Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Современный взгляд на механизм регенерации костной ткани
Использование трансплантатов при восстановлении костных дефектов альвеолярных отростков верхней и нижней аутологичных 29
челюстей
Тканевая инженерия с использованием стромальных клеток из жировой альвеолярного части нижней
Материал и методы исследования
Методы восстановления объема кости отростка верхней челюсти и альвеолярной челюсти
Материалы, используемые в качестве носителей аутологичных стромальных клеток из жировой ткани
Метод выделение и культивирование СКЖТ
Получения первичной культуры СКЖТ человека
Подготовки аутологичной сыворотки крови пациента
Сравнительная оценка пролиферации клеток СКЖТ при культивировании с использованием сред AdvanceSTEM и DMEM, фетальной бычьей сыворотки и аутологичной сыворотки крови пациента проточной
Метод цитофлуориметрического исследовани
Оценка уровня апоптоза методом клеточных цитофлуориметрии.
Характеристика экспрессии поверхностных маркеров СКЖТ методом цитофлуориметри
Метод оценки мультипотентности и пролиферативного потенциала выделяемой и культивируемой популяцииаутологичных СКЖТ
Доказательство мультипотентных свойств выделяемой и культивируемой популяции аутологичных СКЖТ
Оценка способности СКЖТ, дифференцированных в
остеогенном направлении культивированных с использованием сред разного состава, к остеогенной дифференцировке, и их пролиферативной активности.
Подготовка тканеинженерных конструкций к трансплантации
Метод гистологического анализа биопсий
Метод иммуногистохимического анализа биопсий
Метод морфометрии костной ткани
Метод дентальной объемной томографии (ДОТ)
Глава 3. Результаты и обсуждение лабораторных исследований.
Фенотипические и функциональные характеристики СКЖТ. Создание тканеинженерных конструкций.
3.1 Сравнение пролиферативной активности СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM или DMEM в присутствии аутологичной сыворотки или 10% фетальной бычьей сыворотки .
3.2 Оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла.
3.3 Характеристика экспрессии поверхностных клеточных маркеров СКЖТ методом проточной цитофлуориметрии.
3.4 Оценка мультипотентных свойств СКЖТ при культивировании с использованием AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой.
3.5 Оценка пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани в условиях индукции остеогенной дифференцировки при культивировании в среде AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой
3.6 Анализ способности СКЖТ адгезировать на «КоллапАн-Г» и ГАП. Создание тканеинженерных конструкций
Глава 4. Результаты пилотного клинического исследования.
4.1 Обзор клинического материала по результатам лечения
пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей с использованием тканеинженерных конструкций на основании СКЖТ и остеогенных носителей.
4.2 Результаты клинического исследования введения тканеинженерных конструкций при лечении пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных отростков верхних челюстей.
4.3 Результаты клинического исследования введения тканеинженерных конструкций при лечении пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных частей нижних челюстей .
Гистологический анализ биопсий. Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Использование трансплантатов при восстановлении костных дефектов альвеолярных отростков верхней и нижней аутологичных
- Метод выделение и культивирование СКЖТ
- Сравнение пролиферативной активности СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM или DMEM в присутствии аутологичной сыворотки или 10% фетальной бычьей сыворотки
- Результаты клинического исследования введения тканеинженерных конструкций при лечении пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных частей нижних челюстей
Введение к работе
Актуальность исследования. Актуальной проблемой стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является поиск наиболее эффективных средств и методов костной пластики, создающих оптимальные условия для репаратив-ного остеогенеза.
При восстановлении костного дефекта большое значение имеет дистантный тип костеобразования, заключающийся в пролиферации и остеоген-ной дифференцировке собственных стромальных клеток, формировании клеток остеобластического ряда, образующих костную ткань (А.А.Кулаков, А.С.Григорян, 2007). Поэтому одной из актуальных задач тканевой инженерии в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является создание необходимой массы стромальных клеток, условий для их остеогенной дифферен-цировки и доставки в зону регенерации. В качестве носителя стромальных клеток могут применяться остеопластические материалы, преимущества и недостатки которых хорошо известны, и приведены в многочисленных работах. (Н.А.Плотников, 1967; А.А.Никитин, 2000-2005; О.З.Топольницкий, 2004; А.Ю.Дробышев, 2005; А.И.Воложин и соавт., 1998-2006 и другие.)
Одним из перспективных источников для получения стромальных клеток является жировая ткань. Известно, что в жировой ткани человека сконцентрирована популяция мультипотентных фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения, экспрессирующих маркер стволовых клеток CD34 (Aithaud G. et al., 1992; Stashower M. et al., 1999). Наиболее важным преимуществом стромальных клеток из жировой ткани является то, что они могут быть выделены в большем количестве, с минимальными болезненными ощущениями для пациента. В результате липосакции и последующих обработок удается получить суспензию отдельных клеток, из которых после центрифугирования можно выделить стромальную фракцию (Zuk Р.А. et al., 2002; Rehman J. et al., 2004; Planat-Benard V. et al., 2004). Стромальные клетки из жировой ткани хорошо пролиферируют, что позволяет при относительно небольшом сроке культивирования получить достаточное для транспланта-
ции количество клеток. Вышеперечисленное позволяет предполагать, что использование аутологичных стромальных клеток жировой ткани на носителе способно ускорить образование полноценного костного регенерата, что особенно важно для пациентов со значительными по размеру дефектами.
Цель исследования. Обосновать и разработать технологию создания и применения тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки и остеоиндуктивного носителя для ускорения регенерации костной ткани у пациентов с атрофией и дефектами альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.
Задачи исследования.
-
Разработать методику выделения, культивирования и подготовки к трансплантации аутологичных стромальных клеток из жировой ткани пациентов.
-
Охарактеризовать экспрессию поверхностных маркеров аутологичных стромальных клеток из жировой ткани.
-
Изучить жизнеспособность и способность аутологичных стромальных клеток из жировой ткани к адгезии на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г»).
-
Оценить влияние аутологичных стромальных клеток из жировой ткани на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г») на динамику заживления костного дефекта челюстей у людей.
-
Разработать методику индукции дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани в остеогенном направлении.
-
Исследовать влияние тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с ос-теогенным носителем на морфологию формирующейся костной ткани в динамике при замещении костных дефектов челюстей людей.
-
Разработать алгоритм применения данной методики в клинической практике.
Научная новизна исследования. Впервые разработана методика выделения, культивирования и подготовки к трансплантации стромальных клеток
жировой ткани человека с использованием среды (AdvanceSTEM ) для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Использовали два вида клеток: 1. Стромальные клетки жировой ткани, культивированные в стандартных условиях для получения культуры, обладающей регенеративным потенциалом и способностью стимулировать рост сосудов; 2. Впервые использовали смесь стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, с стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель. Культивированные стромальные клетки жировой ткани в дальнейшем инкубировали в присутствии остеогенных носителей «КоллапАн-Г» или ГАП для создания тканеинженерных конструкций, пригодных для использования в клинике.
Впервые проводилась оценка эффективности применения тканеинженерных конструкций, полученных на основе аутологичных стромальных клеток жировой ткани, выращенных с использованием аутологичной сыворотки крови пациента и остеогенного носителя при восстановлении объема костной ткани у пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.
Практическая значимость работы.
-
Проведенные исследования позволили разработать методику создания и применения тканеинжинерных конструкций на основе стромальных клеток жировой ткани в клинической практике.
-
Доказана, эффективность использования тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» в качестве носителя при замещении костных дефектов челюстей пациентов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Разработана оптимальная методика культивирования стромальных клеток жировой ткани с использованием среды для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток с добавлением аутологич-ной сыворотки крови пациента.
-
Создана и оптимизирована тканеинженерная конструкция на основе стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, и на основе комбинации стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, с стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях.
-
Результаты использования созданных тканеинженерных конструкций в клинике для восстановления объема кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.
Внедрение результатов в практику. Результаты исследования используются для проведения практических занятий и лекций у студентов стоматологического факультета кафедры госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО МГМСУ.
Личный вклад автора в выполнение исследования. Автором лично проведено клиническое обследование 18 пациентов с дефектами кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей, произведен забор подкожной жировой ткани с передней стенки живота методом липосакции.
Автором лично проведено 28 операций по восстановлению альвеолярных отростков/частей верхних и нижних челюстей, забор 72 биопсий костной ткани для гистологического исследования во время установки дентальных имплантатов.
Апробация работы. Работа апробирована и одобрена 1 июля 2011г на межучережденческом заседании кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, ортодонтии и детского протезирования ГБОУ
ВПО МГМСУ минздравсоцразвития России и ГУНУ ФФМ МГУ имени М.ВЛомоносова (протокол №19)
Публикации. Основное содержание диссертационного исследования достаточно полно отражено в автореферате и в 3 работах соискателя, в том числе 1 работа опубликована в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнау-киРФ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результаты и обсуждение лабораторных исследований, результаты и обсуждение клинического исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 171 источников, из которых 68 отечественных и 103 иностранных авторов. Работа содержит 2 таблицы и 48 рисунков.
Использование трансплантатов при восстановлении костных дефектов альвеолярных отростков верхней и нижней аутологичных
«Регенерация (позднелатинское regeneration - возраждение, восстановление) - обновление структур организма в процессе жизнедеятельности и восстановление структур организма, утраченных в результате патологических процессов»
Формирование костной ткани - процесс, который начинается при внутриутробном развитии и продолжается у взрослых людей в форме регенерации и ремоделирования кости.
Физиологическая регенерация - восстановление элементов структуры кости, утраченных в процессе ее жизнедеятельности (структурная перестройка кости). Она происходит в отдельных структурных единицах, остеонах и трабекула, на трех поверхностях кости: периостальной, энд остальной, и в системах гаверсовых каналов. Структурная перестройка необходима для модификации архитектоники костной ткани, контроля и обновления кристаллов гидроксиапатита костного матрикса (Ю.Франке, Г.Рунге, 1995; J.Bukwalter, M.Glimcher, R.Cooper, R.Recker, 1995). Инициаторами структурной перестройки кости являются: 1. изменение функции либо величины нагрузки на кость; (L.Lanyon, C.Rubin, 1984) 2. изменение гормонального фона и содержания кальция в крови (Z.Jaworski, 1981) Физиологическая регенерация кости происходит посредством оппозиционного механизма. Суть его состоит в том, что рост и регенерация костной ткани может происходить только на предварительно резорбированной поверхности. Объясняется это тем, что костный матрикс кальцинируется почти сразу по мере образования, и кость лишена возможности развиваться изнутри (А.Хэм, Д.Кормак, 1983). Поэтому после инициирования структурной перестройки происходит полное или частичное разрушение остеокластами структурных единиц кости. Глубина резорбции составляет до 100 мкм в день, и процесс длиться примерно 10 дней (T.Chambers, 1980). Затем происходит заполнение образовавшегося дефекта остеобластами с последующей минерализацией органического матрикса. Остеогенез, в основе которого лежит оппозиционный механизм роста кости, называется остеокондукцией (M.R.Urist, 1968; 1971; 1997). Разрушение и формирование новой костной ткани тесно связаны между собой. Однако на разных поверхностях кости эти процессы имеют неодинаковый баланс. На переостальной поверхности в течение всей жизни баланс положительный, создание костной ткани доминирует над её разрушением. В компактном слое оба процесса уравновешены. В губчатом слое (особенно после 50 лет) преобладает резорбция, что приводит к увеличению объема костно-мозговых пространств и истончению компактного слоя с внутренней стороны (Р.Сошргоп, 1981; G.Rodan, 1992).
Восстановительная регенерация- восстановление участков кости после травмы, в том числе вследствие хирургического вмешательства.
Инициатором восстановительной регенерации выступает повреждение костной ткани. Для объяснения природы данного процесса было предложено несколько гипотез.
По мнению E.Fukada и I.Yasuda (1957), в основе пускового механизма восстановительной регенерации кости лежат биофизические факторы -эндогенные и электрические сигналы. В качестве аргумента приводится тот факт, что на поверхности образовавшегося дефекта возникает разность потенциалов. При этом костная структурная единица электроположительна, а в зоне дефекта заряд отрицательный. Таким образом, разница потенциалов является возможным сигналом к пролиферации и дифференцированию остеогенных клеток.
A.Caplan (1987) и R. Marx (1994) считают, что пусковой механизм регенерации имеет химическую природу, в основе его лежит изменение кислотно-щелочного баланса в зоне повреждения костных структур. Снижение уровня рН с 7,42 до 6-4 в зоне повреждения кости может служить сигналом к активации белков-остеоиндукторов. Часть из них является гормонами, вызывающими включение генов, отвечающих за пролиферацию стволовых мезенхимальных клеток. Другая часть остеоиндукторов включает гены, направляющие дифференцировку этих клеток. Процесс активации остеогенеза костными морфогенетическими белками называется ocTeoHHflyKuneii.(M.R.Urist, 1997; S.Lynch, R. Genco, R.Marx, 1999). Регенерация на поверхности кости и собственно в костной ткани имеет свои особенности и делиться на две стадии - первичную и вторичную.
Первичная стадия остеогенеза происходит в костномозговых пространствах - эндосте, и в остеогенном слое периоста сразу после инициации регенерации. Известно, что в костномозговых пространствах гемопоэтическая, фиброзная и жировая ткани гибнут в результате прямого физического воздействия, а также из-за повреждения сосудов и нарушения кровообращения. Сразу после травмы образовавшийся дефект костной ткани и костномозговые пространства заполняются кровью, и формируется кровяной сгусток. В течение первых суток в области дефекта и прилегающих к нему костномозговых пространствах наблюдается острая воспалительная реакция. Происходит экссудация тканевой жидкости, миграция лейкоцитов и макрофагов. Эта фаза первичного тканевого ответа обычно длится 24-48 часов (П.А.Равелл, 1993; S.Lynch, R. Genco, R.Marx, 1999). Для неё характерно не только развитие острого воспаления в зоне повреждения, но и начало индукции остеогенеза за счет активации факторов роста, таких как
PDGF и TGF-(3, дающих сигнал к пролиферации клеток кровеносных сосудов и остеогенных клеток (R.A.Bays, 1983; J.Bukwalter, M.Glimcher, R.Cooper, R.Recker, 1995; T Einchorn, 1995). На третьи сутки после травмы начинается рост мелких сосудов со скоростью 0,5 мм в день (F.Rhinelander 1974). Одновременно с неоангиогенезом происходит пролиферация остеогенных клеток, их дифференцировка в остеобласты и синтез морфогенетических белков ВМР-2;-3;-4;-5. (А.Я.Фриденштейн, 1973; Р.-I.Branemark, 1970; P.-I.Branemark, G.A.Zarb, T.Albrektsson, 1985). Образовавшиеся из остеогенных клеток остеобласты синтезируют остеоид путем секреции коллагеновых волокон и протеинов: ВМР-1, протеогликанов, гликопротеинов и фосфопротеина. Секретирующие остеоид остеобласты соединяются между собой и с жизнеспособными остеоцитами трабекул с помощью отростков. Так создается основа для восстановления частично разрушенной костной балки. После 10-дневного периода секреции остеоида начинается минерализация органического матрикса. Фронт минерализации проходит по периферии формирующейся костной пластинки и продвигается в направлении остеобласта. В результате минерализации остеобласт оказывается окружен костным матриксом и преобразуется в остеоцит.
Метод выделение и культивирование СКЖТ
Проточная цитофлуориметрия позволяет оценить относительное содержание клеток определенного типа среди гетерогенной популяции на основании экспрессии клетками характерных поверхностных молекул -антигенов. Стромально-васкулярная фракция клеток из жировой ткани гетерогенна по клеточному составу и в свежевыделенной популяции клеток присутствуют лейкоциты, перициты, мезенхимальные предшественники, зрелый эндотелий и его предшественники. Нами был использован набор антигенов, позволяющий выявить эти субпопуляции СКЖТ. Относительное содержание субпопуляций анализировали на следующий день после выделения и затем после двух пассажей культивирования клеток in vitro.
Известно, что избыточное стимулирование пролиферации может приводить к повышению уровня апоптоза клеток в культуре. Для ответа на вопрос, является ли сочетание среды AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой крови пациента оптимальным для получения культуры СКЖТ, была проведена оценка уровня апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. Для этого СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone) или аутологичной сыворотки крови пациента, снимали с чашек с помощью реагента HyQTase (HyClone), который затем удаляли центрифугированием. Апоптотические клетки идентифицировали при помощи Аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином (AnV-PE, BD Biosciences, США). AnV селективно связывается с фосфатидилсерином, который в процессе апоптоза перераспределяется с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю и оказывается доступным для AnV. Для идентификации таких клеток использовали 7-аминоактиномицин D (7-AAD, Beckman Coulter, Франция), окрашивающий ядра мертвых клеток. Для окраски клеток с помощью AnV-PE и 7-AAD клетки снимали с субстрата HyQTase (HyClone) и ресуспендировали в 200 мкл буфера для связывания AnV (BD Biosciences), после чего добавляли 5 мкл AnV-PE и 10 мкл 7-AAD. Клетки инкубировали 15 мин в темноте, после чего центрифугировали при 200g 5 мин, ресуспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра - клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Форт Коллинз, США). Флуоресценцию AnV-PE и 7-AAD возбуждали на длине волны 488 нм и анализировали в диапазоне длин волн 565-595 нм и 650-690 нм, соответственно.
Для анализа СКЖТ использовали только фракцию клеток, прикрепленную к пластику, что позволило исключить из анализа большинство лейкоцитов, находящихся в суспензии. Для окраски антителами клетки ресуспендировали в концентрации 10 клеток в мл в растворе Версена с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и добавляли флуоресцентно-меченные антитела в следующей концентрации: CD73-PE (BD Biosciences, 10 мкг/мл), CD105-FITC (Miltenyi Biotec, 5 мкг/мл), CD49a-Alexa488 (AbD Serotec, 5 мкг/мл), CD45-FITC (BD Biosciences, 10 мкг/мл), CD45-PC5 (DAKO, 10 мкг/мл), CD34-APC (DAKO, 5 мкг/мл), PDGFbR-PE (BD Biosciences, 5 мкг/мл), CD31-PE (BD Biosciences, 5 мкг/мл), aHTH-NG2 крысы (Abeam, 5 мкг/мл) с последующим окрашиванием IgG-Alexa 633 против крысы (Invitrogen, 10 мкг/мл). В качестве контроля специфичности связывания антител использовали изотипические флуоресцентно-меченные иммуноглобулины в такой же концентрации. Клетки с флуоресцентно-меченными антителами инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30-45 мин, после чего доводили концентрацию клеток до 106 в мл с помощью PBS. Для анализа использовали клеточный сортер MoFlo (DakoCytomation, США). Флуоресценцию FITC, А1еха488, РЕ и РС5 возбуждали с помощью аргонового лазера с длинной волны 488 нм и мощностью 100 мВт, а АРС и АІехабЗЗ - с помощью лазерного диода с длиной волны испускания 635 нм и мощностью 25 мВт. Специфическую флуоресценцию FITC или А1еха488, РЕ, РС5, АРС или АІехабЗЗ регистрировали с помощью светофильтров в диапазонах длин волн 510-550 нм, 565-595 нм, 655-685 нм, 650-690 нм, соответственно.
Мезенхимальные предшественники среди СКЖТ выявляли на основании совместной экспрессии CD73 и CD 105 или CD73 и CD49a. (Dominici et al., 2006) Показано, что мезенхимальные клетки, экспрессирующие эти комбинации поверхностных антигенов являются мезенхимальными предшественниками жировой ткани (B.Wood 2004) и костного мозга (M.Dominici 2006), соответственно.
Сравнение пролиферативной активности СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM или DMEM в присутствии аутологичной сыворотки или 10% фетальной бычьей сыворотки
Известно, что популяция стромальных клеток, выделяемых из подкожной жировой клетчатки и культивируемых с использованием фетальной бычьей сыворотки, содержит мезенхимные стволовые клетки, обладающие мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в нескольких направлениях (Zuk et al., 2002). Для проверки мультипотентности получаемой при культивировании с использованием AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой, СКЖТ 2-4 пассажей помещали в среду для индукции адипоцитарной, хондрогенной, эндотелиальной или остеогенной дифференцировки.
Лдипогенная дифференцировки. Через 21 день культивирования СКЖТ в средах для индукции адипогенной дифференцировки, клетки содержали большое количество липидных капель разного размера красного цвета, выявляемых при окраске Oil Red О Solution (рис. 9А). При анализе СКЖТ, культивированных без индукции адипогенной дифференцировки, иногда встречались отдельные клетки, содержащие мелкие капли, окрашенные Oil Red, что свидетельствует о возможности спонтанной дифференцировки в адипогенном направлении в культуре. В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированные с добавлением фетальной бычьей сыворотки) интенсивность окрашивания культуры с использованием Oil Red не отличалась от клеток, культивированных с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в среде AdvanceSTEM1 (HyClone) они в полной мере сохраняют способность к адипоцитарной дифференцировке при индукции в соответствующих условиях.
Хондрогенная дифференцировка. Через 28 дней культивирования в среде для индукции хондрогенной дифференцировки клеток, при окрашивании гематоксилином Карачи или толуидиновым синим, наблюдалось формирование плотных структур на дне пробирки, характерных для новообразующегося хряща с хондроцитами (рис. 9Б). В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированных с добавлением фетальной бычьей сыворотки) наблюдалось формирование аналогичных структур. В случае отрицательного контроля СКЖТ не формировали плотных образований и оставались в виде отдельных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании в среде AdvanceSTEM (HyClone) с использованием аутологичной сыворотки крови пациента СКЖТ в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в хондрогенном направлении в условиях соответствующей индукции.
Остеогенная дифференцировка. Через 14-17 дней культивирования в среде для индукции остеогенной дифференцировки опытные СКЖТ формировали плотный монослой клеток, большая часть которых, при окраске Ализариновым красным содержала отложения кальция в виде крупных агрегатов оранжево-красного цвета, расположены между слоем клеток и чашкой Петри (рис. 9В). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой они в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в остеогенном направлении при индукции в соответствующей среде.
Эндотелиальная дифференцировка. Через две недели индукции эндотелиальной дифференцировки в опыте были обнаружены тубулярные структуры и островки клеток, несущие CD31 -маркер зрелых эндотелиоцитов (рис. 9Г). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEMTM с аутологичной сывороткой они полностью сохраняют свой потенциал к дифференцировке в эндотелиальном направлении.
Таким образом, при культивировании СКЖТ в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) в сочетании с аутологичной сывороткой крови пациента клетки демонстрируют характерные для мезенхимальных стволовых клеток мультипотентные свойства, выражающиеся в их способности к самообновлению и дифференцировке при индукции в соответствующих средах в четырех направлениях: адипогенном, хондрогенном, остеогенном и эндотелиальном (Nombela-Arrieta С, Ritz, J., and Silberstein, L.E. 2011).
Индукция дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациентов, в адипоцитарном (А), хондрогенном (Б), остеогенном (В) и эндотелиальном (Г) направлениях. Оценка пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани в условиях индукции остеогенной дифференцировки при культивировании в среде AdvanceSTEM с аутологичнои сывороткой.
При проведении предварительной серии экспериментов по изучению способности к различным видам дифференцировки клеток, культивированных согласно методике с использованием среды DMEM с аутологичнои сывороткой, нами был отмечен недостаточно высокий потенциал этих клеток в плане индукции к остеогенной дифференцировке. В связи с этим, было проведено более детальное исследование зависимости способности СКЖТ к остеогенной дифференцировке от используемой при их культивировании среды.
Полученные результаты представлены на рис.10 и рис.11. Остеогенную дифференцировку через 7 дней наблюдали только в культуре СКЖТ, культивированных в AdvanceSTEM с добавлением аутологичнои сыворотки. Во всех остальных случаях (AdvanceSTEM с 10% фетальной бычьей сывороткой, DMEM с 10% аутологичнои сывороткой и DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой) отчетливые признаки остеогенной дифференцировки появлялись только на 21 день. Кроме того, только в условиях культивирования AdvanceSTEM с 10% аутологичнои сывороткой в культуре сохранялся высокий уровень пролиферации при индукции остеогенной дифференцировки. При всех вариантах культивирования, кроме AdvanceSTEM с 10% аутологичнои сывороткой, на 7 день индукции остеогенной дифференцировки обнаруживались лишь отдельные Ki-67 -позитивные клетки, являющиеся свидетельством того, что популяция представляет собой культуру переживающих дифференцирующихся клеток с низким уровнем клеточных делений.
Результаты клинического исследования введения тканеинженерных конструкций при лечении пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных частей нижних челюстей
При анализе биопсийного материла было обнаружено, что в случае введения пациентам тканеинженерных конструкций, состоящих из СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС и ГАП, и на основе СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС и «КоллапАн-Г» на дентальных объемных томографиях (рис.22А,Б; 26А,Б) и при гистологическом анализе (рис.43 ;44) отмечалось выраженное формирование молодой кости. Однако при использовании тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ культивированных в среде AdvanceSTEM с АС, и ГАП у пациентов была выявлена неоднородность сформированной кости, которая определялась на дентальной объемной томографии (рис.22 А, Б; 26А, Б,) и визуализировалась во время установки имплантатов, а также при получении биоптатов костной ткани из области введения тканеинженерных конструкций для гистологического исследования.
Из данных литературы известно, что при замещении костных дефектов с использованием ГАП этот остеопластический материал может до конца не резорбироваться и оставаться во вновь формирующейся кости продолжительное время, что снижает ее однородность. (А.Ю.Дробышев 2001.) Данные ДОТ (рис.22Б, В; рис.26Б, В) и гистологический анализ (рис.43А), проведенный в настоящей работе, подтвердили данные литературы: при использовании тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEMc АС и ГАП у пациентов в составе вновь сформированной кости действительно наблюдались нерезорбированные фрагменты ГАП, (рис.43А) что является недостатком использования данного остеоиндуктивного носителя, но встречались участки с полной его резорбцией (рис. 43 Б), что свидетельствует о том, что присутствие СКЖТ в зоне формирующейся кости способствует резорбции ГАП. Помимо формирующейся костной ткани в зоне введения тканеинженерных конструкций на основе СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM,M с АС и «КоллапАн-Г», СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС и ГАП наблюдался активный ангиогенез с формированием мелких капилляров и крупных зрелых сосудов (рис 43А, Б, 44), что, по-видимому, обусловило быстрое заживление операционных ран во всех случаях.
Декальцинированные криосрезы биопсий, полученных после введения тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ и ГАП. Иммуногистохимическое окрашивание антителами CD31, выявляющими сосуды; препараты докрашены гематоксилином, эозином.Звездочками отмечены участки нерезорбированногоГАП, черными стрелками - вновь сформированные костные трабекулы, краснымистрелками - сосудистые структуры (коричневое окрашивание). Масштабный отрезок ЮОцт.
Декальцинированные криосрезы биопсий, полученные после введения тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ и «КоллапАн-Г». Иммуногистохимическое окрашивание антителами CD31, выявляющими сосуды; препараты докрашены гематоксилином, эозином. Черные стрелки указывают на вновь сформированные костные трабекулы, красные стрелки - на сосудистые структуры (коричневое окрашивание). Масштабный отрезок 1 ООцт
Таким образом, при использовании в качестве носителя как ГАП, так и «КоллапАн-Г» гистологически (рис 43,44) и на ДОТ (рис.22 А, Б; рис.26 А, Б) было отмечено формирование молодой костной ткани, сопровождающееся формированием капилляров и более крупных сосудов. Однако, поскольку в ряде случаев был обнаружен нерезервированный ГАП (рис.43А) при использовании тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС и ГАП, для дальнейших исследований в качестве носителя был выбран «КоллапАн-Г».
Учитывая данные, полученные другими авторами (J.R.Dudas, K.G.Marra, G.M.Cooper 2006; D.T.Leong, M.C.Abraham,S.N.Rath 2006) , и базируясь на результаты собственных исследований, нами было установлено, что для улучшения стимуляции регенеративного процесса необходима предварительная дифференцировка СКЖТ в остеогенном направлении. В связи с этим было предложено использовать при создании тканеинженерной конструкции сочетание СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС, обладающих по нашим данным и данным других исследователей выраженным ангиогенными и антиапоптотическими потенциалом, и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1) на носителе «КоллапАн-Г».
Данная комбинированная тканеинженерная конструкция способна увеличить количество сосудов в тканях, за счет присутствия СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС, что в свою очередь приводит к улучшению кровотока и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии, а так же обладает выраженными остеогенными свойствами за счет наличия преддифференцированных в остеогенном направлении СКЖТ, что оказывает благоприятное влияние на вторую стадию остеогенеза и формирования молодой кости.
При использовании тканеинженерных конструкций, полученных на основе «КоллапАн-Г» и сочетания СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с АС с СКЖТ, культивированных в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель, уже через 1 месяц по данным ДОТ (рис. 31; 38А, Б) отмечалось формирование молодой костной ткани, а через 3 месяца при гистологическом исследовании(рис. 45) и на ДОТ (рис. 32; 39А, Б) было зафиксировано формирование молодой костной ткани и образование мелких капилляров, артериол и крупных стабильных сосудов, состоящих из трех оболочек: интимы, медии и адвентиции (рис. 45).
![Применение метода дистракционного остеогенеза для увеличения параметров альвеолярной части нижней челюсти [Электронный ресурс]](/i/i/4364/185788.png "Применение метода дистракционного остеогенеза для увеличения параметров альвеолярной части нижней челюсти [Электронный ресурс] Киселев Алексей Александрович")
