Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
Научно-методические основы разработки регенерирующих препаратов для лечения слизистой оболочки полости рта и пародонтитов 11
1.1. Методы лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта .12
1.2. Использование микрокапсулирования для доставки активных веществ
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .40
2.1. Микробиологические и молекулярно-генетические технологии для установления и идентифицикации патогенной микрофлоры полости рта .40
2.2. Методы выделения низкомолекулярных пептидов 43
2.3. Технология приготовления стоматологического ниосомального геля «Регенерин» 45
2.3.1. Получение ниосом и инкапсулирование низкомолекулярных пептидов 45
2.3.2. Физико-химическая оценка приготовленных ниосом .46
2.4. Экспериментальные методы исследования 46
2.5. Анализ эффективности применения ниосомального геля «Регенерин» 49
2.6. Статистическая обработка материала
ГЛАВА 3. Микробиологический статус у больных с повреждениями слизистых и заболеваниями пародонта по результатам молекулярно-генетических методов исследования 50
3.1. Отработка оптимальных методов экстрагирования плацентарной ткани 57
3.2. Оценка размеров и стабильности ниосом кремнийорганической природы, используемых для доставки активных субстанций
3.3. Биотехнология приготовления ниосомального геля «Регенерин»
ГЛАВА 4. Изучение безопасности и эффективности ниосомального геля «регенерин»
4.1. Изучение токсичности ниосомального геля «Регенерин» на экспериментальных животных .70
4.2. Изучение стимуляции регенераторной способности слизистой оболочки полости рта после химической, ожоговой и механической травмы 74
4.3. Результаты гистологического исследования патологии краевого пародонта в эксперименте при применении клеточного препарата «Регенерин» .76
4.4. Микробиологический статус у больных с повреждениями слизистых и заболеваниями пародонта с помощью молекулярно-генетических методов исследования после лечения гелем «Регенерин»
Заключение 90
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы
- Использование микрокапсулирования для доставки активных веществ
- Получение ниосом и инкапсулирование низкомолекулярных пептидов
- Оценка размеров и стабильности ниосом кремнийорганической природы, используемых для доставки активных субстанций
- Изучение стимуляции регенераторной способности слизистой оболочки полости рта после химической, ожоговой и механической травмы
Использование микрокапсулирования для доставки активных веществ
Воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта являются весьма распространённой стоматологической патологией. В специальной литературе детально представлены клинические характеристики фаз деструктивно-воспалительного поражения пародонта (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 2001; Курякина Н.В., Кутепова Т.Ф. 2003;). В основу лечебных методик, направленных на устранение патологических симптомов в тканях пародонта, заложен принцип раздельной санации. Местная терапия заключается в механическом удалении зубных отложений и аппликационном воздействии медикаментозными препаратами на ткани пародонта. Общее лечение заключается в парентеральное введение лекарственных средств воздействующих на организм в целом. Комплексный подход в санации пародонта должен включать ортопедическую и ортодонтическую коррекцию, хирургическое и бальнеолечение, консервативную и физиотерапию и другие воздействия, призванные обеспечить восстановление структуры и функции пародонта (Цепов Л.Ю., Николаев А.И., 2002; Белоусова А.В., Кухаренко Ю.В., 2005; Вахней С.Н., Февралева А.Ю., 2007;). Составление плана санации тканей пародонта во многом зависит от стадии патологического процесса и особенностей клинического течения у конкретного пациента, состояния реактивности тканей ротовой полости и организма в целом. Проводится детальный анализ степени нарушений микроциркуляции и тканевого обмена в пародонте, на молекулярном и клеточном уровне определяются метаболические расстройства, выявляется наличие и характер сопутствующей патологии (Безрукова И.В. 2004; Соколова Н.А., 2004; Модина Т.Н., Молькова С.С., Копылова Н.А. и др., 2005;) Выбор индивидуальной схемы антибактериальной терапии проводится с учетом ряда факторов: характера клинического течения патологического процесса и фазы его развития, состояние иммунной системы макроорганизма и микробиоциноза полости рта, наличием сопутствующей соматической патологии у пациента (Цепов Л.Ю., Николаев А.И.,2002; Безрукова И.В., Грудянов А.И., Ерохин А.И. 2003; Грудянов А.И., Овчинникова В.В., Дмитриева Н.А., 2004;). При этом необходимо учитывать, что массированная антибиотикотерапия, зачастую приводит к подавлению нормальной микрофлоры пациента, развитию дисбактериоза и к формированию особенно устойчивых штаммов патогенных возбудителей, способствующих генерализации воспаления в пародонтальных тканях. Поэтому широкое применение антибактериальных препаратов для местного лечения вполне оправдано (Перова М.Д., 2005).
Устранение воспаления пародонтальных тканей является сложной задачей. Поэтому для максимальной эффективности такого лечения необходим индивидуальный подбор противовоспалительных средств (Орехова Л.Ю., Кучумова Е.Д., Леонтьев А.А., Калинина О.В., 2008; Максимовский Ю.М., Чиркова Т.Д., Ульянова М.А., 2008; Прикулс В.Ф., Жданов Е.В., Герасименко М.Ю., 2008;). С бурным развитием фармакологической индустрии в практической стоматологии, нашли широкое применение противовоспалительные препараты различных лекарственных форм (Орехова Л.Ю., Кучумова Е.Д., Прохорова О.В., Ткаченко Т.Б., 2001; Ионов В.В., 2008; FontaineV., TouatZ., MtairagelM. etal., 2004; HavensA., ChiuE., TabaM., WangJ. еtal. 2008;). Из весьма объёмного перечня таких лекарственных средств, в практической пародонтологии, наибольшего внимания удостоились препараты воздействующие на анаэробную флору, это группа антибиотиков широкого спектра действия тетрациклинового ряда (тетрациклин, диоксициклин), бета-лактамных антибиотиков (оксациллин, ампицилин), группа линкомицинов (далцин, клиндомицин, линкомицин), антисептические препараты, а также стероидные и нестероидные противовоспалительные средства (Царев В.Н., Ушаков Р.В., 2004; Александровская И. Ю., 2005; Цепов Л.Ю., 2007;).
По мнению А.И. Грудянова с соавторами (2004) препараты группы линкомицинов в небольших дозировках оказывают бактериостатическое действие на анаэробную инфекцию и в ударных концентрациях бактерицидное действие. Особая чувствительность к анаэробам ротовой полости отмечена у клостридия и бактероида (CarranzaF., NewmanM., 1996; DingY., HaapasaloM., KerosuoE. etal. 1997;).
Результаты проведенных исследований Колесовой Н.В. (2001), Барером Г.М., Зорян Е.В. (2006), Калининым Л.А. (2008) подтверждают высокую эффективность бета-лактамных антибиотиков в отношении анаэробных спорообразующих палочек, некоторых штаммов актиномицетов и других анаэробов.
Активно используемые в практике лечения болезней пародонта антибиотики широкого спектра действия, как правило, чувствительны к грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также спирохетам, лептоспирозам, риккетсиям и крупным вирусам (KjeldsenL., SengelovH., LollikeK., BorregaardN., 1996).
По наблюдениям Линовицкой О.В. (2001), Зорян Е.В. (2004), Каракова К.Г. (2007), TozumT., AkmanA., YamalikN. Etal. (2007) при лабораторном анализе стоматогенной инфекции, всё чаще отмечается наличие высоковирулентной микрофлоры.
Формирование высоковирулентных устойчивых штаммов возбудителей происходит вследствие неконтролируемого и необоснованного назначение антибактериальных препаратов (Широбоков В.П., Борисенко А.В., Тивоненко Л.И. с соавт., 2002; Грудянов А. И., Григорьян А.С., Рябухина Н.А., Фролова О.А. ,2004; Шилова С.Г., 2004; Дзех С.А, 2008;).
Некоторые исследователи видят решение задачи преодоления резистентности микроорганизмов в комплексном применение различных антибактериальных средств, отличающихся друг от друга механизмом избирательного воздействия C. Vetter (1996). Подобный подход имеет вероятность усугубить положение вещей и может способствовать прямо противоположенному эффекту - повысить вирулентность и устойчивость микрофлоры к антибиотикам. Приверженцы использования асептических препаратов, как мощного и доступного антимикробного средства утверждают, что лечебного эффекта можно достичь, не прибегая к различным вариантам схем антибиотикотерапии. Как известно, практически все антисептики в своей основе имеют такие химические элементы как фтор, йод, хлор. Наиболее распространённым, в практической стоматологии, является хлоргексидин. Этот препарат имеет различные лекарственные формы – гели, растворы, лаки, биополимерные пленки (Дедеян В.Р. с соавт., 1997; Царев В.Н., 2003; Новикова Е.Н., 2004; AsariA.,1996;). Ещё из хлорсодержащих антисептиков широкое распространение в практической стоматологии получили Триклозан (производное фенола), Мирамистин, хлорсодержащие гели «Элюгель» и «Эльгифлуор». Они активны к большинству возбудителей грамположительной и грамотрицательной флоры, спирохет, вирусов повышают проницаемость клеточных мембран и вызывают цитолиз микроорганизмов. Основные пути введения орошение, аппликации, поддесневая ирригация в прямом контакте, так и через доставляющие системы. Как показали клинические исследования, фторсодержащие антисептики очень эффективны при поддесневом введение, при этом концентрация фтора в препарате должна быть не меньше 1,64%. Для фторсодержащих соединений доставляющими системами являются зубные пасты и растворы (серия «Лакалют», «Аквафреш», «Витафтор», гель Коллост и т.д.).
Получение ниосом и инкапсулирование низкомолекулярных пептидов
Методика бактериологического исследования с применением техники анаэробного культивирования. Полученный материал помещён в полужидкую питательную среду Стюарта, затем в течение одного часа транспортирован в Лабораторию питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. После этого проведён количественный секторальный посев на среды, предназначенные для культивирования бактерий полости рта. В анаэробных условиях чистые культуры факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий получены с использованием 5% кровяного гемин-агара, приготовленного на основе Brain-Heart Infusion фирмы «Difco» с добавлением гемина (5 мкг/мл) и менадиона (0,1 мкг/мл), с обязательным помещением посевов в анаэростаты с бескислородной газовой смесью (состав: 80% азота, 10% углекислого газа, 10% водорода). Для редукции остатков кислорода применён палладиевый катализатор. Время культивирования в анаэробных условиях составляло до 7 суток. Результаты количественного исследования микрофлоры рассчитывались в колониеобразующих единицах – КОЕ/мл (CFU) и lg CFU.
Молекулярно-генетический метод, основанный на ПЦР с последующей обратной ДНК - гибридизацией с праймерами пародонтопатогенных бактерий. Полученный вышеописанным методом материал из зубодесневой борозды помещён в пробирки Eppendorf и в течение одного часа транспортирован в Лабораторию питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. ПЦР была проведена с использованием тест-набора «МультиДент» (ООО НПФ «ГенЛаб», РФ). Тест-набор «МультиДент» является высокоспецифичным молекулярно-биологическим диагностическим способом идентификации пяти маркерных пародонтопатогенов: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia. Для проведения теста не требуется поддержания бактерий живыми, а также специальных предосторожностей при транспортировке, так как метод основан на анализе нуклеиновых кислот. Концентрации бактерий, присутствующие на здоровой слизистой оболочке, дают отрицательный результат теста, а любой положительный результат обладает диагностическим признаком.
Для выделения ДНК из полученного материала использован метод ускоренной пробоподготовки с помощью набора реагентов производства ООО НПФ «ГенЛаб» (РФ) в соответствии с рекомендациями фирмы - производителя: «Экстраген» (суспензия смеси гранул ионообменников – 10 мл); «Энзимикс» (протеолитический комплекс – 1 пробирка с лиофилизированным содержимым); растворитель «Энзимикса» – 100 мкл. Амплификацию выделенного генетического материала проводили в термоциклере «Терцик МС- 2» («ДНК-Технология», Москва) с компьютерной программой для осуществления мультиплексной ПЦР, рекомендованной фирмой-изготовителем. Клонированные образцы ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1,6% агарозе после окрашивания бромистым этидием (медицинская технология ФС-2006/043-У).
Техника приготовления состояла из нескольких этапов: 1. Диспергирование. Цель данного процесса - путем разрушения клеточных мембран увеличить общую поверхность исходного материала. Для этого использовали АПВ гомогенизатор и приборы для воздействия ультразвуком. При помощи гомогенизатора жидкая смесь продавливалась под высоким давлением через узкие кольцевые щели или отверстия. 2. По Фармакопее VIII, жидкие экстракты готовили перколяционным способом. Экстрагентами явились вода и пропиленгликоль в концентрации. ТУ 9154-001-17444221-09 Технические условия. Пропиленгликолевые экстракты из растительного сырья. ТУ 9154-003-17444221-09 Технические условия. Водные экстракты из растительного сырья. 3. Очистка. Исходный материал экстрагировали путем осаждения, центрифугирования или фильтрации. Основная техническая задача - получить по возможности большее количество очищенного экстракта и свести до минимума потери.
Для интенсификации экстракционного процесса использовали ультразвуковое дезинтегрирование, что позволило увеличить выход основного продукта. Экстракты готовили соответствующими методами, используя пропилен-гликоль или водный растворитель. Лекарственное растительное сырьё и растворители, которые использовали при изготовлении экстрактов, отвечали требованиям соответствующих статей Фармакопеи. Вода очищенная - ФС 42-2619-89, хлороформ - ГОСТ 20015-74.
Физико-химические показатели, определяемые для экстрактов, в соответствии с Техническими Условиями (ТУ):
1. Плотность (масса единицы объема материала. В жидких средах определялась ареометром) г/см, кг/м.
2. Водородный показатели (Одно из важнейших свойств водных растворов — их кислотность (или щелочность), которая определялась концентрацией ионов Н+ и ОН_. Определяется на рН-метре). 3. Показатель преломления (величина, характеризующая среду и равная отношению скорости света в вакууме к скорости света в среде (абсолютный показатель преломления). Показатель преломления зависел от диэлектрической и магнитной проницаемостей среды и длины волны света, чем объясняется дисперсия при преломлении света при определении рефрактометром). 4. Содержание воды и летучих веществ, % (дополнительно к ТУ, определяли путем высушивания (выпаривания) образца в сушильном шкафу или с помощью анализатора влаги и летучих веществ).
5. В каждом экстракте проводили исследование сухого остатка, с целью определения веществ, которые не подверглись экстрагированию, но также имеют биологическую ценность (например, нативный белок). Принцип метода основан на удалении влаги путем выпаривания исследуемого раствора и последующем высушивании остатка до постоянного веса.
Анализ проводили во взвешенной и доведенной до постоянной массы фарфоровой чашке (d = 7 см), куда наливали 1 мл исследуемого образца и выпаривали его на кипящей водяной бане (при постоянном помешивании препаратов, содержащих агар). После испарения жидкости чашку ставили в сушильный шкаф (100 ± 5)С на 2 ч., охлаждали в эксикаторе и взвешивали на аналитических весах.
Оценка размеров и стабильности ниосом кремнийорганической природы, используемых для доставки активных субстанций
На основании, полученных результатов можно сделать следующие выводы: Ниосомы, полученные из ПЭГ-12 диметикона с включенными во внутренний объём активными субстанциями – диспергированными с помощью АПВ гомогенизатора растительными экстрактами, представляют собой полноценные мультиламеллярные везикулы стандартного размера от 20 до 100 нм, включающие высокий процент иммобилизованных активных субстанций растительного происхождения, стабильные при хранении.
Результаты исследований размеров ниосом методом динамического светорассеяния подтверждают данные, полученные растровой электронной микроскопией. Результаты исследований дзета-потенциала ниосом, свидельствуют об их электростатической устойчивости (стабильности). Таким образом, система доставки активных субстанций с помощью везикул кремнийорганической природы может быть отнесена к области нанотехнологий. Полученные данные позволяют характеризовать ниосомы как нановезикулы. 3.3. Биотехнология приготовления ниосомального геля «Регенерин».
На сегодняшний день одним из основных направлений фарминдустрии является подбор новых путей доставки препаратов (ManconiM. аtall, 2003). Это связано с тем, что обычные способы применения лекарственных препаратов перорально или внутривенно не всегда дают идеальное распределение биологически активных веществ в организме (JinfangYuan, YaliLuo, QingyuGao, 2002). Новой технологией является создание препаратов, полученных путем инкапсулирования биологически активных веществ в нановезикулы (NallaDilipReddyB., ChallaVinilReddy, KishoreA.B., 2010). Такой подход позволит принципиальным образом изменить свойства лекарств: сделать их более эффективными, влиять на режим их применения, придать им адресность и снизить известные побочные эффекты. Целевая доставка лекарственных средств к заданным биомишеням особенно важна для применения биологически активных веществ животного происхождения (MachadoS.R.P., EvangelistaR., 2010; TabbakhianM., 2006).
Актуальным направлением в наружном лечении дефектов слизистой оболочки полости рта и парадонта, является разработка гелей с регенерирующим эффектом. Инкапсулированные формы, содержащие низкомолекулярные пептиды, обладают более выраженным действием по сравнению с нативными композициями при наружном применении в стоматологии. В качестве доставляемых активных субстанций использовали. низкомолекулярные пептиды, выделенные из плацентарных клеток и обладающие мощным регенераторным потенциалом.
Разработанные нами ниосомы представляют собой везикулы, состоящие из оболочки нерастворимого в воде двойного слоя неионогенного эмульгатора ПЭГ-12 диметикон, по структуре подобного строению элементарных биологических мембран, и заключенного внутри капсулы и или её стенки в зависимости от липофильности активной субстанции. Диметикон кополиолы, образующие ниосомы, представляют собой гипоаллергенные соединения кислорода, водорода, кремния и углерода. Наличие ковалентной связи Si-О в гидрофобной части молекулы полидиметилсилоксановой основы эмульгатора, которая обладает большой эластичностью и реакционной способностью, позволяет направленно доставлять в ткани активные субстанции, полученные путем экстрагирования плацентарной ткани и при помощи реакционноспособных участков целенаправленно их выпускать из везикулы.
Исследование по получению ниосом осуществлялось в асептических условиях, используя на всех этапах стерильные растворы и посуду
Создание таких капсул позволило получить новые наночастицы, превосходящие липосомы по нескольким параметрам (Базиков И.А., Омельянчук П.А., Хатков Э.М., Гукасян А.Л., Сеираниду З. А., 2012). На первом этапе конструирования трансдермального ниосомального геля получали дисперсию ниосом методом механического (ручного) встряхивания. Процесс проводили при комнатной температуре и интенсивном механическом встряхивании ПЕГ-12 диметикона на шейкере в течение 5 минут.
В дальнейшем, полученные ниосомы модифицировали ультразвуком. Этот метод легко воспроизводим, и отличается простотой осуществления.
При воздействии ультразвуковых волн, мультиламеллярные ниосомы, полученные методом встряхивания, обретали моноламеллярную структуру. При этом размеры ниосом уменьшались до размера менее 100 нанометров (Нм) и становились более однородными пропорционально мощности и времени озвучивания.
Дисперсию ниосом, полученную методом механического (ручного) встряхивания помещали в сосуд для ультразвуковой обработки. Режим озвучивания: частота – 20 кГц, мощность – 150-250 Вт. Для экспозиции использовали временные интервалы в 15, 30 и 45 минут. При этом образовывались моноламеллярные ниосомы размером менее 100 Нм с включением иммобилизируемого материала не менее 50%. Причём наибольший процент иммобилизируемых веществ был отмечен при экспозиции 30 минут (табл. 3).
Содержание иммобилизируемых веществ определяли спектрофотометрическим способом. Количество иммобилизируемых веществ, включенное в ниосомы напрямую зависило от способа получения ниосом и их размера. Соответственно, чем меньше ниосома, тем меньшее количество иммобилизируемых веществ внутри ниосомы, но одновременно маленькая ниосома способна проникнуть в глубокие слои кожи. Поэтому, интерес представляют маленькие моноламеллярные ниосомы размером менее 100 Нм, имеющие тонкую эластичную оболочку, позволяющую продвигаться по межклеточным промежуткам, представляющим собой липидный матрикс.
Размер ниосом зависил от свойства мембраны, ПЕГ-12 диметикон (PEG-12 Dimethicone), образующей бислойную структуру, что позволяло получать сверхтонкую и эластичную мембрану.
Ультразвуковая обработка дисперсии ниосом вела к повышению количества включаемых низкомолекулярных пептидов во внутренний объем ниосом. Биологически активные вещества, обладающие тропностью к ПЕГ-12 Диметикону, иммобилизировались в ниосомы при различных режимах ультразвукового воздействия.
Ультразвуковой метод использовали в дальнейшем также и для иммобилизации в них низкомолекулярных пептидов.
Данную процедуру проводили при температуре 15 С для того, чтобы избежать негативного воздействия на иммобилизируемые в ниосомы вещества и ПЕГ-12 Диметикон. В связи с тем, что экстракты занимают небольшой объем относительно других компонентов, их включение в ниосомы производилось путем добавления 2% ПЭГ-12 диметикона к раствору экстрагированных активных субстанций растительного происхождения в отдельной емкости. После включения активных субстанций в ниосомы суспензия ниосом вносилась к другим компонентам эмульсии при комнатной температуре. Особенностью включения липидной фазы геля, содержащей 5% циклометикона, в ниосомы являлось предварительное растворение в ней 2% ПЭГ-12 диметикона, перемешивание и последующее внесение в водную фазу смеси. Заключительная стадия формирования ниосом происходила при интенсивном механическом перемешивании смеси с использованием АПВ гомогенизатора (табл. 4).
Изучение стимуляции регенераторной способности слизистой оболочки полости рта после химической, ожоговой и механической травмы
Реализация жесткого условия фармакотерапии, связанного с обеспечением терапевтического эффекта минимальной дозой лекарства, без побочных действий, возможна лишь при тщательном изучении новых форм лекарственных препаратов на доклиническом и клиническом этапах. Результаты изучения острой токсичности потенциального биологически активного вещества позволяют приступить к изучению фармакологических исследований, которые в свою очередь определяют степень и продолжительность изучения хронической токсичности вещества.
Фармакологические исследования определяют терапевтическую эффективность исследуемого вещества, его влияние на системы организма, побочные и аллергические реакции. При токсикологических исследованиях биологически активной субстанции устанавливается характер и выраженность возможного повреждающего воздействия на организм экспериментальных животных. Изучение острой токсичности проводили на белых беспородных крысах обоего пола весом 180-220 г и кроликах обоего пола весом 2,1-2,3 кг, содержащихся в стандартных условиях вивария при естественном освещении, фиксированном кормлении по времени и непрерывном использовании автопоилок.
Выбор доз препарата для оценки острой токсичности производили исходя из оптимального содержания ниосом в геле для достижения необходимого терапевтического действия (10%) и максимальной площади кожи, которая может быть обработана препаратом с последующей резорбцией в системный кровоток. Для крыс средняя терапевтическая доза (ТД) составляет 0,05 мл/кг, а для кроликов 0,5 мл/кг.
Острую токсичность исследуемого препарата определяли в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ.
Изучение острой токсичности средства при однократном применении (введении) проводят с целью определения наличия побочных реакций при однократном приеме увеличенной дозы и установлении причин летальности; широты терапевтического действия или терапевтического индекса Эрлиха (отношение максимально переносимой дозы к максимальной терапевтической), что невозможно установить в клинических условиях. При изучении острой токсичности определяют показатель DLso для различных видов животных и рассчитывают коэффициент видовой чувствительности по отношению DL50max/DE50min. Если этот коэффициент равен 1 или близок к ней, то это свидетельствует об отсутствии видовой чувствительности. Если же коэффициент значительно отличается от единицы, это указывает на различную выраженность токсического действия фармакологического средства на разные виды млекопитающих, что необходимо учитывать при пересчете экспериментальной эффективной дозы для человека.
Острая токсичность разработанного наногеля была изучена на 60 белых крысах обоего пола весом и на 15 кроликах обоего пола, прошедших карантин в течение 10 дней. Крысы были разбиты на 5 групп по 12 особей (6 самок и 6 самцов), кролики разделены также на 5 групп по 3 животных. Подопытные группы крыс получали препарат внутрибрюшинно в различных дозах: 0,08 мл/кг (двойная ТД), 0,2 мл/кг (пятикратная ТД), 0,8 мл/кг (десятикратная ТД) и 2 мл/кг (пятидесятикратная ТД). Кроликам вводили внутривенно 1 мл/кг (двойная ТД), 2,5 мл/кг (пятикратная ТД), 5 мл/кг (десятикратная ТД) и 25 мл/кг (пятидесятикратная ТД). Контрольные группы животных получали эквиобъемное количество физиологического раствора.
Наблюдение за опытными животными проводилось в течение 2-х недель, в первый день непрерывно. Фиксировалось общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частота и глубина дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова, консистенция фекальных масс, потребление корма и воды.
Подобные наблюдения и выявления повреждающего действия испытываемого лекарственного средства позволяют судить о том, какие органы и ткани наиболее чувствительны к биологически активному веществу и на что требует обратить особое внимание при проведении клинических испытаний. Наблюдение за животными в ходе «острого» эксперимента показало, что ни один из регистрируемых параметров поведения, реакции на различные раздражители, состояние волосяного и кожного покрова, консистенция фекальных масс, потребление корма и воды не отличаются от данных контрольной группы.
Таким образом, результаты исследований геля на разных группах животных с использованием общепринятых методических подходов, свидетельствуют об отсутствии токсичности (табл. 5, табл. 6, табл. 7).
Первоначально изучали регенерацию слизистой полости рта после химической травмы. В контрольной группе животных на слизистую поверхность, размером 3х3 кв. мм. по каплям наносили уксусную кислоту, с экспозицией 20 сек. Животные впервые двое-трое суток чувствовали себя плохо. Они были беспокойны, метались в клетке, иногда кусали друг друга, отказывались от пищи и воды. Двое животных погибли на вторые сутки. Рана, после нанесения ожога, значительно бледнела. На ней появлялось подобие пузыря, хотя выраженность его у различных животных была разной. По истечении часа - полутора часов, окраска раны у всех животных изменялась и становилась ярко малиновой.
На третьи сутки у животных контрольной группы поверхность ран выглядела неровной, бугристой, более твердой, по сравнению с окружающими тканями. Рана покрыта красноватой коркой, с белесыми вкраплениями. Вокруг раны значительно выражены отек и гиперемия.
На шестые сутки красная корка на ране остается, белесые вкрапления смещаются к центру, отек по краям раны по-прежнему выражен значительно, а гиперемия вокруг несколько уменьшилась. По мере увеличения срока наблюдения до 10 и более суток, на ране видны коричневые корочки, числом 3,4,6 штук в разных препаратах. Выраженность отека существенно уменьшилась, гиперемия практически отсутствует. К концу срока наблюдения (15суток) поверхность слизистой в ране тверже окружающих тканей, розовая. Участки, покрытые коркой - отсутствуют, хотя полного заживления раны еще не наблюдается.
В группе животных, которым после ожога обрабатывали рану препаратом «Регенерин», были получены следующие данные. На третьи сутки после ожога раневая поверхность желтоватого цвета - результат взаимодействия уксусной кислоты с «Регенерином». Поверхность раны неровная, однако, она значительно мягче, чем в препаратах контрольной группы в эти же сроки. На ране также имеются белесоватые вкрапления, но они гораздо слабее выражены. Отек тканей вокруг раны не столь значителен, как в контроле. К шестым суткам рана значительно уменьшается в размерах-2х1 мм. Поверхность раны также становится мягче и белых вкраплений практически не наблюдается. Интересно, что в эти сроки мы вообще не наблюдали коричневых корок на поверхности раны, которые были ярко выражены в контроле. На десятые сутки после ожога раневая поверхность неровная, но мягкая. Отек не выражен. К концу 15 суток рана значительно уменьшилась в размерах, Края раны неровные, но поверхность раны мягкая, светло-розового цвета. При механической травме рубец при воздействии Регенерина на рану, образуется значительно раньше, чем в контрольной группе кроликов и консистенция его значительно мягче. Появление грануляционной ткани и краевая эпителизация наступают значительно быстрее. При термических и химических ожогах, при обработке их Регенерином стабилизация общего состояния животных наступала в среднем на сутки – двое раньше, чем у животных контрольной группы. При термических, и особенно при химических ожогах, увеличение ран в размерах не было столь значительным. Раны подсыхали скорее, чем в контрольной группе, намокание их было не столь значительным. При химических ожогах поверхность раны была более мягкой, чем в контрольной группе. Таким образом, воздействие препарата «Регенерин» на слизистую полости рта показало, что заживление ран при использовании препарата «Регенерин» идет более активно и предотвращает осложнения в их течении.
