Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оглавление бифидобактерии как представители нормальной микрофлоры человека и основа пробиотических препаратов (обзор данных литературы) 10
1.1. Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль бифидобактерий 10
1.2. Пробиотики 20
1.3. Бифидобактерий как основа пробиотиков 26
1.4. Технологические аспекты производства пробиотиков на основе бифидобактерий 30
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Материалы 40
2.2. Методы 42
Глава 3. Усовершенствование процесса периодического культивирования бифидобактерий в биореакторе 51
3.1. Определение параметров роста производственного штамма B.bifidum№l и их анализ 51
3.2. Выбор источников углеводного питания и значений рН для периодического культивирования бифидобактерий 59
3.3. Оптимизация состава питательных сред для выращивания бифидобактерий 64
Глава 4. Получение и исследование технологических и биологических свойств сухой биомассы бифидобактерий 78
4.1. Апробация вариантов защитной среды для стабилизации суспензии бифидобактерий в процессе лиофилизации 78
4.2. Защитные среды для приготовления сухой биомассы бифидобактерий 86
4.3. Изучение биологических свойств сухой биомассы бифидобактерий 88
4.4. Оценка технологических свойств лиофилизатов бифидобактерий 94
Глава 5. Получение и стандартизация дозированных порошков и капсул бифидобактерий 101
5.1. Изучение влияния природы вспомогательных веществ и способа их введения на технологические свойства лиофилизатов бифидобактерий 101
5.2. Особенности технологии дозированных порошков и капсул 111
5.3. Оценка качества полученных лекарственных форм на основе лиофилизатов бифидобактерий 122
Выводы 129
Список литературы 130
Приложение 155
- Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль бифидобактерий
- Определение параметров роста производственного штамма B.bifidum№l и их анализ
- Изучение биологических свойств сухой биомассы бифидобактерий
- Оценка качества полученных лекарственных форм на основе лиофилизатов бифидобактерий
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема дисбиотических состояний в настоящее время является весьма актуальной для медицины и требует практических решений, связанных с необходимостью организации массового производства пробиотических препаратов, предназначенных для коррекции микрофлоры человека (Алешкин, 2002; Грачева, 1999;Шендеров 2002).
Одним из эффективных средств лечения и профилактики дисбактерио-зов является препарат бифидумбактерин. Традиционной формой выпуска этого пробиотика является лиофилизированная биомасса бифидобактерий во флаконах, что не в полной мере отвечает современным требованиям фармацевтического рынка. Повышение потребительских свойств препарата предполагает выпуск широкого спектра лекарственных форм бифидумбактерина, в том числе порошков и капсул. К достоинствам последних следует отнести: удобство при приеме, транспортировке и хранении, а также безопасность вследствие отказа от стеклянной упаковки.
Для совершенствования технологии лекарственных форм необходим стабильный по технологическим и биологическим свойствам лиофилизат бифи-добактерий, что связано с усовершенствованием процессов накопления и высушивания биомассы.
Выраженная чувствительность бифидобактерий к действию биологических жидкостей определяет актуальность использования технологических приемов, направленных на повышение устойчивости препарата при перораль-ном приеме (Пучнин, 1988; Несчисляев, 2004).
Необходимость исследований, направленных на усовершенствование технологии пероральных лекарственных форм бифидумбактерина, определила актуальность проведенной работы.
Цель и задачи исследований - разработка технологии и стандартизация пероральных дозированных лекарственных форм на основе сухой биомассы бифидобактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
усовершенствовать процесс периодического культивирования бифидобактерий в биореакторе и разработать экономичную производственную питательную среду,
подобрать составы защитных сред для улучшения технологических параметров сухой биомассы бифидобактерий,
- изучить влияние иммобилизации клеток с использованием геля алю
миния гидрооксида на биологические и технологические свойства сухой био
массы бифидобактерий,
- выбрать вспомогательные вещества и разработать составы дозирован
ных порошков и капсул бифидумбактерина,
- оценить качество полученных лекарственных форм.
Научная новизна. Установлены закономерности развития популяции штамма Bifidobacterium bifidurn 1 в процессе управляемого рН-статируемого
периодического культивирования в биореакторе: продолжительность и кинетические особенности фаз роста. Определена оптимальная продолжительность (12-14 ч.) процесса глубинного культивирования и разработана эффективная питательная среда для получения биомассы бифидобактерий.
Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства бифидобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Предложены новые варианты составов защитных сред с учетом специфики получения различных лекарственных форм бифидобактерий. Получена лиофили-зированная ацидорезистентная биомасса иммобилизованных бифидобактерий для использования в технологии дозированных порошков.
Разработан состав наполнителей для лиофилизата бифидобактерий, позволяющий получать однородную смесь для дозирования в пакеты и капсулы, обладающую низкой гигроскопичностью и удовлетворительной сыпучестью.
Практическая значимость работы. Усовершенствованы процессы производственного культивирования и лиофильного высушивания бифидобактерий, позволяющие получать сухую биомассу, пригодную для изготовления различных лекарственных форм бифидумбактерина.
Показана возможность использования в крупномасштабном производстве экономичной соево-дрожжевой среды для выращивания бифидобактерий, мо-лочно-дрожжевой и сахарозо-молочной сред для стабилизации бактериальной суспензии (акт внедрения от 10.09.04 г.).
Разработана технология дозированных порошков в пакетах и капсулах на основе оптимизированной по биологическим и технологическим свойствам сухой биомассы бифидобактерий. На основании проведенных исследований разработаны:
регламент производства №1485-04 «Бифидумбактерин сухой», экспериментально-производственный регламент № 1213-02 «БифоВир порошок», ФСП 42-0135328602 «БифоВир порошок», инструкция по применению препарата «БифоВир порошок», проекты ФСП «Бифидумбактерин капсулы» и инструкции по применению препарата «Бифидумбактерин капсулы».
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Современная гастроэнтерология и проблемы заболеваний органов пищеварения XXI» (Томск, 1999); "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", (Томск, 2001); «Достижения современной гастроэнтерологии», (Томск, 2002); «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы» ( Пермь, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003); Международной научно-практической конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Связь задач исследования с проблемным планом научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ филиала ФГУП «НПО «Мик-роген» МЗ РФ «Томское НПО «Вирион» и ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (№ гос. per. 01.91001873).
На защиту выносятся:
усовершенствование производственного процесса выращивания бифидобактерий на основе особенностей их жизнедеятельности и состава питательных сред при периодическом управляемом рН-статируемом культивировании,
исследование влияния различных ксеропротекгоров на биологические свойства и технологические параметры лиофилизированной биомассы бифидобактерий,
обоснование состава вспомогательных веществ и способа их введения для улучшения технологических свойств лиофилизата бифидобактерий,
- разработка технологии и стандартизация дозированных порошков и капсул
с бифидобактериями.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 27 рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 литературных источника, из них 144 отечественных и 75 зарубежных авторов, 7 приложений на 17 страницах.
Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль бифидобактерий
Макроорганизм и населяющая его микрофлора составляют четкую интегрированную структуру, сложившуюся в процессе длительного эволюционного развития. Эта интеграция обеспечивает слаженную работу всех органов и систем, базирующуюся на принципе саморегуляции. Получены убедительные данные о полезных функциях нормальной микрофлоры пищеварительного тракта и выявлены существенные сдвиги в физиологии лишенных их стерильных животных [17,167,178, 186,195]. С современных позиций нормальную микрофлору человека рассматривают как качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека [3,19,32,48,140,170,172].
Нормальная микрофлора кишечника человека представлена более чем 400 видами. Основу микрофлоры человека составляют облигатные анаэробные бактерии, среди которых грамположительные, не образующие споры микроорганизмы представлены большей частью (90%) бифидобактериями, бактероидами; анаэробная микрофлора - лактобактериями, эшерихиями, энтерококками (10%) и остальная флора — клебсиеллы, протеи, дрожжи, стафилококки ( 1%) [92,93,132]. В выполнении важнейших физиологических функций микрофлоры ведущая роль принадлежит представителям так называемой «защитной» микрофлоры. Она объединяет облигатные микроорганизмы трех систематических групп - бифидобактерий, лактобациллы и нормально ферментирующую кишечную палочку [53,189,203].
Нормальная микрофлора кишечника выполняет и регулирует многие процессы в организме человека [20,30,48,151,185]. Одной из важнейших функций нормофлоры является обеспечение колонизационной резистентности, под которой поднимают совокупность механизмов, придающих стабильность индигенной микрофлоре и предотвращающих заселение макроорганизма посторонними микробами [215]. Колонизационная резистентность обусловлена целым рядом факторов, среди которых:
- эффект "экранирования" слизистой от проникновения условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой адгезивной активности индигенных бактерий [202,213];
- выработка нормальной микрофлорой комплекса веществ, оказывающих антагонистическое действие [147,151,153];
- стимуляция местного иммунитета, активизация синтеза секреторного IgA, который препятствует адгезии условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам [130,161,193,196];
- конкуренция с экзогенными микробами за питательные субстраты [189].
Участие микрофлоры кишечника в процессах обмена веществ заключается в высокой метаболической активности микроорганизмов, в том числе расщеплении и утилизации пищевых субстратов, регуляции водно-электролитного, газового, энергетического обмена, теплообмена и теплорегуляции. Вырабатывая разнообразный набор ферментов (протеазы, липазы, амилазы, целлюлозы и др.) микрофлора пищеварительного тракта принимает непосредственное участие в метаболизме белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот [160,163,205,214].
Микрофлора оказывает стимулирующее действие на функции печени за счет кишечно-печеночной циркуляции органических и неорганических соединений, гормонов, цитокинов, ведущих компонентов желчи — солей желчных кислот, желчных пигментов, холестерина, ряда макро- и микроэлементов - кобальта, цинка. Кроме этого, симбиотическая микрофлора регулирует всасывание через кишечную стенку ионов кальция, железа, витамина D [27,112,124,125,155,158,164,211]. Важное значение имеет микробный метаболизм углеводов - глюкозы, фруктозы, лактозы и более сложных углеводных соединений - крахмала, пектинов, целлюлозы и др. Через ряд биохимических реакций происходит превращение исходного углевода в промежуточные и конечные продукты, обладающие новой биологической активностью. Например, в результате гидролитического расщепления бифидобактериями лактозы образуется 10 различных галатозидов [7, 66, 71].
В результате метаболизма глюкозы образуются карбоновые кислоты -уксусная, пропионовая, масляная, составляющие группу летучих жирных кислот (ЛЖК). Их молекулярное соотношение в содержимом кишечника постоянно и составляет 60:25:15. ЛЖК восполняют местные энергетические потребности клеток эпителия толстой кишки и адсорбируются из кишечника в кровяное русло. С недостатком в кишечнике монокарбоновых кислот связывают патогенез некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как неспецифический язвенный колит, синдром раздраженной толстой кишки. Кроме этого, ЛЖК принимают участие в абсорбции ионов натрия, калия, хлора, кальция, магния, цинка, воды, т.е. в регуляции водно-солевого и кислотно-щелочного баланса в организме [140,149,199,207]. Микрофлора выполняет важную синтетическую роль, продуцируя витамины группы В, витамин К, никотиновую и фолиевую кислоты, различные биологически активные соединения (бактериоцины, лизоцим, антибиотикоподобные вещества, цитокины), обеспечивающие антагонистическую активность бактериоциноза [140, 185].
Симбиотическая микрофлора играет существенную роль в детоксикации экзо- и эндогенных токсических субстанций, в частности ксенобиотиков [38,97]. Ксенобиотики, благодаря биохимической активности индигенной микрофлоры, могут подвергаться биотрансформации с образованием нетоксических продуктов и ускоренной элиминации из организма. Известно подавление микробами-симбиотами передачи неблагоприятной генетической информации,. которую несут патогенные бактерии, а также разрушение факторов лекарственной устойчивости и аллергенов [71].
Важнейшей функцией нормальной микрофлоры является ее иммуностимулирующее действие, связанное со способностью воздействовать на различные звенья иммунной системы, регулируя неспецифический и специфический клеточный и гуморальный иммунитеты [25,36,112,193,215]. В стимуляции иммуногенеза и активации системы мононуклеарных фагоцитов доказано участие мурамилдипептидов, являющихся компонентами клеточной стенки грамположительных анаэробов и микроаэрофилов. Их высвобождение происходит под влиянием лизоцима и других литических агентов, действующих в кишечнике [17,19,28,50,140,145]:
Итак, симбиотический бактериоценоз представляет собой сложную сбалансированную микроэкологическую систему, которая находится в тесном взаимодействии с организмом хозяина, что обеспечивает состояние так называемого эубиоза и колонизационной резистентности. Исключительно важное и многогранное значение функций симбиотической микрофлоры для жизнедеятельности макроорганизма дает основание расценивать ее как самостоятельный "экстракорпоральный" орган человеческого тела.
Важнейшими представителями защитной микрофлоры человека всех возрастов являются бифидобактерии, которые присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни здорового человека и играют существенную роль в обеспечении состояния физиологической нормы [65,159,180,216,218]. Установлено, что видовой состав бифидофлоры человека неодинаков и претерпевает изменения в зависимости от возраста, характера питания и ряда других физиологических особенностей. Так, у детей, получающих с первых дней жизни естественное вскармливание грудным молоком, в бифидофлоре кишечника преобладают виды В. bifidum, В. infantis, характеризующиеся узким спектром ферментативной активности, а именно, преимущественным расщеплением лактозы, что соответствует составу постоянно поступающего в пищеварительный тракт субстрата в виде грудного молока. У детей старше 3 лет и взрослых людей доминирующими видами бифидобактерии являются В. longum и B .adolescentis, которые обнаруживаются с частотой 75,0 и 56,2 %.
Частота же выделения В. bifidum снижается до 18,7%. У здоровых доношенных детей при искуственном вскармливании с наибольшей частотой выделяются бифидобактерии вида B.adolescentis (47,8%), которым уступают В. longum (34,8%) и В. bifidum (30,4 %) [113]. Бифидофлора оказывает разностороннее положительное влияние на физиологические функции организма человека.
Определение параметров роста производственного штамма B.bifidum№l и их анализ
Периодический способ культивирования предусматривает внесение посевного материала в питательную среду и окончание процесса выращивания по достижении необходимой фазы развития популяции. Для культивирования периодическим способом характерно непрерывное изменение физиологического состояния клеток, вызванное изменениями условий. В процессе роста микроорганизмов в жидкой среде можно выделить несколько фаз, которые характеризуются определенной морфологией и физиологическим состоянием. Многие исследователи [10,24,98] отмечают, что в условиях периодического культивирования культура физиологически наиболее активна в экспоненциальной фазе размножения, когда скорость ее роста максимальна и постоянна в течение всей фазы. Фаза логарифмического роста популяции заканчивается при появлении дефицита элементов питания и воздействия продуктов метаболизма, влияющих на плотность бактериальной культуры. Это ведет к изменению физиологического состояния клеток. Критерием оптимального физиологического состояния популяции служит скорость роста.
Для изучения кинетических показателей роста Bifidobacterium bifidum мы использовали процесс периодического культивирования в биореакторе в условиях рН-статирования. Выращивание проводили на казеиново-дрожжевой среде при температуре (3 8± 1) С, рН=(6,5±0,2) с периодическим перемешиванием в атмосфере инертного газа. В качестве углеводной добавки использовали глюкозо-лактозную смесь. Продолжительность процесса культивирования составляла 15-17 ч.
В процессе культивирования контролировали следующие параметры: общую концентрацию клеток по оптической плотности с помощью ФЭК 56М при А,=540нм в кюветах 1 см, концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) при посеве проб на модифицированную среду Блаурокка, расход щелочи, необходимой для коррекции рН среды выращивания. Каждый процесс культивирования проводили в течение 15-17 часов. На основании полученных данных в процессах культивирования была построена полулогарифмическая кривая изменения оптической плотности, по которой были установлены основные фазы роста культуры бифидобактерий (рис.4.).
В анализируемых процессах лаг-фаза продолжалась четыре часа и характеризовалась незначительными изменениями оптической плотности. Перед наступлением экспоненциальной фазы между 3 и 4 часами наблюдалось уменьшение оптической плотности, что можно объяснить началом деления микробных клеток. Экспоненциальная фаза фиксировалась в интервале с 4 по 12 ч. роста культуры. В этой фазе увеличение оптической плотности происходило с постоянной скоростью. Между 12-14 ч. наблюдалось снижение скорости увеличения показаний оптической плотности, и этот отрезок кривой характеризовали как фазу замедленного роста, которая сменялась стационарной.
Во всех исследованных процессах наблюдали рост концентрации общего числа клеток бифидобактерий до 1010в 1 мл. Увеличение оптической плотности продолжалось до 13-15 ч. роста культуры с последующим ее переходом в стационарную фазу, которая характеризовалась стабильностью показателя оптической плотности. Концентрация жизнеспособных клеток к 12-13 ч. процесса культивирования достигала максимума и составляла 4-6 х109КОЕ/мл, далее наблюдалось падение числа жизнеспособных бифидобактерий (рис.5.).
На основании полученных данных были рассчитаны и проанализированы основные показатели роста бифидобактерий: удельная скорость роста культуры по оптической плотности, удельная скорость кислотообразования по количеству щелочи, затраченному в единицу времени и в единице объема культуры на нейтрализацию кислоты, выделившейся в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, отнесенную к оптической плотности культуры в данный момент времени. Максимальная удельная скорость роста культуры по оптической плотности составляла 0,43-0,45 час"1 и наблюдалась в интервале между 4 и 9 ч. культивирования. Снижение удельной скорости с небольшими интервалами до 0,2ч"1 отмечали между 9 и 12 ч. Между 12 и 14 ч. отмечали фазу замедления скорости роста до 0,1 ч", которая сменялась стационарной фазой (рис.6).
При анализе закономерностей изменений удельной скорости роста бифидобактерий и кислотообразования нами было отмечено, что в промежутке между 9-10 и 11-13 ч. культивирования происходит снижение удельной скорости роста бифидобактерий, а рост удельной активности кислотообразования увеличивается.
Рост удельной скорости кислотообразования в начале фазы замедления скорости роста культуры может свидетельствовать об активизации метаболических процессов в популяции бифидобактерий, связанных с накоплением энергетических субстратов или с энергозатратами на адаптационные процессы в изменившихся условиях культивирования. Проведенный анализ изменений активности кислотообразования удельной скорости роста и концентрации жизнеспособных клеток дает основание предполагать существование внутри фазы замедления скорости роста более коротких этапов, различающихся по физиологическому состоянию бифидобактерий.
Известно, что устойчивость микробных клеток в процессе высушивания в большой степени зависит от фазы роста и физиологического состояния культуры, взятой для лиофилизации. Это же определяет и стабильность лиофилизированной биомассы в процессе хранения.
Изучение биологических свойств сухой биомассы бифидобактерий
Исследуемые образцы сухой микробной массы измельчали на шаровой мельнице до размера частиц менее 0,5 мм и изучали показатели специфической активности: содержание количества КОЕ бифидобактерий в 0,1 гр лиофилизата и активности кислотообразования, являющихся интегральным параметром, который характеризует биохимическую и антагонистическую активность бифидобактерий. А также исследовали устойчивость к антибактериальному действию биологических жидкостей (желудочный сок, желчь) и безвредность (табл.15).
Проведенные исследования показали, что введение в состав защитных сред дополнительных компонентов (аэросила и геля алюминия гидроксида) во всех вариантах обеспечивает высокую выживаемость бифидобактерий при лиофильном высушивании, кроме варианта 1. Показатели выживаемости от (8,31±0,11) до (8,49±0,08) lg КОЕ /ОДгр вариантов 2,3,4, 5,6,7, 8, 9 достоверно не отличались по отношению к контролю (8,46±0,1) lg КОЕ /ОДгр. В варианте 1 наблюдали более низкие показатели содержания КОЕ бифидобактерий -(8Д0±0ДЗ) lg КОЕ /ОД г (р 0,05). Аналогичные результаты были получены при сравнении показателей активности кислотообразования. Данные показатели от (140,56±ЗД1) до (147,66±8,32) Т в вариантах 2,3,4,5,6,7,8,9 и достоверно не отличались от контрольных показателей (146,84±4,07) Т. В варианте 1 показатель активности кислотообразования был значительно ниже контроля и составил (128,66±9,41) Т ( р 0,05). Показатель безвредности для всех исследуемых вариантов лиофилизата бифидобактерий однозначен и соответствовал безвредности.
Известно, что желчь и желудочный сок обладают бактерицидным действием и служат факторами неспецифической антибактериальной защиты организма [5]. Это обстоятельство учитывается при конструировании новых препаратов, устойчивость к действию биологических жидкостей является одним из основных требований к современным пробиотикам [76].
Одним из вариантов, позволяющим при производстве лекарственных форм снизить неблагоприятное воздействие биологических жидкостей, является иммобилизация клеток.
Использование геля алюминия гидроксида в составе защитной среды обусловлено его антацидными, обволакивающими и адсорбирующими свойствами. В медицинской практике гель алюминия гидроксида применяют при повышенной кислотности желудочного сока, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, острых и хронических заболеваниях, когда показано уменьшение кислотности и протеолитической активности желудочного сока [82]. Предполагалось, что введение геля алюминия гидроксида в состав бактериальной суспензии сохраняет жизнеспособность и биологическую активность микробных клеток при контакте со стенкой и содержимым желудка, следовательно, способствует кислотоустойчивости лиофилизата бифидобактерий. Адсорбцию проводили следующим образом: к бактериальной суспензии добавляли гель алюминия гидроксида (ФС 42-3612-98) в разных концентрациях и интенсивно перемешивали в течение 20-30 минут. Степень полноты иммобилизации определяли визуально по характеру расслоения исследуемой суспензии. Наличие плотного осадка и прозрачной надосадочной жидкости свидетельствовало о том, что абсолютное большинство бактерий находится в адсорбированном состоянии. Исследование надосадочной жидкости показало, что содержание жизнеспособных клеток в ней во всех случаях не превышает 10% от количества адсорбированных бактерий.
Для изучения устойчивости лиофилизатов бифидобактерий к биологическим жидкостям были отобраны образцы, содержащие в своем составе гель алюминия гидроксида (варианты 1,2,3,4,5,6). В качестве образца сравнения использовали сухую микробную массу производственного штамма Bifidobacterium bifidum №1.
Влияние биологических жидкостей на выживаемость бактерий определяли по изменению количества КОЕ после выдерживания 1мл регидратированной взвеси бифидобактерий в 9 мл биологической жидкости в течение 2 часов при температуре 37 С. Результаты эксперимента представлены на рисунке 12 .
Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о резко выраженном инактивирующем действии желудочного сока в отношении производственного штамма В. bifidum №1, что подтверждают литературные данные [76,131]. Так, после двухчасового контакта с желудочным соком содержание живых бифидобактерий в биомассе закономерно снижалось с (8,3 ±0,1) до (3,5±0,24) lg КОЕ /доза, т.е. не менее чем на пять порядков. Такая же закономерность снижения активности до (5,47±0,15) lg КОЕ /доза, т.е. на три порядка, была выявлена при исследовании действия желчи медицинской. При изучении влияния желудочного сока и желчи на выживаемость бактерий в экспериментальных образцах, иммобилизованных на геле алюминия гидроксида, была установлена выраженная эффективность защиты бактериальных клеток от разрушающего действия желудочного сока и желчи.
После двухчасового контакта с желудочным соком и желчью исходное содержание жизнеспособных микробных клеток в образцах 2,3,4,5,6 снижалось не более, чем на один порядок.
Сухая биомасса, содержащая в составе гель гидроксида алюминия, по структуре практически не отличалась от биомассы, приготовленной с регламентированной защитной средой, имела более светлый цвет, но уступала по скорости растворения в физиологическом растворе.
При подсчете количества жизнеспособных клеток в экспериментальных образцах было выявлено, что морфологические признаки колоний, образуемых адсорбированными бактериями, не отличаются от контроля и имеют характерный для бифидобактерий вид «гвоздиков» или «зерен». Методом электронной микроскопии установлено, то иммобилизованные клетки бифидобактерий не имеют отличительных признаков по морфологическим свойствам в сравнении с морфологией клеток бифидобактерий нативной взвеси (рис. 13, 14).
Результаты данного этапа исследования показали, что все варианты лиофилизатов бифидобактерий, приготовленные с различными составами защитных сред, соответствовали требованиям действующей НД по основным биологическим показателям: по количеству жизнеспособных клеток бифидобактерий, активности кислотообразования, безвредности.
Иммобилизация бактериальных клеток на микроносителе — геле алюминия гидроксида в образцах 1,2, 3,4, 5, 6 повышает устойчивость лиофилизатов бифидобактерий к разрушающему действию желудочного сока и желчи, что свидетельствует о перспективности разработки технологии лекарственных форм на его основе.
Оценка качества полученных лекарственных форм на основе лиофилизатов бифидобактерий
Полученные лекарственные формы бифидумбактерина «БифоВир порошок» и «Бифидумбактерин капсулы» оценивали согласно общих фармакопейных статей ГФ XI изд., вып.2.
Оценивая качество лекарственной формы в виде дозированного порошка в пакетах "БифоВир порошок" было установлено, что во всех сериях порошок имел беловато-серый цвет со специфическим запахом и вкусом.
При определении подлинности бактериоскопическим методом в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживались грамположительные полиморфные палочки с бифуркациями, располагающиеся в виде скоплений или отдельных клеток.
При определении растворимости содержимое пакетов растворялось в течение 5 минут с образованием гомогенной массы беловато-серого цвета.
Отклонение от средней массы при взвешивании содержимого пакетов находилось в пределах ±5%.
Показатель потери массы при высушивании не превышал 5% во всех исследуемых образцах.
Значения рН порошков определялись потенциометрически и находились в пределах 5,5 -6,5.
Все серии препарата были безвредны для белых мышей при пероральном введении 0,5 мл взвеси препарата, полученной при разведении раствором натрия хлорида 0,9% из расчета 0,5 мл на 1 дозу.
Контролируемые серии характеризовались отсутствием посторонних микроорганизмов и грибов.
При определении количества живых микробных клеток в 1 дозе препарата содержание жизнеспособных бифидобактерий было не менее 10 КОЕ.
Показатель активности кислотообразования во всех испытуемых образцах -не менее 90 Т.
Полученный и отконтролированный препарат «БифоВир порошок» в количестве 5 серий был заложен на хранение в сухое, защищенное от света место, с температурой от 2 до 10 С. В приложении 4 представлены результаты оценки данных серий в процессе хранения.
Полученные результаты показали, что при хранении в течение 1 года 3 месяцев качество порошков соответствовало предъявляемым требованиям.
Порошки всех серий через 1 год 3 месяца не изменили своих свойств и соответствовали предъявляемым требованиям по всем показателям: внешнему виду, подлинности, растворимости, средней массе, показателю рН, потери в массе при высушивании, безвредности, отсутствию посторонних микроорганизмов и грибов, специфической активности. Полученные материалы позволили установить срок хранения для данной лекарственной формы 1 год.
Материалы, полученные при оценке качества 5 экспериментально-производственных серий, легли в основу разработки ФСП-42-135-3286-02 "БифоВир порошок" (приложение 5).
Оценку качества полученных капсул бифидумбактерина проводили согласно требованиям ГФ XI к капсулированным лекарственным формам.
Капсулы по внешнему виду отвечали требованиям ГФ XI, содержимое капсул — порошок беловато-серого цвета со специфическим запахом и вкусом.
При определении подлинности бактериоскопическим методом в мазках окрашенных по Граму, обнаруживались грамположительные полиморфные палочки с бифуркациями, располагающиеся в виде скоплений или отдельных клеток.
При определении распадаемости на шуттель-аппарате исследуемые капсулы распадались в течение не более 20 минут с образованием рыхлой массы беловато-серого цвета с незначительным осадком на дне колбы (наполнители).
Отклонение от средней массы при взвешивании содержимого капсул находилось в пределах ±10 %.
Значения рН содержимого капсул определялись потенциометрически и находились в пределах 5,5-6,5.
Все серии препарата были безвредны для белых мышей.
По микробиологической чистоте капсулы соответствовали требованиям ГФХІ.
При определении количества живых микробных клеток в 1 дозе препарата содержание жизнеспособных бифидобактерий было не менее 107КОЕ.
Показатель активности кислотообразования во всех испытуемых образцах не менее 90 Т.
Препарат «Бифидумбактерин капсулы » в количестве 5 серий был заложен на хранение в сухое, защищенное от света место, с температурой от 2 до 10 С. В приложении 6 представлены результаты оценки данных серий в процессе хранения.
Полученные результаты показали, что при хранении в течение 1 года 3 месяцев качество капсул соответствовало предъявляемым требованиям.
Капсулы всех серий через 1 год 3 месяца не изменили своих свойств и соответствовали предъявляемым требованиям по всем показателям: внешнему виду, подлинности, распадаемости, средней массе, показателю рН, безвредности, микробиологической чистоте, специфической активности. Полученные материалы позволили установить срок хранения для данной лекарственной формы 1 год.
Материалы, полученные при оценке качества 5 экспериментально-производственных серий, легли в основу проекта ФСП "Бифидумбактерин капсулы "(приложение 7).
В настоящее время проект ФСП «Бифидумбактерин капсулы» и 5 экспериментально-производственных серий представлены на контроль в Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Результаты проведенных исследований легли в основу разработанной технологической схемы производства препаратов на основе бифидобактерий.
На рисунке 26 представлены схемы производства препаратов на основе бифидобактерий по существующей и предлагаемой технологиям.
По разработанной технологии для накопления биомассы бифидобактерий на стадии ТП-5 используется соево-дрожжевая среда, которая имеет ряд преимуществ в сравнении с традиционной казеиново-дрожжевой, а именно, на 70 часов сокращается длительность технологического процесса на стадии ТП-2 «Приготовление полуфабрикатов для производства сред». Это позволяет увеличить оборачиваемость оборудования в 3 раза.
Предлагаемая соево-дрожжевая среда не уступает казеино-дрожжевой по эффективности (ростовым свойствам), проста в изготовлении и экономична. Себестоимость 1 литра казеиново-дрожжевой среды составляет 13 рублей 08 копеек, для соево-дрожжевой среды данный показатель - 7 рублей 09 копеек.
Для стабилизации бактерийной взвеси предлагаются новые защитные среды: молочно-дрожжевая для флаконной формы и молочно-сахарозная для получения сухой микробной массы бифидобактерий. Из состава этих сред исключен дорогостоящий компонент желатин и снижено содержание сахарозы. Молочно-дрожжевая среда имеет в своем составе нативный дрожжевой аутолизат. Себестоимость предлагаемых защитных сред значительно ниже себестоимости используемой в производстве сахарозо-желатиново-молочной среды (себестоимость 1 литра СЖМ среды 34 рубля 66 копеек, молочно-дрожжевой-29 рублей 26 копеек, молочно- сахарозной- —17рублей 48 копеек). Стадия ТП-4 в разработанной технологии выполняется аналогично существующей.
