2. Штамм Bifidobacterium bifidum 1, принадлежит к семейству Actinomycetaceae, виду Bifidobacterium bifidum;. роду Bifidobacterium, депонирована коллекции ТИСК им. Л1А. Тарасевича. Бифидобактерий штамма: В: bifidum 1 представляют собой неподвижные: грамположительньіе: полиморфные палочки длиной 4-5 мкм: с бифуркацией на одном или двух концах, располагающиеся в виде скоплений или отдельных клеток. При; росте на полужидких средах визуально вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий при росте нас печеночной среде имеют форму мелких «гвоздей» или «крошек» белого цвета. На плотных средах образуют округлые, непрозрачные, выпуклые с беловатой гладкой поверхностью колонии. Являются облигатными анаэробами. Оптимальная температура для роста составляет (38+1) С, слабый рост проявляют при 20 С и 45 С. Активность кислотообразования при выращивании в печеночной среде составляет не ниже 100 Т. Коммерческие пробиотики «Лактобактерин сухой», «Бифидумбактерин сухой» (лиофилизаты во флаконах) производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и экспериментальные образцы данных препаратов, полученные при отработке состава защитных сред и режимов лиофилизации. Экспериментальные образцы (7 вариантов-45 серий) лиофилизата лактобактерий. Были получены и использованы в качестве объекта исследования технологических свойств и специфической активности при сравнительном изучении эффективности и пригодности экспериментальных и регламентированной защитных сред в ходе разработки порошковой формы лактобактерина. Экспериментальные и 5 экспериментально-производственных серий препарата «Лактобактерин порошок», изготовленные в отделении препаратов бактериотерапии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед». Являлись объектами исследования технологических свойств и специфической активности при разработке рецептуры дозированных порошков и их стандартизации. Для культивирования микроорганизмов и контроля биологических показателей пробиотиков использовали регламентированные питательные среды: МРС-1, МРС-2, МРС-4, модифицированная печеночная среда Блаурокка, мясо-пептонный агар (МПА), питательный агар с 9% натрия хлорида, питательный агар (ПА) с глюкозой, плотная среда Сабуро; агар Эндо, кровяной агар, среда с мочевиной (производства филиалов ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ). Для получения бактериальных взвесей при реакторном культивировании производственных штаммов бактерий использовали казеиново-дрожжевые питательные среды в соответствии с РП «Лактобактерин сухой» № 1567-04 [94], и РП «Бифидумбактерин сухой» №1551-04 [95]. В качестве ксеропротекторов для лиофильного высушивания бактериальных культур использовали сахарозо-желатино-молочные (СЖМ) среды (ФСП 42-0504722405 [114] и ФСП 42-0504729805 [116]) и новые варианты защитных сред.
Пути повышения эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков
В настоящее время наиболее распространенным способом стабилизации бактериальных культур в производстве пробиотических препаратов остается сублимационное высушивание. Доступность именно этого способа длительного сохранения жизнеспособности и биологической активности клеток производственных штаммов позволила в середине прошлого века организовать промышленный выпуск лекарственных форм препаратов, для нормализации кишечной микрофлоры [84]. Последующие разработки всех отечественных медицинских пробиотиков базировались, как правило, на применении лиофилизации бактериальных культур, что в значительной степени определяло показатели качества, сроки годности и понятие дозы препарата [49, 90]. Производительность сублимационного оборудования относится к лимитирующим факторам, определяющим объем выпуска пробиотиков. На эффективность использования сублимационной техники влияет продолжительность цикла высушивания того или иного- препарата. Сокращение длительности процесса предполагает более «жесткие» условия сублимации, связанные с интенсивным подогревом биомассы. Это обстоятельство диктует повышенные требования к защитным средам для лиофилизации, которые должны обеспечить при получении сухого препарата биопротективный и структурообразующий эффект. Наши исследования по подбору адекватных ксеропротекторов включали разработку универсального варианта защитной среды, которая могла быть использована при получении пробиотиков на основе лакто- и бифидобактерий в виде сухой биомассы во флаконах. В то же время необходимость расширения номенклатуры лекарственных форм выпускаемых препаратов, особенно лактобактерина, вызывала потребность в получении сухой биомассы, отвечающей по биологическим и технологическим параметрам требованиям традиционных способов изготовления дозированных порошков (см. главу 4). Если рассматривать процесс подготовки бактериальных культур к лиофилизации и ее осуществление как комплексную проблему, влияющую на эффективность производства, то ее решение не может быть ограничено только подбором защитных сред. Поэтому, другим направлением наших исследований был поиск новых технологических приемов, направленных на повышение устойчивости клеток и (или) увеличение их количества в материале для высушивания, а также на оптимизацию процесса собственно сублимации при лиофилизации препаратов во флаконах. Повышение эффективности использования сублимационной техники при традиционном выпуске пробиотиков в виде сухой биомассы во флаконах предполагает применение защитных сред, позволяющих при сохранении жизнеспособности клеток обеспечить необходимую структуру (внешний вид) сухого препарата в условиях непродолжительного и интенсивного режима, высушивания. Практика разработки защитных сред свидетельствует, что для минимизации гибели клеток и отходов продукции по физическим свойствам состав ксеропротектора для каждого вида бактерий должен включать сбалансированный качественно и количественно набор компонентов. При этом существенное значение имеет количество клеток в бактериальной суспензии, ее эвтектические параметры, а также характер температурного воздействия при замораживании и обезвоживании [11, 34, 57, 75, 108]. Унификация защитных сред, применяемых в производстве пробиотиков, предполагает ограничение количества используемых компонентов, необходимых в составе ксеропротекторов для «жестких» режимов сублимации. При таких режимах высушивания; негативный биологический и структуродеформирующий эффект нивелируется, как правило, увеличением концентрации ксеропротектора в бактериальной суспензии. При этом добиться улучшения структуры сухой биомассы значительно сложнее, чем получить необходимое количество живых клеток в сухом препарате [68]. Логическим завершением:процесса унификации защитных сред, на наш взгляд, можно считать разработку и применение универсального протектора дляизготовления флаконных форм лактобактерина и бифидумбактерина;. как наиболее массовых отечественных медицинских пробиотиков; В? качестве модели для отработки оптимального унифицированного состава защитной среды был выбран лактобактерин, так как бактериальная суспензия штамма; Ь. plantamm 8Р-АЗ отличается; высоким содержанием клеток (до 1010 КОЕ/мл) и низкой температурой замерзания (не выше минус 40 С), что создает определенные трудности при проведении процессов замораживания и высушивания образцов данного препаратам Варианты защитных сред приведены в табл. 3. Бактериальную суспензию (по 2,0 мл во флаконе) замораживали в наклонном положении кассет при температуре минус 50 С не менее 16 чи помещали в сублиматор- ТІГ-50 (Германия). После выхода аппарата на рабочие параметры (температура полок - минус 20 С, температура; конденсатора - минус 50 G, вакуум - до 16,6 Па) сразу задавался нагрев; полок до максимальной температуры (35 С).
