Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общие понятия идентификации личности в судебной медицине 13
1.2. Преимущества молекулярно-генетических методов при решении задач криминалистической идентификации 19
1.3. Молекулярно-генетические индивидуализирующие системы, оперирующие на уровне анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК 21
1.4. Полимеразная цепная реакция 23
1.5. Некоторые популяционно-генетические аспекты исследования микро- и минисателлитных локусов 26
1.6. Характеристика локуса амелогенина, а также микро-и минисателлитных локусов, исследованных в настоящей работе 29
1.6.1. Молекулярно-генетическая пол-специфическая индивидуализирующая система AMG/AMGL -. 29
1.6.2. Минисателлиты 31
1.6.2.1. Локус D1S111 31
1.6.2.2. ЛокусD1S80 34
1.6.3. Микросателлиты 3 4
1.6.3.1. Локус HUM vWF 34
1.6.І2. Локус HUMCD4 " 36
1.6.3.3. Локус HUMLPL 37
1.6.3.4. Локус HUMTH01 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Материалы, реактивы и реагенты 4 Г
2.3. Методы исследования 42
2.3.1. Выделение ДНК 42
2.3.1.1. Выделение ДНК из венозной крови 42
2.3.1.2. Выделение ДНК из следов крови и слюны 43
2.3.1.3. Выделение ДНК из пятен спермы и смешанных пятен с присутствием спермы 45
2.3.1.4. Выделение ДНК из мышечных тканей; выделение ДНК из хрящевой ткани 45
2.3.1.5. Выделение ДНК из костной ткани и зубов 46
2.3.1.6. Выделение ДНК из клеток влагалищных оболочек луковиц волос 47
2.3;2. Анализ полиморфизма длины амплифицированньгх фрагментов хромосомной ДНК 48
: 2.3.2.1. Полимеразная цепная реакция .48
2.3.2.2. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 49
2.3.2.3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДЬЖ в полиакриламидном геле .50
2.3.2.4. Определение аллелей и
генотипирование фрагментов 51
2.3.3. Статистическая обработка данных 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 54:
3.1. Изучение видовой специфичности амелогениновой
системы установления генетического пола 54
3.2. Изучение свойств гетерологических маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК 68
3.3. Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирзоощих систем, оперирующих на уровне полиморфизма длины амшшфицированньк фрагментов хромосомной ДНК 81
3.3.1. Изучение свойств молекулярно- генетической индивидуализирующей системы на основе xpoMccoMHOK^OKycaDlSlll 81
3.3.2. Уточнение номенклатуры аллельных вариантов и характеристика аллельного полиморфизма молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе пентануклеотидного тандемного повтора HUMCD4 90-
3.3.3. Изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК в аспекте судебно-экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем CD4, vWA и vWFII 99
3.4. Популяционные аспекты экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа 108
3.4.1. Распределение аллелей локуса D1S80 в выборке населения Российской Федерации 110
3.4.2. Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклеотидных тандемных повторов LPL, vWA и ТН01
среди населения России 113
Глава 4. Выводы 119
Глава 5. Практические рекомендации 120
Список литературы
- Преимущества молекулярно-генетических методов при решении задач криминалистической идентификации
- Молекулярно-генетическая пол-специфическая индивидуализирующая система AMG/AMGL
- Выделение ДНК из пятен спермы и смешанных пятен с присутствием спермы
- Изучение свойств гетерологических маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Объекты биологической природы являются самыми распространенными вещественными доказательствами по многим категориям уголовных и гражданских дел. Результаты их судебно-медицинских экспертных исследований служат важнейшей доказательной базой при расследовании и раскрытии преступлений и изобличении лиц, их совершивших.
Поэтому методологические подходы, направленные на разрешение задач в области судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств биологического происхождения, являются наиболее востребованными для современной судебной науки. Их совершенствование и повышение эффективности представляет значительный интерес для судебных и следственных органов.
Все это, а также прогресс в области фундаментальных исследований
и технологий, активное внедрение их результатов в практику,
предопределяет неизбежное углубление содержания и расширение
возможностей судебно-медицинских экспертиз вещественных
доказательств, и, в первую очередь, судебно-медицинских молекулярно-генетических исследований.
Молекулярно-генетический идентификационный анализ" - новое
научно-практическое направление, сложившееся за последние десятилетия
на стыке наук молекулярной биологии, молекулярной генетики и судебной
медицины, - на сегодняшний день является самым доказательным методом
анализа биологических объектов при производстве судебно-медицинской
экспертизы вещественных доказательств [Иванов П.Л., 2006; Иванов П.Л.,
Клевно В.А., 2008]. Эти технологии позволяют эксперту с максимальной
вероятностью высказаться о принадлежности следов на вещественных
доказательствах конкретному лицу - что, по существу, является
предназначением и конечной целью данного вида экспертизы. Определен
* спектр экспертных приложений, где молекулярно-генетические методы
оказались наиболее востребованы с точки зрения задач судебно-медицинской экспертизы. Это идентификация личности и установление биологического родства, которые относятся к одним из самых востребованных видов экспертных задач.
. Молекулярно-генетические , судебно-медицинские экспертные: технологии включают в себя комплекс методик, которые позволяют, в частности, на уровне геномной ДНК, выявлять индивидуализирующие, признаки в биологических следах на вещественных доказательствах и проводить сравнительный анализ этих признаков с соответствующими генетическими характеристиками проходящих по делу лиц.. Указанные технологии отличаются высокой дифференцирующей способностью -благодаря использованию в качестве индивидуализирующих характеристик высокополиморфньгх генетических локусов, а также чрезвычайно высокой чувствительностью - благодаря применению процесса энзиматической амплификации молекул ДНК, известному как полимеразная цепная реакция! (ПЦР). Энзиматическая амплификация в полимеразной цепной реакции? тандемно организованных гипервариабельных локусов мини- и микросателлитной природы ядерной (хромосомной) ДНК приводит к формированию индивидуально специфичных продуктов (аллельных фрагментов), различающихся по длине, которые дифференцируют путем электрофоретического фракционирования. Этот методический подход, основанный на анализе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК подробно описан, и его принципы положены в основу индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, широко используемых в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе [Иванов/ П.Л., 1999; Иванов П.Л., 2001; Иванов П.Л:, 2003].
В последние годы наблюдается все более масштабное развитие новейших высокотехнологичных разработок в области анализа ДНК. Тем не менее, для целей судебно-медицинской экспертной практики по-прежнему актуальны базовые варианты молекулярно-генетических
7 технологий. По сравнению с методиками, основанными на использовании
роботизированных станций и автоматических анализаторов, трудоёмкость
и время анализа выше, но стоимость используемого оборудования и
реагентов заметно меньше. Речь, в первую очередь, идет о ставшем уже
классическим анализе ПДАФ ДНК с помощью гель-электрофореза с
последующей визуализацией электрофоретической картины путем
окрашивания бромидом этидия или серебром. Этот методический подход
является эффективным экспертным инструментом, и позволяет решать на
высоком уровне доказательности самые сложные экспертные задачи. В то
же время, он характеризуется высокой степенью сложности, в .частности, в
интерпретации полученных данных, и содержит в себе опасность
экспертных ошибок, которые могут быть обусловлены недостаточно
полным знанием свойств самого используемого инструмента, то есть,
свойств тех молекулярно-генетических тест-систем, которые применяются
в анализе [Гыскэ Л.И., 1995b; Исаенко М.В., 2000 и др.]. Очевидно, что это
может приводить к самым, серьезным следственным и судебным ошибкам.
В этом плане, углубленное знание аналитических свойств
применяемых систем молекулярно-генетического типирования, способно
наглядно повысить эффективность работы . эксперта, обеспечив его
дополнительной, информацией, . необходимой _ для адекватной
интерпретации получаемых экспертных данных. Поэтому изучение
аналитических характеристик молекулярно-генетических
индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного
типирования ДНК представляется весьма важной и актуальной исследовательской задачей.
В качестве решения данной задачи, в настоящей диссертационной
* і
работе планировалось изучить аналитические характеристики ряда
молекулярно-генетических индивидуализирующих систем,
применяющихся в современной судебно-медицинской практике, и определить диапазон возможностей и ограничений этих систем, а также
особенности их использования для решения конкретных экспертных задач..
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось проведение комплекса научно-методических исследований, направленных на дальнейшую методическую разработку судебно-медицинских аспектов применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ИДАФ-типа (то есть основанных на феномене полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК). В! работе планировалось изучить аналитические характеристики ряда*
молекулярно-генетических. .-'индивидуализирующих систем,
применяющихся в современной судебно-медицинской практике, ш, определить диапазон возможностей и ограничений этих систем, а также особенности их использования для решения конкретных экспертных задач. .
Согласно указанным целям, в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Изучить особенности амелогенинового ДНК-теста определения?, биологического пола применительно к анализу половой принадлежности ДНК в смешанных биологических следах, содержащих биологический; материал человека и животных;
Изучить свойства гетерологических маркерных систем - стандартов;
молекулярных масс, - определить диапазон возможностей и ограничений применения размерных стандартов данного типа при судебно-медицинском фрагментном анализе ДНК;
Изучить аналитические характеристики некоторых молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, применяющихся Вл современной судебно-медицинской практике, включая уточнение номенклатуры аллельных вариантов и изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК, и оценить судебно-медицинское значение выявленных свойств;
Изучить популяционные характеристики некоторых
индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, применяемых для судебно-экспертного типирования ДНК, с целью оценки идентификационной значимости признаков, анализируемых на уровне ДНК, и вычисления необходимых расчетных параметров при интерпретации результатов судебно-экспертных молекулярно-генетических идентификационныхv исследований.
Научная новизна и практическое значение работы.
Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК в аспекте судебно-медицинской идентификации личности и установления биологического родства,, проводимых в отделе молеісулярно-генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской экспертизы Росздрава; Таким образом, данная работа непосредственно связана с. процессом разработки; развития и внедрения новых высокоэффективных технологий геномной идентификации в сферу деятельности отечественной судебно-медицинской экспертизы.
Проведенное в диссертационной работе целенаправленное научное
исследование и углубленная разработка практических основ использования
молекулярно-генетических индивидуализирующих тест-систем,
основанных на анализе ПДАФ хромосомной ДНК применительно к анализу вещественных доказательств биологического происхождения, открывает новые аспекты судебно-экспертного типирования ДНК. Кроме того, оно представляется весьма актуальным и важным с точки зрения вопросов, решаемых судебно-медицинской идентификационной . экспертизой; Результаты диссертации могут служить дополнительным материалом для обеспечения системного внедрения молекулярно-генетических методов, идентификации личности и определения биологического родства в практическую судебно-медицинскую деятельность экспертизы России.
Результаты работы нашли применение при проведении более чем 700
экспертиз, в числе которых идентификационные исследования, по установлению личности неопознанных жертв террористических актов в Москве в 1999 г., останков генерала Г. Н. Шпигуна - заложника, погибшего в Чеченской Республике в 2000 г., останков украинского журналиста F. Гонгадзе в 2001 г., массового убийства малолетних детей в Красноярске 2005 г., убийства женщин, сопряженные с их изнасилованиями .на территории Иркутской области в период с 1994 по 2000 гг., умышленного убийства губернатора Магаданской области В; И: Цветкова в 2002, г., идентификация неопознанного тела задержанного по подозрению в; подготовке теракта и погибшего при проведении следственных действий гражданина A. F. Пуманэ, убийства женщин на территории Битцевского лесопарка в г. Москве .2006-2007 гг., а также идентификационные экспертизы, проведенные в рамках расследования целого ряда других преступлений, имеющих общественный,резонанс.
Основные положения, выносимые на защиту.
Амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным. При судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного -определения мужского пола в следах женского происхождения. В биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.
Принципиальное значение для правильной идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК имеет условие, что размерные стандарты (стандарты молекулярных масс) и анализируемые фрагменты гомологичны, то есть, представлены одинаковыми
полинуклеотидными последовательностями; В ином случае - если
нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и
контрольной ДНК оказываются различными (такие ДНК называют
гетерологичными), нельзя исключить, что в определении размеров
фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки; обусловленные
различиями в физико-химических, и, как следствие,
электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.
3. Разрешены выявленные в литературных источниках и имеющие,
принципиальное значение . противоречия^ касающиеся структурной
организации аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК
человека D1S111 и HUMGD4. Преодоление этих противоречий важно с
точки зрения применения этих молекулярно-генетических маркеров В:
. судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследованиях и при формировании референтных баз данных.
4. Между микросателлитньїми локусами генома человека vWA и?
vWFII существует достоверная генетическая взаимозависимость
(неравновесие по сцеплению). Это означает, что при типировании
локусов vWA и vWFII в составе одной мультилокусной панели, ввиду
показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих
маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов)
неприемлемо.
Апробация работы и практическое внедрение.
Полученные результаты внедрены в экспертную деятельность отдела судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных и научных исследований Российского центра СМЭ Росздрава, используются в экспертной практике генетической лаборатории Бюро СМЭ Департамента
здравоохранения; г. Москвы и Бюро СМЭ Московской области при проведении экспертиз в целях установления личности и установления биологического родства.
Материалы диссертации отражены в научных : статьях;,
опубликованных в рецензируемых научных, журналах и- изданиях,
определённых Высшей аттестационной комиссией; в том числе, в журнале
"Судебно-медицинская экспертиза" (8'статей); а также в публикациях по;
материалам научных съездов и конференций. Всего- по теме диссертаций* ,
опубликовано 11; работ. Результаты диссертации докладывались на пятш-
научных конференциях Российского центра судебно-медицинской
экспертизы, а;также на 4; 5 и 6 Всероссийских съездах судебных медиков
(Владимир, 1996; Астрахань, 2000; Тюмень, .2005). Апробация, работы
состоялась 10; апреля 2008 г. на расширенной? научно-практической,
конференции,ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава». ; ; .'"'".'
Структура и объём диссертации;
Диссертационная работа изложена на 148 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и' списка литературы. Работа; иллюстрирована^ 32 таблицами^ и 14- рисунками. Список литературы включает 224 источника отечественных и зарубежных авторов.
Преимущества молекулярно-генетических методов при решении задач криминалистической идентификации
Научные основы криминалистической идентификации, такие как индивидуальность (неповторимость) предметов и явлений материального мира, относительная неизменность (устойчивость) объектов материального мира — составляют концептуальную основу молекулярно-генетической индивидуализации, а именно — индивидуальная генетическая уникальность каждого организма и- генетическая идентичность всех его клеток и тканей [Иванов П.Л., 2001].
Молекулярно-генетическая индивидуализация - это вид исследования биологических объектов, которое развивается на стьже наук молекулярной биологии, молекулярной генетики и судебной медицины [Иванов П.Л., 1993].
Взаимосвязь криминалистики и молекулярной генетики впервые была продемонстрирована в Великобритании в 1985 г. при публикации в журнале TSTature" работы A. Jeffreys «Индивидуально-специфичные «отпечатки пальцев» ДНК человека». В следующей работе под названием «Судебно-экспертное использование «отпечатков пальцев» ДНК» была продемонстрирована возможность использования анализа хромосомной ДНК человека для судебно-медицинской идентификации личности [Gill Р. е.а., 1985; Gill Р. е.а., 1987; WongZ. е.а., 1987].
В нашей стране исследования в области «геномной дактилоскопии» были начаты в 1987 г. в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР [Иванов П.Л. и др., 1989; Иванов П.Л. и др., 1990; Рогаве Е.И., Юров Ю.Б., 1990; Иванов П.Л. и др. 1991а,1991б].
Молекулярно-генетические методы наиболее востребованы в судебно-медицинской экспертизе при решении задач идентификации личности при
расследовании убийств, тяжких телесных повреждений, изнасилований, при опознании трупов, подвергшихся сильной деформации вследствие взрывов [Иванов П.Л., Жаров В.В., 2002], пожаров, массовых катастроф [Иванов П.Л., Клевно В.А., 2008] и военных конфликтов [Щербаков В.В., 2000, Иванов П.Л., 2001].
Преимуществом молекулярно-генетических методов, в отличие от методов криминалистической идентификации, является возможность установления биологического родства, в частности, экспертиза отцовства, материнства, верификация других кровнородственных связей, т.е. возможность опосредовано решать задачи в случаях подмены, утери, похищения детей, выявления фактов кровосмешения, установления личности при потере памяти или в случае установления происхождения и поиска родственников при отсутствии данных о родителях [Haglund W. е.а., 1990].
Приоритетом выбора в использовании молекулярно-генетических методов является то, что объекты исследования в течение всей жизни не изменяемы — набор генов данного организма строго индивидуален и не зависит от условий взаимодействия с окружающей средой. Два основополагающих принципа - индивидуальная генетическая уникальность каждого организма и генетическая идентичность всех его клеток и тканей — составляют концептуальную основу молекулярно-генетической индивидуализации [Иванов П.Л., 2003].
На сегодняшний день судебно-медицинская молекулярно-генетическая экспертиза вещественных доказательств - наиболее доказательный метод анализа биологического материала при расследовании преступлений. Особая ценность генетической идентификации для правоохранительных органов связана с тем, что в отличие от традиционных методов судебной биологии она обеспечивает наиболее высокий уровень доказательности - благодаря тому, что позволяет экспертам делать выводы о конкретном человеке, от которого происходит исследуемый биологический объект, тогда как все другие методы ограничиваются лишь констатацией его групповых характеристик [Иванов П.Л., Клевно В.А., 2008].
Доказательное установление тождества биологических объектов, исследованных традиционными иммунологическими методами, носит условный характер и, в основном, ограничивается констатацией генетических признаков, характеризующих тот или иной фенотип проходящих по делу лиц [Туманов А.К., 1975; Томилин В.В., Гладких А.С., 1981]. Это обусловлено относительно небольшим числом маркёров с ограниченным числом вариантов. Объективность выводов может возрастать с введением в расчет большого - числа критериев, однако на практике серологические методы индивидуализации применяются крайне редко — при установлении биологического отцовства [Томилин В.В. и др., 1989], а с 1995 года, в связи с принятием Федерального закона от 29.12.95 № 223 о решении вопроса спорного отцовства методом "генетической дактилоскопии", потеряли свою актуальность.
В настоящее время разработаны общие принципы использования молекулярно-генетических методик для целей судебно-медицинской идентификации, основанных на совместном типировании хромосомной и митохондриальной ДНК [Иванов П.Л. и др., 2002,2004].
Молекулярно-генетическая пол-специфическая индивидуализирующая система AMG/AMGL
Полиморфный минисателлит D1S111 впервые был выявлен с использованием мультилокусного зонда 33.6 в прицентромерной области длинного плеча хромосомы 1 [Jeffreys А. е.а., 1985а, 1985b, 1988, 1990].
Этот маркер расположен на З -конце гена CD3Z, кодирующего белок-предшественник зета-цепи ТЗ-антигена - поверхностного гликопротеина Т-лимфоцитов (ТіТЗ комплекс). Сам минисателлит D1S111 локализован в области lq23, а содержащая его референтная последовательность AL359962, общей протяженностью более 67 т.п.н. локализована в области Iq23.3-q25.1.
В этом локусе было выявлено не менее 14 аллелей, содержащих от 9 до 22 повторов, с гетерозиготностью от 53 до 72%.
В 1996 году отечественными авторами была предложена праймерная система для амплификации аллелей этого маркера, определена нуклеотидная последовательность одного из аллелей, предложена номенклатура аллелей согласно числу тандемных повторов, а также изучено частотное распределение аллелей в выборке из русской популяции г. Москвы [Ефремов И.А. и др., 1996]. Это обусловило последующее, у использование минисателлита D1S111 в качестве молекулярно-генетической индивидуализирующей системы в судебно-медицинских приложениях по установлению родства и идентификации личности на территории России и ближнего зарубежья.
Тем не менее, уровень полиморфизма этого маркёра до настоящего времени был охарактеризован .недостаточно полно и на относительно малочисленных выборках. Кроме этого, в литературных данных имеются определенные неясности и разночтения, касающиеся структурной организации аллелей данного локуса.
Нуклеотидная последовательность минисателлита D1S111 впервые была представлена в электронной базе данных GenBank в 1993 году, согласно опубликованным ранее данным [Jeffreys А. е.а., 1985а]. На конец 2004 года в этой базе данных было представлено три референтные последовательности для минисателлита D1S111 (таблица 1). Четвертая известная нуклеотидная последовательность, соответствующая аллельному варианту 14, описана ранее в работе [Ефремов И.А. и др., 1996].
Изучение вопросов структуры аллельных вариантов и, соответственно, номенклатуры, представляется актуальным с точки зрения повышения эффективности судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследований с использованием локуса D1S111.
Одним из наиболее распространенных минисателлитных маркеров для судебно-экспертного типирования ДНК человека является хромосомный локус D1S80, содержащий блок тандемных повторов по 16 пар нуклеотидов, число которых варьирует от 13 до 41 и более [Budowle В., 1995]. Впервые наличие высокополиморфной последовательности, содержащей тандемные повторы (GNNGTGG), с использованием зонда рМСТ118 показал в своей работе Nakamura Y. е.а. в 1988 г. Значения индекса гетерозиготности изменяются от 56 до 86% в различных популяционных выборках [Sajantila А. е.а., 1994; DekaR. е.а., 1994].
Данный микросателлит давно и широко используется в сравнительно-популяционных исследованиях и входит во многие панели локусов ПДАФ-типирования для идентификации личности и установления биологического родства, используемые в США и Европе [Budowle В. е.а., 1991; Sullivan е.а., 1992; Maha G. е.а., 1995, Watanabe G. е.а., 1997].
При исследовании индивидуализирующей системы HUMvWFII ее выявленной особенностью стало обнаружение в 40 интроне гена HUMvWFII, имеющего хромосомную локализацию 12р13.3-р13.3 (Mancuso D. е.а., 1989) три дистанцированных друг от друга полиморфных микросателлитных мотива (ATCT)n/(AGATC)n. Ген vWF (von Willebrand factor, фактор Виллебранда) имеет общую протяженность 178 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), содержит 52 экзона и расположен на коротком плече хромосомы 12 [Ginsburg D. е.а., 1985, Mancuso D., 1989]. В интроне 40 этого гена находится полиморфный участок (позиции 1597...2521 по референтной последовательности GenBank: М25858.1), содержащий множественные копии тетрануклеотидного тандемного повтора (ATCT),/(AGAT)n [Peake I., 1990]. Данный полиморфизм является наиболее информативным в сравнении с другими вариабельными областями гена vWF, и с помощью ПНР на этом участке выявляют 3 дистанцированных друг от друга полиморфных микросателлитных маркера [Camming А., 1992].
Наиболее известен микросателлит vWA (GDB: 186564, находится в 5 -концевой части полиморфного участка, позиции 1640...1794, обозначается так же как HUMvWFIII, vWA, HUMvWFA3 I/A) [Kimpton С, 1992]. Референтная последовательность содержит 20 повторов мотива AGAT.
Именно этот маркер включен в коммерческие наборы американских фирм "Promega" (GenePrint STR Systems) и "Applied Biosystems" (AmpFlSTR Identifiler, AmpFlSTR Profiler Plus), входит в состав стандартизованных панелей из 7 локусов европейского проекта ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes) и 13 локусов проекта единого Федерального генетического банка данных CODIS (Combined DNA Index System), созданного в 1997 г. под патронатом ФБР США [Budqwle В., 1997, Smith S.W., 1994]. К настоящему времени показано существование 13 аллелей (содержащих от 10 до 22 повторов) усредненного мотива ТСТА (TCTG)3_4 (ТСТА). У европеоидов выявляются аллели 13...21 (причем аллель 21 весьма редкий) [Sajantila А., 1996]. Частоты аллелей определены также в различных популяциях России [Kornienko L, 2002].
Выделение ДНК из пятен спермы и смешанных пятен с присутствием спермы
При получении препаратов ДНК из пятен спермы и смешанных пятен с присутствием спермы руководствовались методическими разработками [GiustiA. е.а., 1996].
Измельченный материал, вырезанный из пятен с присутствием спермы, экстрагировали лизирующим буфером: 0,01 М трис НС1 (рН 8,0), 0#1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl до полного смачивания ткани в течение 18 час при 4С. Материал отжимали, центрифугировали при 1500 g 30 мин, к осадку добавляли аналогичную буферную смесь до 0,5 мл, SDS до 2% и протеиназу К до конечной концентрации 400 мкг/мл. Препараты инкубировали при 56С в течение 2 час. Затем пробы центрифугировали 10 мин при 4000 g. Осадок ресуспендировали в аналогичной буферной смеси с добавлением 2-меркаптоэтанола до 2% и инкубировали 18 час при 37С. После добавления равного объема смеси, содержащей фенол и хлороформ (1:1), а также 2% меркаптоэтанола (объем/объем), содержимое пробирок перемешивали. Водную и органическую фазы разделяли путем центрифугирования при 12000 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Водную фазу переносили в чистые пробирки и повторяли экстрагирование указанной смесьюГ Вновь полученную водную фазу экстрагировали равным объемом хлороформа (хлороформ : изоамиловый спирт - 24 : 1). Водную фазу концентрировали на колонках «Centricon», руководствуясь рекомендациями фирмы-производителя.
Выделение ДНК проводили с использованием рекомендаций [Gill Р. е.а., 1985; Walsh S. е.а., 1991; DNA procedures manual, USA, 1998].
Измельченный материал, представляющий собой фрагменты мягких тканей либо хряща, экстрагировали лизирующим буфером: 0,01 М трис НС1 (рН 8,0), 0,01 М ЭДТА, 0,1 М NaCl. Добавляли SDS до 2% и протеиназу К до конечной концентрации 1 мг/мл. Препараты инкубировали при 56С 1 час, затем при 37С в промежутке времени от 18 час до двух суток (в зависимости от скорости лизиса ткани; в случае длительного инкубирования повторно добавляли протеиназу К до суммарной концентрации 1,5-2 мг/мл). После добавления равного объема смеси, содержащей фенол и хлороформ (1:1), а также 2% меркаптоэтанола (объем/объем), содержимое пробирок перемешивали. Водную и органическую фазы разделяли путем центрифугирования при 12000 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Водную фазу переносили в чистые пробирки и повторяли экстрагирование указанной смесью. Вновь полученную водную фазу экстрагировали равным объемом хлороформа (хлороформ : изоамиловый спирт -24:1 по объему). Водную фазу концентрировали на колонках «Centricon», руководствуясь рекомендациями фирмы-производителя. Выделение ДНК проводили с использованием рекомендаций [Fisher D., 1993; DNA procedures manual, USA, 1996, 1997].
Костные фрагменты, предварительно отмыв дистиллированной водой, поверхностно обрабатывали 0,5% раствором хлорамина и затем обезжиривали, погрузив в 96% этанол на 5 мин. После высушивания под ультрафиолетовой лампой, участок кости площадью около 1,5 кв. см измельчали до состояния костного порошка, приготовляя навески в среднем по 1-1,5 г.
Зубы подготавливали к экстракции так же, раскалывая коронку на несколько фрагментов. Объекты экстрагировали 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) с добавлением Tween 20 до 1%, либо буферной смесью, содержащей 0,01 М трис НС1 (рН 8,0), 0,01 М ЭДТА, 0,1 М NaCl с добавлением SDS до 2%; добавляли протеиназу К до конечной концентрации 1 мг/мл. Препараты инкубировали при 56С 1 час, затем при 37С в промежутке времени от 18 час до двух суток (в зависимости от скорости лизиса ткани; в случае длительного инкубирования повторно добавляли протеиназу К до суммарной концентрации 1,5-2 мг/мл). После добавления равного объема фенола содержимое пробирок перемешивали. Водную и органическую фазы разделяли путем центрифугирования при 2000g в течение 20 минут при комнатной температуре. Водную фазу переносили в чистые пробирки, добавляли равный объем смеси, содержащей фенол и хлороформ (1:1), а также 2% меркаптоэтанола, содержимое пробирок перемешивали.
Водную фазу переносили в чистые пробирки и повторяли экстрагирование указанной смесью. Вновь полученную водную фазу экстрагировали равным объемом хлороформа (хлороформ : изоамиловый спирт - 24 : 1 по объему).
Водную фазу после фенол-хлороформной экстракции концентрировали на колонках «Centricon», руководствуясь рекомендациями фирмы-производителя, а затем в некоторых случаях подвергали кипячению в присутствии ионообменной смолы Chelex 100 как описано [Walsh е.а., 1991]. При выделении ДНК руководствовались рекомендациями [Gill Р. е.а., 1985;HiguchiR. е.а., 1988].
Исследуемые волосы микроскопировали. Отобранные луковицы вместе с прикорневой частью (фрагменты длиной около 1 см) отделяли от стержней волос, отмывали в смеси 96% этанола с дистиллированной водой (2:1 — объемюбъем) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем несколько раз промывали дистиллированной водой. Волосы заливали 5% раствором Chelex 100 (50 мкл) с добавлением ДТТ до 0,04 Ми протеиназы К до конечной концентрации 1 мг/мл, после чего инкубировали в течение 18 ч при 37Є и 1 ч при 5 6С. Далее исследуемый препарат подвергали инкубации при 1009С в течение 15 мин. После центрифугирования в течение 2 мин при 12000 g водную фазу переносили в; чистые; пробирки. Аликвоты объемом 5-15 мкл использовали для амплификации ДНК/в ИЛР.
Изучение свойств гетерологических маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК
Интерпретационная часть судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств, выполняемой с помощью применения методов амплификационного ПДАФ-типирования, основывается на анализе так называемых амплификационных профилей ДНК, которые представляют собой электрофореграммы распределения по молекулярному размеру продуктов локус-специфической полимеразной реакции [Иванов П.Л., 1999]. В норме - это индивидуально-специфичный набор из двух полиморфных фрагментов, которые могут иметь разную длину (в этом случае на электрофореграмме видны две полосы) или быть одинаковыми (тогда они на электрофореграмме накладываются и выглядят как одна полоса на дорожке геля).
Полиморфные по длине фрагменты ДНК, представляющие у разных людей разные аллельные варианты соответствующих гипервариабельных локусов, дифференцируют с помощью гель-электрофореза: они характеризуются определенным расположением на дорожке геля. Этот амплификационный профиль ДНК является в данном случае индиви дуализирующей характеристикой человека, которому принадлежит анализируемая ДНК: - Отождествление или дифференциация объектов экспертизы осуществляется на основании сравнительного анализа (совпадение несовпадение) индивидуализирующих признаков ДНК, выявленных в ходе идентификационного исследования, то есть - на основании совпадения или несовпадения амплификационных профилей. В случае совпадения генетических профилей проводят вероятностный анализ, призванный ответить на вопрос — какова статистическая значимость этого совпадения. Иначе говоря, оценивают индивидуализирующее значение совпадающих признаков. Исходным параметром для оценки распространенности признака служит величина, называемая вероятностью признака. В нашем случае это - вероятность аллеля, которая называется также аллельной частотой.
Существенно, что аллельные частоты в пределах одного локуса могут достаточно сильно различаться: некоторые аллельные варианты очень редкие - встречаются всего у доли процента населения, тогда другие встречаются у каждого третьего или четвертого индивидуума (рис. 10). Соответственно, вероятность случайного совпадения таких аллелей у неродственных людей, а значит, и доказательственное значение экспертизы окажутся очень разными. Проблема для эксперта здесь в том, что аллели, которые сильно разнятся по частоте встречаемости, могут различаться по размеру весьма незначительно - всего на одно повторяющееся звено, а это для некоторых локусов всего 2-3% длины фрагмента. Если на геле один из таких аллелей ошибочно принять за другой, то это может обусловить серьезные ошибки в выводах.
Рисунок 10. Распределение аллелей локуса D1S80 среди населения стран Центральной Европы. На оси абсцисс указаны номера аллелей, по оси ординат - частота встречаемости аллелей (%) по данным работы [Корниенко И.В., 2002].
Таким образом, для решения экспертной задачи требуется установить (идентифицировать) выявленные аллели, то есть в точности определить, какие именно аллели данного локуса совпали. На практике для этого определяют условный молекулярный размер фрагментов ДНК — например, длину в парах нуклеотидов. В некоторых случаях размер фрагментов определяется расчетным путем на основании измерений их пробега на электрофореграмме.
Чтобы определить размеры амплифицированных фрагментов ДІЖ по их расположению на геле нужно проанализировать профиль электрофоретического разделения для данного конкретного геля и для него определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров. Это можно сделать, используя стандарты молекулярных масс, то есть фрагменты ДНК заранее известного размера, которые фракционируют на том же геле, что и анализируемые амплифицированные фрагменты. Для расчетов применяют специальные алгоритмы, которые характеризуются высокой степенью точности. Однако следует подчеркнуть, что принципиальное значение для всех алгоритмов имеет условие, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты - гомологичны, то есть, представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. Между тем, в практике ПДАФ-анализа это условие часто не выполняется: нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными. Такие ДНК называют гетерологичными. В этом случае нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.
В связи с вышесказанным, представляется весьма важным изучить специфику и разработать принципы использования гетерологических маркерных систем для фрагментного анализа ДНК при судебно-экспертной идентификации. личности и установлении родства. Это и явилось", целью настоящего исследования.
Для фракционирования ДНК используется электрофорез в гелях полиакриламида и агарозы. Нами изучены обе эти системы с точки зрения возможных ограничений при использовании гетерологических маркерных
Если говорить в общем, то скорость миграции ДНК через гели при . электрофорезе определяется пятью основными параметрами, а именно (цит. по [Маниатис Т. и др., 1984]):
1) Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются/в геле предположительно . одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными; десятичному логарифму ихмолекулярных масс. При нейтральных И: щелочных значениях рН электрофоретическая подвижность денатурированной ДНК в свободном . растворе не зависит от ее молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе.
2) Концентрация геля. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК и. концентрацией геля существует прямая зависимость. Применяя гели различных концентраций, можно разделить, большой набор .фрагментов.:ДНК,., различающихся по_.размеру. Полиакриамидные гели используют для анализа фрагментов ДНК, имеющих длину менее 1 тыс.
3) Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформацйи, движутся в геле с разными скоростями. Относительная подвижность различных форм ДНК в гарозных гелях зависит главным образом от концентрации агарозы, а также от таких; . факторов как сила тока и ионная сила буфера.
