Введение к работе
Актуальность темы исследования определена, во-первых, тем, что в мире наблюдается огромный интерес к протеомике со стороны биомедицины как для раннего обнаружения и мониторинга болезней, так и для разработки более эффективных методов лечения на основе лучшего понимания патогенеза. В последние годы технологии для идентификации протеома значительно усовершенствовались благодаря большей чувствительности и специфичности аналитических методов, использующихся в них. Кроме того, компьютерные технологии, применяемые для анализа протеома, стали более мощными, появились биоинформатические инструменты, благодаря которым стало возможным извлечение максимального количества информации из исследуемых образцов. Данные технологии позволяют выбрать белковые биомаркеры, ассоциированные с заболеваниями.
Во-вторых, протеомика позволяет провести тщательный анализ белков в области атеросклеротической сосудистой ткани и обнаружить виды белков, которые участвуют в сосудистом ремоделировании и атерогенезе. Идентификация человеческого атеросклеротического протеома будет служить фундаментом для дальнейших исследований, помогая построить и проверить новые гипотезы.
В-третьих, проведенные клинические исследования показывают, что недифференцированные клетки, циркулирующие в кровотоке, имеют огромный потенциал для регенерации сосудистой ткани (Kocher A.A. et al., 2001; Sata M., 2003). Они патрулируют организм и стекаются к месту, где обнаруживают повреждение сосуда. Появляются и новые данные об участии стволовых клеток как гемопоэтической, так и стромальной линий дифференцировки, в атерогенезе (Габбасов З.А., Соболева Э.Л., 2005; Репин В.С., Сабурина И.Н., 2007; Габбасов З.А., Козлов С.Г., 2011; Liumbruno G.M., 2008). Эти данные позволили предположить, что важным моментом в развитии атеросклероза является проникновение колониеобразующих стволовых клеток в интиму в местах концентрации липидов. Протеом большинства таких клеток к настоящему времени изучен недостаточно и малоизвестной остается его связь с патологическими состояниями сосудов. Видимо, перспективен и поиск подходов к стимуляции регенеративно-индукционных свойств гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), возрастает интерес к потенциальному использованию пуповинной крови в качестве источника стволовых клеток для лечения ряда заболеваний.
В этой связи целью диссертационного исследования стали как расшифровка, на основе усовершенствованного протеомного анализа, белковых профилей ГСК из пуповинной крови, так и выявление ассоциации между атеросклеротическими поражениями и протеомными профилями интимы и медии аорты человека для понимания потенциальных возможностей использования ГСК в терапии сосудистых патологий.
В соответствии с данной целью в работе решаются следующие задачи:
1. Оптимизировать алгоритм протеомного анализа, то есть создать единую схему исследования белковых профилей, которая упрощала бы сравнение данных, полученных на таких разных объектах, как остеобласты, мононуклеарные клетки (МНК), CD34+ ГСК и интимо-медиальный слой аорты человека.
2. Изучить с помощью протеомики поведение белков остеобластов, являющихся важным компонентом ниши ГСК и изменяющихся под действием паратиреоидного гормона.
3. Провести идентификацию белков, присутствующих в МНК, CD34+ ГСК, а также нормальных и атеросклеротических тканях аорты.
4. Сравнить протеомные профили ГСК из пуповинной крови, интимы и медии сосудов в процессе атерогенеза. Выявить белки, уровни которых изменяются при развитии атеросклеротического поражения в интимо-медиальном слое аорты человека.
Объектами исследования были избраны гемопоэтические стволовые клетки, в основном это были МНК, популяция клеток CD34+ГСК, очищенных и выделенных из образцов пуповинной крови, остеобласты, а также белки из интимы аорты человека и белки из медии участков аорты человека как не пораженных атеросклерозом, так и соответствующих различным видам атеросклеротических поражений.
Научная новизна диссертации. Уточнены данные о белках, выделенных из атеросклеротических бляшек и претерпевающих изменение в артериальных интиме и медии при развитии атеросклеротических поражений. Идентифицированы многие белки ГСК из пуповинной крови с учетом их внутриклеточной локализации, а также протеом остеобластов в динамике. Поэтому полученные нами результаты имеют высокую степень новизны.
Диссертация включает разработку оригинального методического подхода к выявлению белковых профилей ГСК, артериальной интимы и медии на ранее недостижимом уровне, позволяющем лучше понять их сложную природу.
Теоретическая и практическая значимость работы выражается в создании научно-технического задела, открывающего потенциальные возможности использования ГСК в терапии атеросклероза. Белки, изменение содержания которых обнаружено при развитии патологии, могут сопоставляться с белками ГСК и остеобластов, а также рассматриваться как биомаркеры для диагностики предрасположенности к атеросклерозу, что способствует переходу к персонализированной медицине.
Усовершенствованный метод подготовки стволовых клеток к автоматизированному протеомному анализу может использоваться в клиниках соответствующего профиля.
На защиту выносятся следующие основные научные результаты, раскрывающие конкретный личный вклад соискателя в разработку данной проблематики.
1. Усовершенствованный метод – комбинация 2D электрофореза с фракционированием клеточных органелл, позволяющий не только провести протеомный анализ клеток, но и получить информацию о внутриклеточной локализации идентифицированных белков. Метод отличается воспроизводимостью и возможностью количественной оценки результатов, большинство его стадий автоматизировано.
2. В экспериментах на остеобластах подтверждено, что алгоритм протеомного анализа оптимизирован. Он может применяться для наблюдения за динамикой изменения белков в ответ на внешние воздействия, в том числе на влияние факторов костного мозга, т.е. гемопоэтической клеточной ниши СК. Это, в свою очередь, даст возможность проводить экспансию ГСК в условиях in vitro.
3. Описан протеомный профиль МНК и CD34+ГСК с высоким разрешением, то есть сделан очередной шаг в построении глобального протеомного профиля мононуклеарных клеток и CD34+ ГСК.
4. Проведен двумерный электрофорез белков из интимы и медии аорты, получены протеомные профили различных видов атеросклеротических поражений (жировая инфильтрация, жировая полоса, липофиброзная бляшка, фиброзная бляшка) в сравнении с непораженными атеросклерозом участками. Обнаружены белковые пятна, проявляющие различия при сравнении протеомных профилей, подлежащих под непораженными участками интимы и медии и под липофиброзными бляшками. Предпринята попытка идентификации этих белков с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.
5. Подтверждена роль в формировании атеросклеротической бляшки таких низкомолекулярных белков, как аннексины и белки теплового шока.
Апробация работы. Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: на V и VI международных телеконференциях «Фундаментальные науки и практика», Томск, 2010 и 2011 гг., 9-й Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2010 г., British Society of Proteomics (BSPR) Meeting, Cambridge, UK, 2005 г. и 2006 г. и др.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, включая 3 статьи в профильных рецензируемых российских журналах, включенных в перечень ВАК (из них 1 – в зарубежной печати), 5 статей в сборниках на основе докладов, сделанных на конференциях и симпозиумах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 4 таблицы и 30 рисунков.
