Введение к работе
Актуальность темы. В основе многих патологических состояний лежит нарушение структуры кровеносной системы (Chappell J.С, Bautch V.L., 2010). Сосудистая сеть млекопитающих динамически перестраивается в течение всего онтогенеза в соответствии с потребностями окружающих тканей. Основными механизмами образования и роста кровеносных сосудов являются ангиогенез и васкулогенез. Васкулогенез — это сборка капилляров из отдельных разрозненных эндотелиальных прогениторов (ЭП), одновременно собирающихся в единую систему in vivo или in vitro. В отличие от васкулогенеза, при ангиогенезе эндотелиальные прогениторы направленно мигрируют из терминалей капилляров, формируя новый тяж (cord) вслед за ведущими клетками (tip cells). Изучение клеточных механизмов ангио- и васкулогенеза in vivo и in vitro позволило идентифицировать две субпопуляции ЭП: «ранние» ЭП (CD133+/CD34+/VEGF+ клетки) и «поздние» ЭП (CD31+/ Flk-l+/vWF+ клетки). Введение поздних ЭП в ишемизированные ткани (Asahara Т., 2007, Kim Н. et al., 2010), в сердечную мышцу при инфаркте миокарда (Jujo К. et al., 2008, Chong J.J., 2012) и в ткань печени при хронической недостаточности (Ueno Т. et al., 2006) приводило к восстановлению кровоснабжения и усилению регенерации. Регенерация печени сопровождалась снижением фиброза. Однако клиническое применение ауто-ЭП лимитировано их малым количеством в циркулирующей крови: 2-3 ЭП/мл (Asahara Т. et al. 1997). Поэтому за последнее десятилетие возрос интерес к искусственному получению ЭП из доступных резервов, прежде всего из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) взрослых тканей. Было показано, что первичная культура ММСК, выделенная из Вартонова студня пупочного канатика (ПК), обогащена ранними ЭП в большей степени, чем аспират костного мозга взрослого организма (Wang W. et al., 2009, Semenov O.V., Brayman С, 2011). Добавление в ростовую среду VEGF индуцировало образование в 2D культуре ММСК ПК поздних CD31+/vWF+ ЭП (Chen M.Y. et al., 2009, Dai N. et al., 2012). Несмотря на то, что пупочный канатик является универсальным источником низкодифференцированных клеток различного фенотипа (Pelosi Е. et al., 2012), в 2D культуре не удается моделировать развитие ранних и поздних ЭП. Условия 3D культивирования лучше моделируют структуры нативной ткани и полноценный морфогенез. Однако до сих пор нет адекватных моделей васкуло- и ангиогенеза в 3D культуре ММСК, механизмы этих процессов остаются неизученными, так как исследования в этой области проводились в основном на эмбриональных ангиобластах (Jakobsson L. et al., 2007).
Цель исследования. Изучить индуцированные VEGF ангиогенные и васкулогенные характеристики ММСК ПК в 3D культуре. Задачи исследования:
-
Получить и охарактеризовать стандартное сырье - клонированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки пупочного канатика (ММСК ПК).
-
Разработать и стандартизовать методику серийного масштабирования жизнеспособных аваскулярных и васкуляризованных 3D мезеносфероидов из стандартного 2D сырья.
-
Изучить 3D динамику сфероидообразования ММСК ПК. Сравнить распределение экспрессии в 2D и 3D культуре эпителиальных и мезенхимных маркеров, оценить пролиферативный потенциал клеток сфероида, исследовать структурные изменения на клеточном и ультраструктурном уровне.
-
Исследовать экспрессию маркеров ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток в аваскулярных и васкуляризованных сфероидах ММСК ПК.
-
Осуществить 3D скрининг VEGF-индуцированных сфероидов ММСК ПК к капиллярогенезу в ЗО-матригеле.
-
Проверить возможность образования васкуляризованной микроткани при слиянии мезеносфероидов.
-
Исследовать поведение поздних ЭП из 3D культуры ММСК ПК при патологическом процессе на модели хронической печеночной недостаточности крыс.
Научная новизна. Работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые было осуществлено серийное масштабирование аваскулярных (неиндуцированных) и васкуляризованных (VEGF-индуцированных) мезеносфероидов из стандартного 2D сырья -клонированной культуры ММСК ПК.
Были впервые исследованы пластичность и перераспределение экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров в клетках сфероидов ММСК ПК. Впервые были выявлены ранние ЭП в аваскулярных мезеносфероидах. Впервые показано, что VEGF индуцировал появление в 3D культуре ММСК ПК поздних ЭП, способных к образованию люменов внутри сфероида и тубулоподобных структур в окружающем матриксе при помещении в матригель.
Предложена оригинальная методика получения васкуляризованной микроткани путем слияния индуцированных мезеносфероидов с образованием единой капиллярной сети. Впервые показано, что трансплантированные в составе сфероида поздние ЭП выживали в поврежденной ксеногенной печени без
иммуносупрессии, встраивались в стенки сосудов реципиента и сохраняли экспрессию маркера ЭП.
Теоретическая н практическая значимость. Разработан метод получения неограниченного числа аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов из стандартного источника — ММСК ПК. Было показано, что клонированная культура ММСК ПК способна к сфероидообразованию с включением в новообразующийся сфероид практически всех клеток в 3D системе. Предложенный метод позволяет получить максимально возможное количество идентичных мезеносфероидов с минимальными потерями исходного числа клеток. Было установлено, что сфероидообразование ММСК ПК всегда сопровождается ламинацией сфероида на две функциональные зоны, ультраструктурными изменениями и перераспределением паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров. Нестин+, цитокератин 19+ эпителиоподобные клетки располагались на поверхности сфероидов, тогда как коллаген IV+ округлые клетки были сосредоточены в центральной части, но все клетки сфероида сохраняли экспрессию виментина, цитокератина 18 и ламинина. Были выявлены ранние и поздние ЭП в 3D культуре ММСК ПК. Продемонстрирована новая клеточная модель васкулогенеза и ангиогенеза из одного типа клеток. Появление поздних ЭП было связано с влиянием VEGF и сопровождалось образованием люменов и тубулоподобных структур в матригеле. Установлено, что сфероиды ММСК ПК способны к неограниченному слиянию с увеличением плотности клеток в объединенном сфероиде. Слияние васкуляризованных сфероидов приводило к сегрегации CD31+ клеток с образованием единой капиллярной сети. Интеграция с тканями реципиента и сохранение экспрессии специфического маркера свидетельствовали о способности поздних ЭП из сфероидов ММСК ПК к участию в регенерации сосудистой сети поврежденной печени крыс. Разработанный метод получения васкуляризованных мезеносфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Культивирование сфероидов ММСК ПК на агарозных планшетах позволяет с малыми трудозатратами получать из стандартного 2D сырья большие (достаточные для клинических трансплантаций) количества сфероидов.
-
ММСК ПК при сфероидообразовании разделяются на две популяции: нестин+/цитокератин19+ и нестин-/коллаген IV+ клетки. Популяции отличаются не только иммуноцитохимическими, но и ультраструктурными особенностями.
-
При 3D культивировании ММСК ПК происходит спонтанная дифференцировка в эндотелиальном направлении, сопровождающаяся новообразованием ранних ЭП. Добавление индукционного фактора VEGF стимулирует появление поздних ЭП, формирующих люмены внутри
сфероида и тубулоподобные структуры в матригеле. При слиянии большого
числа сфероидов, в новообразованной ткани развивается внутренняя
сосудистая сеть. 4. Локальное введение васкуляризованных сфероидов в ткань поврежденной
печени крыс приводит к интеграции поздних ЭП с тканями реципиента и их
участию в регенерации сосудистой сети.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (2009г, Москва); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (2009г, Москва); IX «High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (20 Юг, Benidorm, Spain); X «High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (2011г, Benidorm, Spain); 8th Swiss experimental surgery symposium "Animal Models for Organogenesis" (2012r, Geneva, Switzerland); 5 Всероссийский симпозиум с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (2012г, Уфа); 47th Annual Congress of the European Society for Surgical Research (2012r, Lille, France); 4th Expert Meeting Mesenchymal Stem Cells in Solid Organ Transplantation MISOT (2012r. Barselona, Spain).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 8 тезисов докладов на международных конференциях, 2 статьи в научно-практических медицинских журналах и 3 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы включает 156 источников.
