Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль ДНК/РНК-связывающего белка TDP-43 в патогенезе фронто-темпоральной дегенерации 11
1.2. Системы контролируемой деградации белков - потенциальные мишени для разработки патофизиологической терапии 14
1.3. Регуляторные механизмы аутофагии 19
1.4. Роль аутофагии в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний 23
1.5. Разработка методов патофизиологической терапии НДЗ, основанной на фармакологической регуляции аутофагии 25
1.6. Димебон и его производные 36
Глава 2. Методы и материалы 41
2.1. Соединения 41
2.2 Клеточные культуры 42
2.3 Микроскопический и иммуно-цитохимический анализ 45
2.4 Методы, использованные для получения генетических конструкций.
2.5 Анализ белков 49
2.6 Анализ экспрессии генов 52
3 Результаты и обсуждение 55
3.1 Моделирование TDP43 протеинопатии в культуре клеток нейробластомы человека 55
3.2. Влияние Димебона и его производных на прогрессию протеинопатии в клеточных культурах 72
3.3. Исследование молекулярно-клеточного механизма ингибирующего действия Димебона 88
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы
- Системы контролируемой деградации белков - потенциальные мишени для разработки патофизиологической терапии
- Роль аутофагии в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний
- Микроскопический и иммуно-цитохимический анализ
- Влияние Димебона и его производных на прогрессию протеинопатии в клеточных культурах
Введение к работе
Актуальность исследования. Постоянный рост числа нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), связанный с увеличением продолжительности жизни в развитых странах, является серьезной проблемой. Различного рода деменции составляют основную группу НДЗ в категории старшего возраста. Ожидается, что в ближайшие 30 лет их количество удвоится. Эффективного лечения для подавляющего большинства заболеваний на сегодняшний день не разработано. Деменции неизлечимы и неизбежно прогрессируют, в результате чего качество жизни как самих больных, так и членов их семьи, на которых часто ложится основная нагрузка по уходу за больными, со временем ухудшается. Все используемые на данный момент подходы к лечению НДЗ относятся к симптоматическим.
Фронтотемпоральная лобная дегенерация (ФТЛД) является третьей по распространенности формой возрастных нейродегенеративных заболеваний после болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Перед современной биомедицинской наукой поставлена актуальная задача необходимости разработки методов ее ранней диагностики и эффективного лечения. Создание адекватных модельных систем для изучения молекулярных механизмов развития ФТЛД и воспроизведения наиболее важных аспектов патогенеза данного заболевания обеспечит существенный прогресс в данном направлении и позволит проводить направленный поиск соединений для создания патофизиологической терапии ФТЛД.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы являлось создание адекватной клеточной модели TDP43-протеинопатии, пригодной для отбора нейропротекторных препаратов, необходимых при разработке методов патогенетической терапии нейродегенеративных заболеваний, основным молекулярно-патологическим звеном которых является агрегация белка TDP43.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Сконструировать экспрессионные плазмиды, кодирующие патогенныe формы белка TDP43 человека, способные формировать TDP43-реактивные включения в клеточных культурах.
-
Воспроизвести в цитоплазме культивируемых клеток образование TDP43-реактивных структур, аналогичных патогистологическим включениям, обнаруживаемым у больных с ФТЛД и БАС.
-
Применить разработанную клеточную модель для отбора соединений, способных ингибировать процессы формирования TDP43-реактивных включений – основного патофизиологического фактора TDP43-протеинопатий.
-
Исследовать действие Димебона (гамма-карболинового соединения) на компоненты метаболических путей, вовлеченных в регуляцию аутофагосомной системы с целью разработки патогенетической терапии TDP43-протеинопатий на основе гамма-карболинов.
Научная новизна работы. В основе многих распространенных НДЗ лежит нарушение метаболизма и функции определенных белков, обладающих повышенной склонностью к агрегации. Патологическая агрегация конформационно-нестабильных белков и накопление токсичных продуктов этого процесса приводит к дисфункции пораженных нейрональных и глиальных клеток и, в конечном итоге, к их гибели. Недавно было показано, что в патогенезе целого ряда протеинопатий, в частности, некоторых форм фронтотемпоральной дегенерации (ФТЛД), критическую роль играет нарушение нормального метаболизма и функции ДНК/РНК-связывающего белкa TDP43, сопровождающееся образованием характерных цитоплазматических включений. В представленном диссертационном исследовании проведена работа по созданию оригинальных модельных систем, воспроизводящих основные элементы молекулярного патогенеза TDP43 протеинопатии в клеточных культурах. Создана панель оригинальных экспрессионных плазмид для исследования способности различных форм белка TDP43 человека к образованию цитоплазматических включений, сходных с патогистологическими включениями, обнаруживаемыми у больных с наследственными формами ФТЛД и БАС. Проведенный сравнительный анализ патогенных свойств различных мутантных форм белка TDP43 человека позволил получить новые данные о роли различных доменных последовательностей молекулы TDP43 в механизме формирования цитоплазматических депозитов. Впервые была получена агрессивная мутантная форма белка TDP43 (Т5), способная образовывать патогенные включения амилоидного типа, и установлено, что для получения подобных агрегатов необходимо одновременное нарушение белковой структуры двух областей молекулы: РНК-связывающего домена и сигнала ядерной локализации. Созданная на основе аберрантной Т5 формы оригинальная клеточная модель TDP43-протеинопатии была впервые адаптирована для изучения и тестирования нейропротекторных препаратов, способных ингибировать прогрессию TDP43-протеинопатии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Созданная клеточная модель, воспроизводит ключевое звено молекулярного патогенеза TDP43-протеинопатий и позволяет оптимизировать разработку лекарственных препаратов патофизиологической терапии форм ФТЛД с нарушенным метаболизмом белка TDP43. Так, впервые показано, что соединения группы гамма-карболинов (Димебон и два его фторированных производных) способны эффективно подавлять формирование цитоплазматических включений амилоидного типа, сформированных укороченной патогенной формой Т5. Это указывает на возможный механизм ингибирующего прогрессию протеинопатии эффекта Димебона. Впервые показано, что Димебон способен активировать аутофагосомную систему, осуществляющую удаление продуктов поздних стадий каскада белковой агрегации, регулируя экспрессию генов atg5 и atg16. При этом Димебон стимулирует фосфорилированиe ERK1/2 и p38 киназ, которые вовлечены в механизм регуляции аутофагосомной системы, что является первым указанием на непосредственные киназные пути, регулируемые гамма-карболинами при коррекции протеинопатий.
Таким образом, полученные в ходе выполнения диссертационной работы данные по изучению механизма нейропротекторного действия производных гамма-карболинов открывают новое направление в биомедицинской химии по оптимизации соединений этого класса для нужд патофизиологической терапии TDP43-протеинопатий. Созданная клеточная модель является простой и удобной для тестирования и отбора разрабатываемых лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту.
-
Модифицирована структура белка TDP43 и получена его патогенная форма с высокими агрегационными свойствами, формирующая цитоплазматические депозиты, аналогичные патогистологическим включениям, обнаруживаемых у больных с ФТЛД и БАС.
-
В клеточной модели TDP43-протеинопатии нейропротекторный препарат Димебон и два его новых производных способны эффективно ингибировать агрегацию патогенной формы TDP43 – важную составляющую патогенеза ФТЛД и БАС.
-
Ингибирующее TDP43-протеинопатию действие Димебона осуществляется через активацию аутофагосомной системы.
-
Гамма-карболины (Димебон и его исследованные производные) могут рассматриваться в качестве перспективных соединений для разработки на их основе методов патофизиологической терапии TDP43-протеинопатий.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и конгрессах: The EMBO Meeting 2010, September 3-7, 2010, Barcelona, Spain; Ежегодных конференциях «Фундаментальные науки – медицине», Россия, Москва 2010 и 2012; 10th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's Diseases 2011, March 6-10, Barcelona, Spain); 8th IBRO World Congress of Neuroscience 2011, July 14-18, Florence, Italy; Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» 2011, 18-22 апреля, Пущино, Россия; Международной конференции «Эффективные инструменты современной науки - 2012», April 27 – May 5, Prague, Czech Republic; XIX Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2013» 10-11 апреля, Санкт-Петербург, Россия, С. 128-130.
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (11) и иностранных языках (124). Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и 25 рисунков.
Системы контролируемой деградации белков - потенциальные мишени для разработки патофизиологической терапии
Системы контролируемой деградации белков играют важную роль как в поддержании нормального внутриклеточного гомеостаза, так и выполняют функцию очистки от поврежденных, аберантных и неверно модифицированных форм белков, которые могут представлять опасность для метаболизма или инициировать патогенную агрегацию. Аутофагия является одним из основных путей контролируемой деградации склонных к агрегации и потенциально амилоидогенных цитоплазматических белков.
Принимая во внимание тот факт, что убиквитин-протеасомная система (УПС) не может утилизировать промежуточные продукты белковой агрегации, размеры которых достигли критически допустимых для деградации в УПС, роль аутофагосомной системы в процессах очистки внутриклеточного пространсатва от токсичных продуктов агрегации белков и пептидов при нейродегенеративных заболеваниях трудно переоценить. Подавляющее большинство растворимых промежуточных продуктов патогенной агрегации белков токсичны, и неспособность клетки эффективно от них избавляться часто является причиной развития протеинопатий, таких как Б А, БП, БРТЛ, БДН и ряд других НДЗ. При ряде форм перечисленных заболеваний именно нарушение работы аутофагосомной системы лежит в основе их молекулярного патогенеза. Именно поэтому исследование тонких механизмов патогенетических и патофизиологических изменений, имеющих место при прогресии протеинопатий, позволит выявить молекулярные мишени для создания соединений, способных направленно активировать и корректировать работу аутофагосомной системы [59]. Эта задача остро стоит в программе разработки новых лекарственных средств для нужд патофизиологической терапии, а, ее решение позволит наметить стратегию лечения целого спектра распространенных нейродегенеративных заболеваний, относящихся к группе протеинопатий.
Аутофагия - это сложный высококонсервативный механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза, посредством деградации долгоживущих или склонных к агрегации белков и поврежденных органелл, характерный как для про-, так и для эукариот. Активировать аутофагию могут такие процессы, как клеточное голодание, стресс, сигналы от поврежденных органелл. Особо важное значение в эволюции аутофагия приобрела в нервной системе долгоживущих животных, поскольку в постнатальном периоде нейрогенез крайне ограничен.
По способу доставки субстрата к лизосомам выделяют три вида аутофагии: 1. Микроаутофагией называют перенос цитоплазматических компонентов в лизосому путём непосредственной инвагинации лизосомальной мембраны, без формирования промежуточных везикул [72]. 2. Макроаутофагия: процесс макроаутофагии сопровождается формированием двумембранной структуры, которая называется аутофагосомой, вокруг участка цитоплазмы, содержащей материал, подлежащий перевариванию, который затем доставляется в лизосому [62]. И хотя макроаутофагия может быть селективной (например, уничтожение поврежденных митохондрий), деградация растворимых цитоплазматических белков является неспецифической [30; 68]. 3. Шаперон-опосредованная аутофагия характеризуется специфичностью перевариваемого субстрата (цитоплазматические белки) [41].
Необходимо присутствие в белке-субстрате пентапептидной аминокислотной последовательности, такой как LysPheGluArgGln. Цитоплазматический шаперон HSC70 присоединяется к белку, и пентапептид субстратного белка распознается LAMP2A, лизосомальным рецептором шаперон-опосредованной аутофагии. Затем белок разворачивается, и перемещается в полость лизосомы, где переваривается (Рис.2).
Для деградации патогенных фибриллярных белковых структур наибольшее значение имеет макроаутофагия, поскольку дефекты именно макроаутофагии часто являются причиной наследственных НДЗ. С другой стороны, считается, что активация неповрежденной макроаутофагосомной системы в случае спорадических форм НДЗ может ингибировать процесс формирования патогенных включений [73] и замедлять прогрессию протеинопатии. Именно поэтому все компонеты этой сложной системы рассматриваются в настоящее время как наиболее перспективные молекулярные мишени при разработке препаратов для патофизиологической терапии протеинопатии [95].
Роль аутофагии в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний
Одним из главных механизмов когнитивно-стимулирующего действия Димебона является способность блокировать активность одного вида ионотропных глутаматных рецепторов (NMDA-подтип) и потенциировать активность другого (АМРА-подтип) [40; 135]. Было показано, что Димебон обладает выраженными нейропротектными свойствами и в клинических испытаниях показал наилучший, из всех имеющихся на сегодняшний момент препаратов, терапевтический эффект при лечении БА. Однако механизм действия данного препарата до сих пор неизвестен. К настоящему времени установлено, что система глутаматных рецепторов в ЦНС играет ключевую роль как в механизмах формирования памяти и когнитивных функций, так и, с другой стороны в осуществлении нейродегенеративных процессов [34; 90]. Важнейшее значение при этом имеют ионотропные глутаматные рецепторы, непосредственно связанные с ионными каналами, в частности, NMDA- и АМРА-подтипы рецептора. Считается что активация АМРА-рецепторов эндогенным глутаматом приводит к деполяризации постсинаптической мембраны и снятию магниевого блока с ионного канала, связанного с NMDA-рецепторами, что в итоге обеспечивает возможность передачи синаптического сигнала [63]. В то же время гиперактивация NMDA-рецепторов приводит к избыточному входу ионов кальция в нервную клетку и запускает процессы некроза и, возможно, апоптоза [36].
При нейродегенеративных заболеваниях, таких как БА, наблюдается нарушение процессов обратного захвата нейромедиаторного глутамата и дегенерация нейронов, что приводит, с одной стороны, к увеличению спонтанного «шумового» сигнала в синапсе, а с другой - к снижению «полезного» синаптического сигнала, передающего смысловую информацию. Вследствие этого полезный сигнал теряется на фоне «шума» и происходит ухудшение когнитивных функций. С целью коррекции этого нарушения были предложены низкоаффинные антагонисты NMDA-рецепторов (в частности, препарат мемантин), снижающие «шумовой» сигнал [80-81], а также позитивные модуляторы АМРА-рецепторов (ампакины), увеличивающие амплитуду синаптического сигнала [75-76]. Было установлено, что такой «бинарный» механизм действия лежит в основе нейропротекторного и когнитивно-стимулирующего действия отечественного препарата Димебон [40; 71]. Именно этот «бинарный» механизм действия лежит, очевидно, в основе нейропротекторного и когнитивно-стимулирующего действия Димебона [40], разработанного в качестве лекарства для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний (US Patent 6,187,785 Bl; European Patent 0 876 818 Bl) [135]. Одним из главных механизмов когнитивно-стимулирующего действия Димебона является способность блокировать активность одного вида ионотропных глутаматных рецепторов (NMDA-подтип) и потенцировать активность другого (АМРА-подтип) [40].
Исследования, проведённые в ИФАВ РАН, показали, что Димебон проявляет способность блокировать активность одного вида ионотропных глутаматных рецепторов (NMDA-подтип) и потенцировать активность другого (АМРА-подтип), что может быть основой его когнитивно-стимулирующего действия. В то же время, в экспериментах на культурах нейронов коры мозга и гранулярных нейронах мозжечка было показано, что димебон защищает культивируемые нейроны не только от глутаматнои эксайтотоксичности, но и от (З-амилоид-индуцированной гибели нейронов [15]. Нейропротекторное действие Димебона, по-видимому, обусловлено его взаимодействием с митохондриями: нами было показано, что Димебон снижает чувствительность митохондрий к индукции процесса скачка митохондриальной проницаемости (MPT - mitochondrial permeability transition). Этот процесс обусловлен открытием неспецифических митохондриальных пор и является ключевым этапом запуска каскадов клеточной гибели. Также Димебон проявляет антиоксидантный эффект, предотвращая перекисное окисление липидов в митохондриях [17]. Есть предположение, что такое сочетание активностей в отношении наиболее значимых мишеней для заместительной и нейропротекторной терапии, является основой успешности Димебона в клинических испытаниях на пациентах с БА во 2-й фазе, которые показали, что Димебон способен не только задерживать развитие заболевания, но и улучшать состояние когнитивных функций больных по сравнению с уровнем на начало испытаний, что делает его одним из наиболее перспективных препаратов для лечения подобных патологий [35].
Положительный эффект действия Димебона при лечении БА может быть связан с его не только нейропротекторными свойствами, а также способностью проявлять когнитивно-стимулирующие свойства, которые в свою очередь связанны со входом Са2+ в нейроны. Важно отметить, что особое внимание привлекает действие димебона на глутаматные рецепторы ЦНС [40]. Недавние исследования по исследования механизма действия Димебона на AMP А- и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга показали, что в нейронах Пуркинье мозжечка крыс димебон имеет бимодальное действие на потенциацию активности АМРА-рецепторов и блокирование NMDA-рецепторов [40].
Микроскопический и иммуно-цитохимический анализ
В работах М. Hasegawa впервые было показано, что Димебон способен ингибировать образование цитоплазматических агрегатов белка TDP43 [123], вовлеченного в патогенез ряда форм фронто-темпоральной деменции. Однако молекулярный механизм и непосредственные мишени его действия не были выявлены. Тот факт, что Димебон способен ингибировать протеинопатию, вызванную абсолютно различающимися по своим свойствам склонными к агрегации белками, позволяет предположить, что его действие скорее всего направлено на общие защитные механизмы и не зависит от типа потенциально-амилоидогенного белка.
Нами была разработана клеточная модель для анализа действия нейропротекторных препаратов на прогрессию протеинопатии, обусловленную агрегацией белка TDP43. Т5 патогенная форма, отобранная по результатам исследований, которые описаны в предыдущей главе, наиболее адекватно воспроизводила в клетках нейробластомы человека молекулярно-клеточную патологию, выявляемую при патогистологическом анализе препаратов больных с рядом форм ФТЛД и БАС, характеризующихся присутствием TDP43-реактивных патогистологических включений. Следует отметить, что в образовании этих включений важная роль отводится укороченным аберрантным формам TDP43, поскольку такие формы белка размером 25 к Да детектированы различными методами в биологическом материале больных, наряду с нормальным полноразмерным белком размером 43 кДа, причем именно 25 кДа форма присутствует в агрегированном состоянии [50]. Поэтому созданная нами модельная система оптимизирована для поиска и тестирования соединений, способных ингибировать процесс образования TDP43-реактивных включений, содержащих укороченные патогенные формы. Для разработки методов патогенетической терапии ТОР43-протеинопатий необходимы именно такие модельные системы.
Культура клеток нейробластомы человека SH-SY5Y была транзиторно трансфецирована плазмидной конструкцией Т5, обеспечивающей синтез флюоресцентно меченого (GFP), укороченного белка TDP43, который агрегировал и накапливался в цитоплазме. В культуральную среду добавляли различные водорастворимые соединения, синтезированные с целью создания нейропротекторных препаратов. Через различные промежутки времени проводился анализ прогрессии ТОР43-протеинопатии, вызванной агрегацией патогенной формы Т5. В качестве препарата сравнения использовался Димебон, эффективность ингибирования процесса образования и/или стабильности патогенных TDP43 агрегатов оценивалась в сравнении с Димебоном.
Прежде чем были выбраны рабочие концентрации соединений DF-203 и DF-213 проводилось исследование их цитотоксичности в используемой культуре клеток SH-SY5Y и сравнение с цититоксичностью Димебона (Рис. 15). В культуральную среду на следующий день после рассева клеток добавляли Димебон в концентрациях 1 мМ, 500мкМ, 250мкМ, 125мкМ, бЗмкМ, ЗІмкМ, 15мкМ, 7,5мкМ, 3,75мкМ, 1,9мкМ. В контроль Димебон не добавляли. Через 24 часа определяли количество жизнеспособных клеток CellTiter-Blue тестом (Promega) согласно инструкции производителя.
Димебон обладает низкой токсичностью [15; 104] в этом его несомненное преимущество, как базового соединения для разработки новых нейропротекторных препаратов. И хотя ранее цитотоксичность Димебона в отношении SH-SY5Y не исследовалась, было ожидаемо, что, как и для абсолютного большинства клеточных культур, Димебон окажется низкотоксичным. Действительно, лишь при концентрациях, превышающих 100 мкМ (Рис. 16) наблюдалась гибель клеток, в то время как в большинстве работ на клеточных культурах оптимальной рабочей концентрацией Димебона является 5 мкМ [104].
Далее по такому же протоколу была исследована цитотоксичность новых производных Димебона DF-203 и DF-213 (Рис. 17 и 18). Результаты этих исследований показали, что цитотоксичность производных Димебона невысока и не отличается существенно от показателей самого Димебона, поэтому в качестве начальной рабочей концентрации для исследований ингибирующего протеинопатию действия всех трех соединений была выбрана такая же, как и для Димебона концентрация - 5мкМ. 63 125 250
Процент выживших клеток, определенный с помощью МТТ, через 24 часа после добавления различных концентраций Димебона. В многочисленных экспериментах по исследованию выживаемости клеточных культур в присутствии Димебона при концентрациях 2-15 мкМ часто отмечался незначительный нейропротекторный эффект, но в наших экспериментах никогда не являлся статистически достоверным. Интересно, что для соединения DF-203 также часто наблюдался такого рода эффект (Рис. 17), хотя и гораздо менее выраженный, чем был описан другими группами для Димебона в исследованиях на других модельных системах [104; 110].
Поскольку известно, что нейропротекторные препараты в ряде случаев способны стимулировать пролиферацию разреженных культур, нами был проведен анализ действия Димебона на пролифрацию клеток SH-SY5Y при различной плотности их засева. Необходимо было выяснить, будет ли Димебон в нашей системе при используемой нами концентарции стимулировать пролиферацию при различных условиях культивирования SH-SY5Y клеток.
Для этого засевали на 96-луночные планшеты культуру, чтобы плотность засева соответствовала 2x104 клеток на 1 см2, 1x104, 5x103, 2x103, и 1x103 клеток на 1 см2. Через 24 часа в культуральную среду добавляли Димебон до конечной концентрации 5 мкМ. Через 24, 48, 72 и 96 часов культивирования определяли количество жизнеспособных клеток (Рис. 19).
Димебон не оказывал существенного влияния на пролиферативную активность SH-SY5Y культур, и нами не было выявлено статистически значимых различий в количестве метаболизирующих клеток ни при какой плотности даже после четырех дней культивирования. Таким образом, мы показали, что при анализе действия Димебона на прогрессию протеинопатии составляющая нейропротекторного эффекта препарата, обусловленная описанным некоторыми исследователями его пролиферативным эффектом, не является существенной в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y и не должна учитываться при оценке действия этих соединений на прогрессию TDP43 протеинопатии.
Несомненным преимуществом стабильно перевиваемой нейробластомы человека SH-SY5Y при создании на ее основе клеточных тест-систем для первичного анализа вновь синтезируемых нейропротекторных соединений является способность SH-SY5Y клеток дифференцироваться по нейрональному типу под действием различных факторов [46; 77-78]. Поскольку наша тестовая система включает транзиторную трансфекцию культивируемых клеток патогенными формами TDP43, особенно актуальной является возможность проводить трансфекции на недифференцированных культурах, а затем, стимулируя дифференцировку по нейрональному типу, моделировать протеинопатию уже в дифференцированных нейрональных клетках, так как эффективность трансфекции дифференцированных клеток крайне низкая. С другой стороны, чувствительность различных типов клеток к токсическому действию соединений, особенно обладающих нейроспецифичностью, может оказаться различным [43; 70].
Так, например, в работах Kabashi и соавторов на культурах мышиных мотонейронов была показана токсичность сверхпродукции TDP43 и его мутантных форм для клеток , однако для дифференцированных клеток линий Neuro2A и Cosl подобного токсического эффекта обнаружено не было [49]. Нами было проведено сравнение чувствительности дифференцированных и недифференцированных культур SH-SY5Y к высоким концентрациям Димебона и двух его производных. Стимуляция дифференцировки SH-SY5Y проводилась с помощью ретиноевой кислоты, которую добавляли в культуральную среду до конечной концентрации Юмкл и культивировали в течение 24 часов. Для всех трех соединений было показано, что они менее токсичны в высоких концентрациях для дифференцированных по
Влияние Димебона и его производных на прогрессию протеинопатии в клеточных культурах
Поскольку данные целого ряда работ говорят о влиянии Димебона на функциональное состояние митохондрий [126], нами был исследован IRGM - белок, являщийся ГТФазой (М). IRGM способен проникать в митохондрии и активировать процесс их деления, он также участвует в иммунном (врожденном) ответе, опосредованном митохондриями и запускает аутофагию [102].
Наши данные, полученные анализом уровня мРНК IRGM, показали, что экспрессия этого гена в клетках SH-SY5Y при добавлении Димебона также статистически достоверно повышалась и достигла максимума через 30 минут (Рис. 24), что хорошо согласуется с пиком фосфорилирования киназы р38 (Рис. 25). Через 90 минут уровень экспрессии возвращался к исходному уровню.
Достоверные различия в сравнении с базовым уровнем, уровень значимости р 0.05, применяемые критерии: критерий Стьюдента (t тест). Параллельно проводили изучение эффекта Димебона на регуляцию МАП киназ, в первую очередь, ERK1/2 и р38. Фосфорилирование ERK1/2, являющееся необходимым условием активации киназы, может служить индикатором пролиферативной активности и устойчивости клетки к апоптозу, прежде всего путём запуска аутофагии [134]. В то же время р38 является важным посредником стрессового ответа, но ее вклад в регуляцию автофагии неоднозначен. Недавние исследования показали, что несмотря на то, что р38 и ERK1/2 могут быть активированы одновременно, р38 способна ингибировать аутофагию, вызванную активацией ERK1/2 [30].
Исследование влияния Димебона на уровень синтеза ERK1/2 и р38 киназ проводили в культуре клеток нейробластомы человека SH SY5Y. Через 24 часа после посева в питательную среду добавляли Димебон до конечной концентрации 10 мкМ и инкубировали культуры в течение 30 минут, 1 часа, 2 часов или 6 часов.
Далее клетки промывали на льду холодным фосфатно-солевым буфером, снимали механически, осаждали центрифугированием, получали препараты тотального белка, и змеряли относительное содержание исследуемых белков методом иммуноблотинга, как описано в разделе Материалы и Методы.
Проведенный анализ показал, что в присутствие Димебона происходит быстрое повышение содержания фосфорилированнных форм киназ ERK1/2 и р38 (Рис. 25). Максимальный уровень фосфорилирования и для р38, и для ERK1/2 киназ наблюдался через phospho-Erk1/2
Анализ уровня фюсфорилирования Erkl/2 и р38 в клеточной линии SH-SY5Y методом иммуноблоттинга минут после добавления Димебона. Несмотря на то, что интенсивность сигнала фосфо-ERK затем начинала снижаться, она продолжала оставаться выше базового уровня даже через 6 часов после добавления препарата (Рис. 25). Известно, что кратковременное фосфорилирование ERK является необходимым условием активации процессов аутофагии, однако продолжительная и повышенная активация ERK пути может блокировать созревание аутофагосом и накопление в цитоплазме незрелых аутофагосомных форм, что, в свою очередь, вызывает активацию других регуляторных защитных систем в терминально дифференцированных клетках [31]. Изменение уровня фосфорилирования в клеточных культурах, обработанных Димебоном, происходило сходным образом. Так, уже через 30 минут после добавления препарата наблюдался максимальный уровень фосфорилирования р38, который существенно превышал базовый уровень. Однако, в отличие от ERK1/2, активация р38 была кратковременной и после 60 минут экспозиции уровень фосфорилирования данной киназы возвращался к начальным значениям, а при более длительной обработке клеточных культур Димебоном (2 часа и 6 часов), фосфорилирование р38 киназы подавлялось и становилось ниже изначального базового уровня (Рис. 25). Эти данные указавают на то, что Димебон не только вызывает кратковременную стимуляцию фосфорилирования ERK1/2 и р38 в клетках нейробластомы человека, но также может стимулировать длительные эффекты: стабильно повышать уровень фосфорилирования ERK1/2 и, по видимому, после кратковременного повышения ингибировать фосфорилирование р38. Поскольку и ERK1/2 и р38 вовлечены в механизм регуляции аутофагосомной системы, и стимуляция ERK активирует аутофагию, а сопутствующее фосфорилирование р38 блокирует ассоциированную с аутофагией вакуолизацию [30], способность Димебона влиять на уровень фосфорилирования этих киназ может быть косвенным указанием на потенциальные свойства Димебона модулировать активность компонентов аутофагосомной системы, которая является центральным защитным механизмом в зрелых нейронах от накопления токсичных агрегатов и включений, формируемых амилоидогенными белками. Стабильная и продолжительная активация р38 часто ассоциирована со стресс-индуцированным апоптозом, в то время как аутофагия, наоборот, рассматривается как важный механизм, обеспечивающий выживаемость клетки в неблагоприятных и даже патологических условиях [134].
Резкий подъем уровня фосфорилирования ERK1/2 в обработанных Димебоном культурах SH-SY5Y сопровождался повышением транскрипционной активности маркеров аутофагии, в частности, исследованных нами ATG5, ATG12 и ATG16 - принципиальных компонентов убиквитинподобной конъюгирующей структуры (Рис. 22) Таким образом, наши данные показывают, что Димебон стимулирует аутофагию в клеточных культурах. Эти данные подтверждены в работах других исследователей [24; 105; ПО].
