Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные представления о патогенезе аутоиммунного тиреоидита 12
1.2. Атитела к ДНК и их значение при аутоиммунной патологии 24
1.3. Открытие природных аутоантител с функциональным каталитическим ресурсом 29
1.4. Новый метод определения аутоантител к ДНК с использованием пьезокварцекого биосенсора 35
1.5. Использование атомно-силовой микроскопии в биологии и медицине 38
ГЛАВА 2. Материалы, объем и методы исследований 42
2.1. Объем исследования 42
2.2. Определение содержания антител к нативной ДНК и денатурированной ДНК в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа 44
2.3. Метод определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови с использованием пьезокварцевого биосенсора 45
2.3.1. Анализ с помощью пьезокварцевого биосенсора в газовом режиме 46
2.3.2. Иммунизация кроликов комплексом ДНК-ДНКаза 1 47
2.3.3. Определение антител к нативной ДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме 49
2.4. Определение ДНК-гидролизующей активности сывороток крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц 51
2.5. Изучение ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом 53
2.5.1. Выделение антител к нативной ДНК из сыворотки крови больных АИТ 53
2.5.2. Визуализация взаимодействия ДНК и антител методом атомно-силовой микроскопии 55
2.6. Статистическая обработка результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 59
3.1. Клиническая характеристика больных аутоиммунным тиреоидитом 59
3.2. Определение антител к нативной и денатурированной ДНК класса IgG в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа 68
3.3. Определение антител к нативной ДНК класса IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа 75
3.4. Определение антител к нативной ДНК в сыворотке крови при помощи пьезокварцевого биосенсора 77
3.4.1. Определение антител к нДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в газовом режиме 77
3.4.1.1. Определение антител к нДНК в сыворотке крови кроликов 77
3.4.1.2. Определение антител к нДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц 78
3.4.2. Определение антител к нДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме 81
3.5. Исследование ДНК-гидролизующей активности сывороток крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц 83
3.6. Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой
микроскопии 87
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследований 93
Выводы 119
Практические рекомендации 120
Список литературы
- Открытие природных аутоантител с функциональным каталитическим ресурсом
- Определение содержания антител к нативной ДНК и денатурированной ДНК в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа
- Определение антител к нативной ДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме
- Определение антител к нативной ДНК класса IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа
Введение к работе
Актуальность темы. Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) относят к одной из наиболее частых форм тиреоидной патологии после йоддефицитных заболеваний щитовидной железы (Валдина Е.А., 2001; Балаболкин М.И., 2002). Большинство исследователей отмечают тенденцию к увеличению заболеваемости АИТ в течение последних десятилетий (Braverman L.E., 1997; Кандрор В.И., 1999). По данным ряда исследователей, от 4 до 11% населения страдает аутоиммунным тиреоидитом (Зефирова Г.С., 1999, Петунина Н.А., 2002). Среди причин первичного гипотиреоза АИТ занимает лидирующую позицию и манифестный первичный гипотиреоз является ведущим клиническим проявлением заболевания (Касаткина Э.П., 1999; Фадеев В.В. и др., 2000). Патогенез аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, изучен недостаточно. До настоящего времени отсутствуют патогенетически обоснованные подходы в лечении данного заболевания.
Согласно Рекомендациям Российской ассоциации эндокринологов (Дедов И.И. и др., 2003) для диагностики АИТ имеет значение совокупность «больших» диагностических признаков: наличие антител к ткани щитовидной железы, УЗИ-признаков аутоиммунного поражения щитовидной железы и первичного гипотиреоза. В отсутствии хотя бы одного из критериев диагноз АИТ носит вероятностный характер. Однако антитела к тиреопероксидазе (ТПО) могут обнаруживаться при других заболеваниях щитовидной железы, а также у 8-16 % здоровых людей (Mariotti S. Et al., 1990; Ladenson P.W. et al., 2000). Ультразвуковая картина не всегда позволяет дифференцировать АИТ от эндемического и узлового зоба; гипотиреоз может развиться вследствие генетически обусловленных дефектов, а также в рамках эндемического поражения щитовидной железы.
В настоящее время показано методом электрофореза (Невинский Г.А. и др., 2000) и линейного дихроизма (Сучков СВ. и др., 2001), что аутоантитела к ДНК, обладая гидролизующими свойствами ферментов, по-видимому, принимают участие в процессе апоптоза (Сучков СВ. и др., 2001), скорость
7 которого при АИТ многократно возрастает (Кандрор, 2001). Сегодня ДНК-гидролизующие аутоантитела рассматриваются в качестве кандидата одного из ключевых факторов в патогенезе развития аутоиммунного процесса. Изучение этих процессов возможно и требует использования высокоточных и наукоемких технологий.
Определение содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови в настоящее время проводится методом ИФА для диагностики СКВ. В литературе имеется сообщение об обнаружении антител к нативной ДНК в сыворотке крови методом ИФА у 50% больных АИТ в состоянии эутиреоза (Pedro А.В. и др., 2006), что возможно обусловлено низкой чувствительностью метода. В связи с этим, представляло клинический интерес сравнить чувствительность двух методов определения аутоантител к ДНК в сыворотке крови больных АИТ: с помощью ИФА и нанобиосенсора -пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора.
С развитием нанотехнологий активно изучаются возможности использования пьезокварцевого биосенсора для диагностики заболеваний. Метод с использованием пьезокварцевых иммуносенсоров характерезуется сочетанием высокой чувствительности, определяемой наноуровнем, селективности, простотой проведения анализа (Luppa Р.В. et al., 2001; Калмыкова Е.Н., 2007).
Актуальность развития нанотехнологий получила свое отражение в национальных проектах Правительства России и создании отдельного Министерства по вопросам бионанотехнологий, функцией которого является разработка новых методов диагностики заболеваний и внедрение их в медицинскую практику. Следовательно, разработка и внедрение в клиническую практику высоко чувствительных, специфичных и точных методов определения как содержания аутоантител к ДНК, так и их гидролизующих свойств, с использованием нанотехнологий необходимы для совершенствования диагностики аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, и контроля качества лечения.
Цель работы. Изучить содержание ДНК-связывающих антител в сыворотке крови и их ДНК-гидролизующие свойства в качестве диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.
Задачи исследования.
Исследовать содержание антител к нативной ДНК (AT к нДНК) и антител к денатурированной ДНК (AT к дДНК) классов IgG и IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа.
Оценить содержание антител к нативной и денатурированной ДНК класса IgG в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом ИФА в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреопероксидазе.
Провести экспериментальную оценку возможности использования нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой.
Провести оценку чувствительности и специфичности определения антител к нативной ДНК методом ИФА и с использованием пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора.
Изучить гидролизующие свойства антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, нанозондовым методом с использованием атомно-силовой микроскопии.
Научная новизна.
Впервые для диагностики аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, предложен высокочувствительный, специфичный, экономичный экспресс-метод на основе нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора по определению аутоантител к нативной ДНК в сыворотке
9 крови больных; получено значительное повышение AT к нДНК в сыворотке крови у больных АИТ и СКВ.
Впервые методом иммуноферментного анализа проведено изучение содержания AT к нативной и денатурированной ДНК классов IgG и IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреоидной пероксидазе. Показано увеличение содержания AT к нативной ДНК у больных аутоиммунным тиреоидитом, что имеет значимость для верификации диагноза.
Впервые применен нанозондовый метод атомно-силовой микроскопии
(АСМ) для визуального изучения взаимодействия молекул нативной ДНК и
выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом
аутоантител к нативной ДНК. Установлено присутствие в сыворотке крови
больных аутоиммунным тиреоидитом антител к нативной ДНК класса IgG,
проявляющих ДНК-гидролизующую активность и имеющих
непроцессивный механизм действия.
Результаты исследования, полученные методом атомно-силовой микроскопии, являются основанием для проведения дальнейших исследований патогенетической роли ДНК-гидролизующих антител при аутоиммунном тиреоидите. Научно-практическая значимость.
Определение содержания AT к нативной ДНК класса IgG в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа и отношения AT к нДНК/ AT к дДНК может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.
Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор может применяться как высокоспецифичный, чувствительный, экономичный экспресс-метод определения AT к нативной ДНК в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой.
10 Для диагностики аутоиммунных заболеваний (аутоиммунного тиреоидита, системной красной волчанки) рекомендуется внедрять в медицинскую практику методы нанотехнологии с использованием пьезокварцевого биосенсора и атомно-силового микроскопа. Внедрение результатов исследования.
Выдан патент РФ на изобретение № 2315313 «Способ определения аутоантител к ДНК и способ диагностики аутоиммунного тиреоидита», приоритет изобретения от 03 марта 2006г.
Основные результаты исследования внедрены в практическую деятельность НУЗ «Отделенческая больница на ст. Казань» ОАО «РЖД», ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр» г. Казань.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры эндокринологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава».
Апробация работы.
Основные положения работы доложены на XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола — Казань - Москва, 2005), VIII Европейском конгрессе эндокринологов (Глазго, Англия, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), научном обществе эндокринологов Республики Татарстан (2007). Публикации результатов исследования.
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, выдан 1 патент РФ на изобретение. Положения, выносимые на защиту.
1. У больных аутоиммунным тиреоидитом в сыворотке крови
определяется повышенное содержание AT к нДНК классов IgG и IgM
методом иммуноферментного анализа. Содержание антител к нДНК в
сыворотке крови больных АИТ имеет взаимосвязь с уровнем антител к тиреопероксидазе.
Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор является высокоспецифичным и чувствительным экспресс-методом, позволяющим определять AT к нативной ДНК в сыворотке крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями (АИТ и СКВ).
Метод атомно-силовой микроскопии дает возможность визуально изучать гидролизующие свойства AT к нативной ДНК при аутоиммунном тиреоидите, имеющие непроцессивный характер.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 319 источника, из них 79 работ на русском и 240 на иностранном языках. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 20 таблицами.
Открытие природных аутоантител с функциональным каталитическим ресурсом
В 60-х годах XX столетия появились первые сообщения о природных антителах, обладающих уникальной функцией - способностью катализировать различные реакции. Группой А. Кульберга была обнаружена протеолитическая активность очищенных препаратов антител кролика (39, 40). Такие AT получили название «абзимы» (от англ. antibody, enzyme), или каталитические антитела. Однако, принадлежность каталитической активности именно выделенным антителам не была доказана и авторы «приписывали» данную активность ферментам, которые могли быть сорбированы на молекулах антител. В 1989 г. группа исследователей под руководством Paul S. показала, что выделенные от больных бронхиальной астмой антитела способны гидролизовать вазоактивный интестинальный пептид (ВИЛ), то есть обладают протеолитической активностью. Это была первая работа, в которой авторы доказывают принадлежность каталитической активности непосредственно антителам (218). Позднее проведенными исследованиями антитела-абзимы обнаружены при системных заболеваниях соединительной ткани (СКВ, системная склеродермия, ревматоидный артрит), АИТ (Paul S. et al., 1998; Власов А.В. и др., 1998), некоторых формах вирусного гепатита (Барановский А.Г. и др., 1997; Генералов И.И., 2002), при лимфопролиферативных заболеваниях (Kozyr A.V. et al., 1998), при СПИД и лейкемии (Gololobov G.V. et al., 1995), гемофилии (Lacroix-Desmazes S. et al., 2002), гнойно-воспалительных заболеваниях (Окулич В.К. и др., 2001), а также в молоке и сыворотке крови женщин во время беременности и лактации (Кит Ю.Я. и др., 1995; Бунева В.Н. идр.,2003).
К настоящему времени описаны природные абзимы, проявляющие протеолитическую, оксидоредуктазную, гиалуронидазную, амилолитическую, пероксидазную, протеинкиназную, фосфатазную, ДНК-азную, РНК-азную активности (Генгералов И.И., 2002).
Исследования Сидорской Е.В. и др. (2000) показали, что при заболеваниях щитовидной железы (диффузный токсический зоб, АИТ, подострый тиреоидит, узловой токсический зоб, рак щитовидной железы) в организме больных циркулируют антитела, проявляющие ДНК-азную, протеолитическую и пероксидазную активности. Но наибольшие уровни всех выявленных видов активности проявляют препараты Ig G, выделенных у больных с АИТ (65).
Основные механизмы генерации каталитических антител хорошо изучены в экспериментах с моноклональными антителами (Tramontano A. et al., 1986). В условиях живого организма развивается поликлональный иммунный ответ, поэтому причины возникновения природных каталитических антител представляются неоднозначно. На сегодняшний день исследователями предлагается несколько наиболее вероятных гипотез образования природных абзимов.
Рассматриваются генетические факторы, обусловливающие появление каталитических антител. В работах (28, 269) для создания генов аутоантител показана вероятность как непосредственного использования V-germ-line-областей, так и их «созревание» после контакта с АГ в результате соматического мутагенеза.
Shokat К.М. и соавт. (1989) в качестве возможного механизма получения каталитических AT рассматривают абзимный кислотно-основной катализ. Здесь в качестве индуктора выступает антиген, имеющий эпитопы с выраженным зарядом. При этом активируются лимфоидные клетки, имеющие в активных центрах рецепторов противоположный заряд.
Другой возможный механизм возникновения каталитических AT рассматривается в рамках модели антиидиотипической цепи Эрне (159), согласно которой при аутоиммунных заболеваниях в организме первоначально накапливаются антитела (идиотип) к различным аутоАГ (белки, нуклеиновые кислоты и их комплексы), а затем-вторичные AT (антиидиотип) к уже наработанным первичным. Исходя из этого, если в качестве антигена выступает фермент, то антиидиотипические AT по своей структуре и свойствам будут его копировать. Так как в организме постоянно вырабатываются антитела против компонентов окружающей среды (ферментов микробов, вирусов - антистрептокиназа, антигиалуронидаза, антиДНКаза и т.д.), изменения в работе идиотипической цепи могут приводить к индукции каталитической активости (19). В условиях in vivo данный путь может вносить существенный вклад в появление каталитических AT (Азаренок К.С, 1989).
С другой стороны, некоторые абзимы предположительно являются антителами непосредсдвенно к субстрату (белку, ДНК и т.д.) (50). В результате апоптоза в крови появляются деградировавшие компоненты клеток (деструктурированные белки, нуклеиновые кислоты), запускающих процесс выработки антител.
Выдвинута концепция механизма образования ДНК-абзимов, основанная на их перекрестной реактивности с белками ядерного матрикса, лишенных нативной ДНК. На экспериментальной модели аутоиммунных мышей показано, что причина образования ДНК-абзимов не связана напрямую с активным аутоиммунным процессом, а может заключаться в дефектах иммуногенетического уровня (Сучков СВ. и др., 2005).
Определение содержания антител к нативной ДНК и денатурированной ДНК в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа
Содержание антител к нативной ДНК и денатурированной ДНК в сыворотке крови определялось иммуноферментным методом на автоматическом анализаторе «EL 808 Bioek Instruments, Inc.» («Diagnostic Products Corporation», CIIIA) с использованием наборов «IgG-Antibodies to double-stranded DNA», «IgG-Antibodies to single-stranded DNA», «IgM-Antibodies to double-stranded DNA» для количественного определения антител классов IgG и IgM («Orgentec», Германия).
Анализ проводился по принципу непрямого твердофазного иммуноферментного анализа в микропланшете, покрытом рекомбинантной ДНК. В ходе анализа происходят связывание присутствующих в сыворотке крови антител к ДНК, образование сэндвичего комплекса и ферментная цветная реакция в следующих фазах:
1 фаза - предварительно разбавленные сыворотки крови, а также стандартные растворы, положительный и отрицательный контроли, содержащие заведомо известные концентрации антител, вносятся в микроячейки планшета. Присутствующие антитела связываются с
Данный раздел и исследования методом атомно-силовой микроскопии выполнены совместно с доцентом кафедры эндокринологии ГОУ ДПО « КГМА Росздрава», д. м. н. Вагаповой Г.Р. иммобилизованными в микроячейках антигеном. После инкубации ячейки промываются для удаления несвязавшихся компонентов сыворотки.
2 фаза — раствор ферментного конъюгата анти-человеческого-IgG с пероксидазой хрена добавляется в ячейки для определения антител, связанных с иммобилизованными антигенами. После инкубации избыток ферментного конъюгата удаляется промывочным раствором.
3 фаза - раствор хромогенного субстрата, содержащий тетраметилбензидин, добавляется в ячейки. В течение инкубации раствор изменяет окраску, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации антител в сыворотке крови. Оптическая плотность рассчитывается при длине волны 450 нм и строится график зависимости оптической плотности стандартных растворов от концентрации антител, и концентрация исследуемых образцов экстраполируется на него.
Для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови использовали пьезокварцевый биосенсор в двух режимах: газовом и проточно-инжекционном. Винтер В.Г. , профессор Ишмухаметова Д.Г.),
Данный раздел был выполнен совместно с сотрудниками кафедры оптики, спектроскопии и нанофотоники КГУ (зав. кафедрой профессор Салахов М.Х.) доцентом Коноваловой О.А. и кафедры биохимии КГУ (зав. кафедрой, профессор ассистентом Фахруллиным Р.Ф.
Для разработки нового метода определения антител к ДНК в сыворотке крови и установления возможности его использования в качестве диагностического критерия АИТ на начальном этапе работы был применен анализ в газовом режиме.
Для анализа в газовом режиме использовались кварцевые микровесы, разработанные и изготовленные доцентом кафедры общей физики КГУ, кандидатом физико-математических наук К.Ю.Нагулиным.
В работе использовались полированные пьезокварцевые резонаторы (ПКР) 8 МГц с золотыми электродами (АО «Морион», С- Петербург). Перед работой кварцевые резонаторы освобождались от металлических корпусов. Один из электродов при помощи силиконового клея герметично закрывался дополнительным кварцевым диском и в работе использовался только открытый электрод.
ПКР соединяли с осциллятором, обеспечивающим колебания резонатора, и закрывали пластиковым контейнером для изоляции от внешней среды. Для регистрации частоты колебаний ПКР применяли электронно-счетный частотомер АСН-1300. Частотомер управлялся от персонального компьютера через последовательный порт RS 232. Схема установки представлена на рис. 2.3.1.
Определение антител к нативной ДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме
Для определения антител к нДНК в проточно-инжекционном режиме использовали кварцевые микровесы QCM 200 фирмы Stanford Research Systems (США). Кварцевые микровесы фирмы SRS снабжены встроенным осциллятором QCM 25 для поддержания колебаний ПКР, частотомером и омметром. Микровесы подключали к персональному компьютеру; управление и фиксирование результатов экспериментов осуществляли с помощью программы Lab View 1.0.
Сенсорной частью кварцевых микровесов являлся ПКР 5 МГц с золотым электродом.
ПКР устанавливали в проточную ячейку и соединяли ее с инжектором и перистальтическим насосом. Для поддержания постоянной температуры +37 С проточно-инжекционная ячейка погружалась в термостатированную камеру. Схема установки приведена на рис. 2.3.2.
Перед проведением эксперимента электроды ПКР очищали по методу (Bardea et al., 1999) с модификациями: 15 мин обрабатывали ультрафиолетом (134-340 нм) на расстоянии 10 см от источника, далее выдерживали в 1 М NaOH в течение 10 мин и в ЇМ НС1 в течение 5 мин. Очистку завершали обработкой ультрафиолетом (134-340нм) в течение 15 мин.
В промежутках между этапами исследования ПКР ополаскивали дистиллированной деионизованной водой и высушвали на воздухе.
Формирование биосенсора осуществляли в несколько этапов.
1 этап. Формирование поли-Ь-лизинового слоя. 200 мкл раствора поли-Ь-лизина (0.1 мг/мл в 0.05 М NaOH-глициновом буфере, рН 0.6) наносили на электрод ПКР, закрепленный в зонде и инкубировали при комнатной t в течение 1 часа во влажной камере. Затем ополаскивали электрод в воде и высушивали.
2 этап. Формирование слоя ДНК. ПКР помещали в проточную ячейку и пропускали через нее рабочий буфер до стабилизации сигнала и фиксации базовой линии. Затем в систему вносили раствор нативной ДНК (50 мкг/мл в 0.05 М Tris-HCl буфере, рН 7.2). Через 25-30 мин происходило насыщение связывания поли-Ь-лизина и ДНК и частота колебаний ПКР стабилизировалась, после чего пропускали через систему рабочий буфер для отмывки неприсоединившейся ДНК. 3 этап. Измерение антител к нДНК в сыворотке крови с помощью ДНК-биосенсора.
Для предотвращения неспецифической сорбции через проточную ячейку пропускали 2 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в трис-солевом буфере (ТСБ), затем отмывали 3 мл ТСБ.
Сыворотки крови прогревали при +56 в течение 40 мин для диссоциации иммунных комплексов и дезактивации сывороточных нуклеаз (136). Сыворотки крови разводили в фосфатно-солевой буфере с твином (ФСБТ) до конечной концентрации белка 0,1 мг/мл, которую измеряли спектрофотометром при длине волны 280 нм. Через проточную ячейку пропускали 5 мл разведенного образца сыворотки.
После эксперимента резонатор 15 мин выдерживали в 2% растворе додецилсульфата натрия (Ds-Na), затем ополаскивали водой, выдерживали 5 мин в 1 М НС1 и обрабатывали ультрафиолетом 10 мин.
Для изучения ДНК-гидролизующей активности сывороток крови больных АИТ, СКВ и здоровых доноров проводили реакцию in vitro. В качестве субстрата использовали плазмидную ДНК pBR 322, выделенную из штамма Е. Coli XL-1 Blue («СибЭнзим», Россия).
Для исключения возможного влияния сывороточных ДНКаз на гидролиз плазмидной ДНК все сыворотки предварительно подвергались прогреванию при 56 С в течение 40 минут. Препарат плазмидной ДНК и образцы сывороток крови разводили в буфере: 25 мМ трис- НС1, рН 7,5, 5 мМ MgCl2 6 Н20, 50 мМ NaCl (табл. 2.4.1).
Реакцию гидролиза проводили при 37 С, отбирая аликвоты по Юмкл через 1, 3 и 6 часов, которые замораживали для предотвращения дальнейшего гидролиза.
Определение антител к нативной ДНК класса IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа
Оценка возможности применения пьезокварцевого ДНК-биосенсора для определения антител к ДНК была проведена с использованием сыворотки крови кроликов до и после иммунизации комплексом ДНК-ДНКаза I. Предварительно уровень AT к нДНК в сыворотках крови определяли методом ИФА (62). В качестве антигена использовали хромосомную ДНК эритроцитов цыплят. Результаты ИФА показали увеличение содержания AT к нДНК в сыворотке кроликов с 0,216 + 0,03 отн. единиц до иммунизации до 0,646 + 0,07 отн. единиц после иммунизации. Таким образом, иммунизация комплексом ДНК-ДНКаза I индуцировала образование у кроликов AT к нДНК.
С помощью ДНК-биосенсора определяли содержание AT к нДНК в сыворотке крови иимунизированных кроликов. Для проведения анализа сыворотки разводили в соотношении 1:25 и 1:50. Инкубация биосенсора с сывороткой после иммунизации, содержащей повышенное количество AT к нДНК по результатам ИФА, приводила к значительному сдвигу частоты пьезокварцевого анализатора, в отличие от сывороток до иммунизации.
Сдвиг частоты биосенсора после инкубации с иммунизированными сыворотками при разведении 1:25 в среднем составил составил 35,2 Гц, и был достоверно выше в сравнении с сыворотками до иммунизации - 12,4 Гц. После инкубации биосенсора с сыворотками кроликов при разведении 1:50 до иммунизации сдвиг частоты пьезокварцевого анализатора в среднем составил 6,1 Гц, после иммунизации - 24,2 Гц (табл. 3.4.1),
Увеличение аналитического сигнала в зависимости от уменьшения разведения сывороток может быть связано как с увеличением концентрации антител, так и с наличием неспецифической сорбции. В связи с этим, в дальнейших исследованиях для предотвращения неспецифической сорбции через ДНК-биосенсор предварительно пропускали раствор бычьего сывороточного альбумина.
Таким образом, пьезокварцевый биосенсор позволяет определять антитела к нДНК в сыворотке крови. Данные пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора согласуются с результатами иммуноферментного анализа.
На содержание AT к нДНК были исследованы сыворотки крови 30 больных АИТ. Контрольную группу составили 15 здоровых лиц, группу сравнения - 10 больных СКВ.
Все больные АИТ имели клинические проявления гипофункции щитовидной железы, уровень ТТГ составлял 11,3 мкМЕ/мл (2,5П - 6,9; 97,5П - 24,6), св. Т4 - 9,7 пмоль/л (2,5П - 7,2; 97,5П - 10,1) и содержание AT к ТПО - 821 МЕ/мл (2,5П- 490,6; 97,5П- 1050).
Сдвиг частоты биосенсора после инкубации с сывороткой больных АИТ составил 122,1 Гц (2,5П - 67,9; 97,5П - 139,7), с сывороткой больных СКВ - 168,7 Гц (2,5П - 127,6; 97,5П - 189,1), и в группе здоровых - 74,1 Гц (2,5П - 50,2; 97,5П - 87,3) (рис. 3.4.1). При этом сдвиг частоты в группе больных АИТ был достоверно выше (р 0,05) значений, наблюдавшихся у здоровых лиц, но ниже показателей в группе больных СКВ (табл. 3.4.2).
Таким образом, использование пьезокварцевого биосенсора в газовом режиме позволяет определять AT к нДНК в сыворотке крови и дифференцировать больных АИТ, СКВ и здоровых лиц.
Проточно-инжекционный режим является более перспективным и активно развивающимся направлением с применением пьезокварцевых биосенсоров (Marx, 2003). В связи с этим ДНК-иммуносенсор был апробирован при проточно-инжекционном анализе сывороток крови 30 больных АИТ, 15 СКВ и 10 здоровых доноров.
Все больные АИТ находились в состоянии гипотиреоза, уровень ТТГ составлял 14,4 мкМЕ/мл (2,5П - 7,6; 97,5П - 25,6), св. Т4 - 8,9 пмоль/л (2,5П -7,9; 97,5П - 10,1) и содержание AT к ТПО 783,5 МЕ/мл (2,511 - 395,6; 97,5П -1010,0).
Сдвиг частоты биосенсора в группе больных АИТ составил 33,7 Гц (2,5П-4,1; 97,5П-54,3), в группе больных СКВ - 87,5 Гц (2,5П-53,6; 97,5П-100,4), в группе здоровых - 4,3 Гц (2,5П-2,1; 97,5П-30,4). Как видно из таблицы 3.4.3, данный показатель у больных АИТ был на 712 % выше по сравнению со здоровыми лицами (р 0,005), и на 61,1 % ниже по сравнению с больными СКВ (р 0,01).
На рис. 3.4.2. показано изменение частоты колебаний биосенсора при определении антител к нДНК в сыворотках крови больной АИТ, СКВ и здорового донора. При введении образца сыворотки в проточную ячейку происходит падение частоты колебаний биосенсора. При этом различия в сдвиге частоты в зависимости от содержания антител к нДНК могут быть обнаружены в течение первых 10-15 мин с момента внесения исследуемой сыворотки крови в ячейку.
