Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Органические кислоты фосфора и производные на основе фармакофорных спиртов, диолов, фенолов и моносахаридов (литературный обзор) 12
1.1 Фосфорилирование алкалоидов 12
1.2 Тиофосфорилирование функционально-замещённых фенолов 15
1.3 Фосфорилирование многоатомных фенолов 19
1.4 Дитиофосфорилирование гликолей 22
1.5 Дитиофосфорилирование трёх- и четырёхатомных спиртов 25
1.6 Дитиофосфорилирование моносахаридов 27
Глава 2. Синтез и свойства дитиофосфорильных производных природных и синтетических моно- и бифункциональных спиртов (обсуждение результатов) 36
2.1 Дитиофосфосфорилирование 2,6-диметилфенола 36
2.2 Дитиофосфонирование хинина 38
2.3 Дитиофосфонирование 4-(1Н-пиррол-1-ил)фенолаи 4-(имидазол-1-ил)фенола 39
2.4 Дитиофосфонирование резорцина и 2-метилрезорцина 44
2.5 Дитиофосфонирование 1,3-ди(2-гидроксиэтокси)бензола 52
2.6 Дитиофосфонирование дисилилированных резорцинов 61
2.7 Дитиофосфонирование транс-9,10-дигидро-9,10-этантрацен-11,12-дим етил ола 65
2.8 Дитиофосфонирование дикетонидов моносахаридов 68
2.9 Дитиофосфонирование силилированных дикетонидов моносахаридов 78
2.10 Биологическая активность дитиокислот фосфора и их аммониевых солей 80
2.10.1 Прогнозирование биологической активности 80
2.10.2 Антибактериальная и антигрибковая активность дитиокислот фосфора и их аммониевых солей 82
2.10.3 Мутагенные и токсические свойства дитиокислот фосфора и их аммониевых солей 85
Глава 3. Экспериментальная часть 91
3.1. Спектроскопические исследования 91
3.2. Рентгеноструктурные исследования 92
3.3. Синтез исходных соединений и очистка растворителей 92
3.4 Описание экспериментов 92
Основные результаты и выводы 144
Список литературы
- Фосфорилирование многоатомных фенолов
- Дитиофосфорилирование моносахаридов
- Дитиофосфонирование резорцина и 2-метилрезорцина
- Синтез исходных соединений и очистка растворителей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эксперты ВОЗ охарактеризовали метаболический синдром как «пандемию 21 века». По литературным данным МС определяется у 20-40% лиц среднего и старшего возраста и является одним из ведущих факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, нарушений углеводного обмена и других патологий. Это существенно влияет на качество и продолжительность жизни взрослого населения в индустриально развитых странах (М.Н. Мамедов, 2005; H.E. Resnick et. аl., 2003; M.I. Schmidt et.al., 2005; G. Mancia et. аl., 2007).
Важна ранняя диагностика МС, так как многие изменения внутренних органов, возникающие при его развитии, являются обратимыми и при соответствующем лечении можно добиться исчезновения или уменьшения выраженности основных проявлений МС. Основой лечения МС являются немедикаментозные мероприятия, направленные на снижение массы тела, изменение стереотипов питания, отказ от вредных привычек, повышение физической активности, то есть формирование здорового образа жизни. Значительная роль в реализации этих направлений принадлежит курортной терапии, при которой используется лечебное действие природных физических факторов, в частности, питьевых минеральных вод, заключающееся в активирующем их влиянии на восстановительные и компенсаторно-приспособительные процессы организма (И.Д. Френкель, С.Б. Першин, 1996; Г.М. Крашеница с соавт., 1996; Н.Д. Полушина с соавт., 1997; Д.А. Еделев с соавт., 2007; А.Н. Елизаров с соавт., 2008).
В комплексном лечении больных метаболическим синдромом большую роль играет диетотерапия, способствующая снижению массы тела и нормализации метаболических нарушений, характерных для этой патологии (Г.М. Угланова, 1992; С.А. Бутрова, 1997; S.M. Haffner et al, 1998; S.M. Grundy, 1998).
Определенный интерес представляет изучение эффективности курортного лечения больных метаболическим синдромом с применением питьевых минеральных вод ессентукского типа и умеренно низкокалорийной диеты с использованием вместо сахарозы подсластителя - растения стевии. В литературе широко освещаются различные положительные свойства стевии и ее препаратов, которые касаются массы тела, липидного, углеводного обмена, снижения инсулинорезистентности, повышения иммунитета, улучшения реологических свойств крови (И.Ю. Ситничук с соавт., 2002; В. Озерова, 2005; И. Ярмолюк, Е.В. Белоус, 1990). Все свойства стевии с успехом могут использоваться при МС.
Цель исследования. Научное обоснование сочетанного применения питьевых минеральных вод и диеты с использованием подсластителя стевии в комплексном курортном лечении больных метаболическим синдромом.
Задачи исследования:
1. Дать оценку антропометрическим, клинико-метаболическим, гормональным показателям, состояния углеводного, липидного обмена, инсулинорезистентности, уровня артериального давления у больных МС.
2. Провести анализ регуляции гликемии и инсулинемии у больных МС в процессе стандартного теста толерантности к глюкозе. Оценить СТТГ у больных МС с НТГ и без нее.
3. Провести оценку клинической эффективности применения лечебных комплексов, включающих питьевое лечение и умеренно низкокалорийную диету с применением сахарозы и стевии в качестве подсластителя на динамику антропометрических показателей, массу тела, уровень инсулина, выраженность инсулинорезистентности по индексу HOMA-IR, показатели углеводного и липидного обмена, перекисного окисления липидов, артериального давления.
5. Оценить устойчивость лечебного эффекта изученных комплексов по данным отдаленных результатов.
6. На основе сравнительного анализа клинической эффективности применения изученных комплексов и катамнестических данных разработать дифференцированные показания к их использованию.
Научная новизна. Впервые дано научное обоснование целесообразности применения в комплексном курортном лечении больных метаболическим синдромом питьевых минеральных вод ессентукского типа в сочетании с диетой с использованием подсластителя стевии, исследовано их действие на антропометрические показатели, массу тела, уровень инсулина и глюкозы в условиях стандартного теста толерантности к глюкозе, углеводный и липидный обмен, выраженность инсулинорезистентности по индексу HOMA- IR, уровень АД.
Установлено положительное влияние применения диеты с использованием стевии и минеральных вод на все изученные показатели. В работе показано преимущество комплексной терапии в сравнении с обычной диетой. Получена высокая клиническая эффективность предложенного метода лечения и стойкость положительного результата в отдаленный период.
Практическая значимость. На основании полученных данных разработана и предложена новая методика лечения больных метаболическим синдромом с применением питьевых минеральных вод Ессентуки № 4 и диеты с использованием подсластителя стевии. Данный метод позволяет расширить возможности немедикаментозного лечения больных с МС. Предложенный метод может быть рекомендован к применению, как в санаториях, так и во внекурортных условиях для достижения более высоких результатов лечения и их поддержания в отдаленный период.
Положения, выносимые на защиту:
1. Доказана целесообразность и эффективность применения в диете стевии в качестве подсластителя у больных метаболическим синдромом при комплексном курортном лечении.
2. Диета с применением стевии и минеральная вода Ессентуки № 4 способствуют достоверному улучшению антропометрических показателей, снижению массы тела, уровня инсулина, выраженности инсулинорезистентности по индексу HOMA- IR, нормализации и улучшению показателей углеводного, липидного обмена, перекисного окисления липидов, артериального давления.
3. По непосредственным и отдаленным результатам лечения комплексное применение минеральной воды Ессентуки № 4 и диеты с использованием подсластителя стевии оказалось более эффективным в сравнении с обычной диетой, где применялась сахароза.
Апробация работы. Материалы исследований доложены в ГНИИК г. Пятигорск (2010). Фрагменты работы доложены на Международном конгрессе «Здравница 2003 и 2006»; международном конгрессе «Состояние и охрана воздушного бассейна и водно-минеральных ресурсов курортно- рекреационного региона, Кисловодск, 2003; на научно-практической конференции «Отраслевые здравницы КМВ - трудящимся Минатома РФ» Ессентуки, 2003; на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ОАО «Санаторий Южное взморье», Сочи, 2004; научно-практической конференции «Актуальные вопросы практической медицины», Лермонтов, 2004; на юбилейной научно-практической конференции санатория Ессентуки ФСБ России «Проблемы современного медицинского образования и восстановительного лечения распространенных заболеваний», 2006, на 10-й научно-практической конференции врачей Карачаево-Черкесской республики с международным участием, 2012.
Внедрение результатов исследования. Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы эндокринологического отделения Ессентукской клиники ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агенства», санатория ОАО «Санаторий «Жемчужина Кавказа» г.Ессентуки.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано научных работ 9, из них 2 в журналах, рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 121 страницах, состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего источников 182 (отечественных и иностранных), иллюстрирована 31 табл. и 5 рис.
Фосфорилирование многоатомных фенолов
Доступность хиральных алкалоидов [1-15] позволило использовать их в качестве хиральных лигандов для получения металлокомплексов, катализаторов для асимметрического синтеза, хроматографических селекторов и хиральных агентов для спектроскопии ЯМР [1]. Хиральные металлокомплексы широко используются для получения оптически активных органических соединений. В ме-таллокомплексных катализаторах в качестве лигандов зачастую применяют фосфорорганические соединения. К новому поколению гетеробифункциональных лигандов принадлежат Р,]Ч-бидентатные производные [15, 16]. В обзорах и монографиях [15-22] проведён анализ применения хиральных Р,]Ч-бидентатных лигандов в металлокомплексном катализе. Р,]Ч-Бидентатные лиганды являются асимметрическими с точки зрения пространственной и электронной структуры, содержат два донорных центра (атомы фосфора и азота) и выступают как жёсткие, так и мягкие основания [15, 16].
Среди Р,1Ч-бидентатных лигандов центральное место принадлежит хираль-ным алкалоидам ряда хинина и цинхонина, которые нашли применение в качестве хиральных стационарных фаз в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), электролитических добавок и хиральных сольватирующих агентов [2]. Это обусловлено особенностями молекулярной структуры хинина (R = МеО) и цинхонина (R = Н) как главных компонентов цинхоновых алкалоидов. Их молекулы включают хинолиновую структуру и бициклическую винилзамещенную хинуклидиновую систему с третичным аминным атомом азота. В их молекулах имеются четыре хиральных атома углерода и один стереогенный атом азота. Диастереомеры хининовых алкалоидов (R = МеО) включают 8і?,9-хинидин а и 8,9і?-хинин b. Цинхоновые алкалоиды (R = Н) также представлены диастрео-мерными 8і?,9-цинхонином с и 8,9і?-пинхонидином d [3].
Известно несколько подходов к синтезу фосфорилированных производных хинина и цинхонина. О-Цинхонинфосфиниты со смешанными алкильными и арильными заместителями получают реакцией замещения диарилхлорфосфинов с цинхонином в суспензии тетрагидрофурана (ТГФ) в присутствии триэтиламина как акцептора выделяющегося хлористого водорода (20 С) [4].
Метод [4] усовершенствован при замене ТГФ на более безопасный метилен-хлорид в присутствии ди-шо-пропилэтиламина (20 С, 1.5-5 ч) с образованием дифенилфосфинитов 8і?,9-хинидина, 8,9і?-хинина, 8і?,9-цинхонина и SS,9R-цинхонидина [5]. Таким образом, этот метод [5] является более приемлемым для фосфорилирования стерически загруженных спиртов.
Другой подход к фосфорсодержащим хининовым и цинхониновым алкалоидам основан на реакции дифенилхлорфосфина с алкоксидами лития, полученным in situ при обработке бутиллитием 8і?,9-хинидина, 8,9і?-хинина, 8і?,9-цин-хонина и 8,9і?-цинхонидина [3]. Подчеркнём, что оптически активные дифенил-фосфиниты алкалоидов синтезированы с количественными выходами без образования побочных продуктов.
Оптически активное диарилфосфитное производное хинина получено в реакции хинина с ди(2,6-диметилфенил)хлорфосфитом в присутствии триэтиламина при кипячении в бензоле с выходом 87 % [8].
Для синтеза фосфатных производных хинина использована реакция хинина с дифенил- и диэтилхлорфосфатами в присутствии трет-бутоксид,а калия в ТГФ при-78 С (2 ч) [2].
Первые представители дитиофосфатных производных хинина и цинхо-нидина получены стереселективным дитиофосфорилированием О-мезилатов ал-калоидов под действием 0,0-диэтилдитиофосфорной кислоты по SN -механизму с полным обращением конфигурации С -стереогенного центра и образованием одного из возможных диастереомеров [1].
Отметим, что в научной литературе нет данных о синтезе фосфорсероор-ганических производных хинина на основе сульфидов фосфора. Между тем развитие этого направления может привести к созданию новых биологически активных соединений. Наряду с хинином и его аналогами другие алкалоиды (кодеин, эфедрин, цитизин, анабазин) использованы для получения фосфитных, амидофосфитных и тиофосфатных производных, перспективных в качестве пестицидов и лигандов в координационном синтезе и катализе [13, 14, 22-24].
Аммониевые соли кислот фосфора обладают широким спектром биологической активности, включая анальгетическую, антисептическую и фунгицидную активность [25]. Таким образом, развитие исследований по фосфорилированию хиральных алкалоидов открывает широкие перспективы для синтеза фосфорсодержащих производных, представляющих как фундаментальное, так и прикладное значение для стереохимии, исследования электронных эффектов и создания новых биологически активных веществ.
Методы тиофосфорилирования функционально-замещённых фенолов лежит в основе получения большинства тио- и дитиофосфатных пестицидов [26-32]. Поскольку введение атомов хлора в молекулы органических соединений приводит, как правило, к возрастанию их пестицидной активности, в реакции тиофосфорилирования введены хлорсодержащие фенолы. Реакция тетрафосфордекасуль 16 фида с фенолом, 4-хлорфенолом или 2-хлорфенолом в жёстких условиях (130-150 С) служит традиционным методом синтеза 0,0-диарилдитиофосфорных кислот, в том числе хлорсодержащих, превращенных в аммониевые и диаммониевые соли [28-30]. О-Арилтионофосфаты с фармакофорными группами в ароматическом заместителе (с алкокси-, диметил-, галоген-, дигалоген-, трифторметил-, ацетил-, ацетамидо-, карбометокси-, метиленодиокси-группами), проявляющие высокую инсектицидную активность, получают в реакции соответствующего фенола, гидроксида натрия и 0,0-диалкилхлортионофосфатов в ТГФ [28-30].
Дитиофосфорилирование моносахаридов
Замещение протонов в гидроксильных группах резорцина на два дитиофос-фонильных фрагмента подтверждено данными ИК спектров и спектров ЯМР Н. В ИК спектрах соединений (14а-д) отсутствует сильная широкая полоса поглощения гидроксильных групп в области v 3380 см" . В ИК спектрах соединений (14а-д) имеются характеристические полосы поглощения небольшой интенсивности в области v 2550-2530 см" , относящиеся к свободным валентным колебаниям связей S-H, тогда как в интервале v 2437-2430 см" расположены слабые полосы поглощения связанных валентных колебаний связей S-H (рисунок 8). Валентные колебания НО-группы арильного заместителя у атома фосфора бензол- 1,3-бис(0,0 -3 , 5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновой) кислоты (14а) проявляется в виде узкой средней по интенсивности полосы поглощения при v 3620 см" . Сильные полосы поглощения в области v 1149-1023 и 979-961 см" отнесены к валентным колебаниям связей (Р)О-С и О-С, соответственно. Валенные колебания связи P=S проявляются в виде полосы поглощения средней интенсивности в области v 694-624 см" .
В спектре ЯМР !Н бензол-1,3-бис(0,0 -3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифе-нилдитиофосфоновой) кислоты (14а) в CDCb имеются два интенсивных синглета при 8 1.47 и 1.50 м.д. метильных протонов 3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксильных заместителей (СНз)зС. Ароматические протоны 3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гидрокси-фенильных заместителей С ШОР соединения (14а) проявляются в виде двух дублетов при 8 7.83 и 7.92 м.д. (JPH 15.9 Гц). Метиленовые протоны у атома кислорода (фрагмент ОСН СН?) в спектре ЯМР Н в ацетоне-ёб бензол-1,3 46 бис(0,0 -4 -шо-амилоксифенилдитиофосфоновой) кислоты (14в) (рисунок 9) дают два триплета при 8 4.03 м.д. ( JHH 6.6 Гц) и 4.06 м.д. ( JHH 6.4 Гц). Атом углерода метиленоксильного фрагмента 00 продукта (14в) в спектре ЯМР С-{ Н} в ацетоне-ёб (рисунок 10) вступает в резонанс в виде двух синглетов при 8 8 68.00 м.д. и триплет в спектре ЯМР С ( JCH 143.1 Гц, рисунок 11). Квартет при 8 13.9 м.д. в спектре ЯМР С продукта (14д) относится к атомам углерода двух терминальных метильных групп СН3 бутоксильных заместителей ( JCH 125.5 Гц). Масс-спектр электронного удара бензол-1,3-бис(0,0 -3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гид-роксифенилдитиофосфоновой) кислоты (14а) содержит пик m/z 711, который соответствует его молекулярному иону [М] (вычислено М 711.0) (рисунок 12). Пик m/z: 638 в масс-спектре MALDI TOF бензол-1,3-бис(0,0 -4 -феноксифенил-дитиофосфоновой) кислоты (146) (матрица - 1,8,9-тригидроксиантрацен, бензол) относится к молекулярному иону [М] (вычислено М 63 8.7.).
Бисдитиофосфоновые кислоты (14а-в) были превращены в кристаллические диаммониевые соли (15а-в) при барботировании аммиака через растворы (бензол, 20-50 С, 0.5-1 ч, реакция 8) [114]. (15а), (156) и (15в) в спектрах ЯМР "P-jlT} в бензоле имеют синглетные сигналы при Sp 104.9, 108.8 и 108.3 м.д. соответственно. В ИК спектрах солей (15а-в) находятся сильные широкие полосы поглощения с центрами при v 3150-3421 см" валентных колебаний группы NH4 . В ИК спектре соли (15а) (рисунок 13) сохраняется узкая полоса поглощения валентных колебаний связи Н-0 ароматического заместителя при атоме фосфора. В спектре ЯМР 1Н соли (15а) в CDCI3 два дублета при 8 6.40 и 6.42 м.д. принадлежат протону центрального ароматического фрагмента С НО2Р2 ( Jmi 8.8 Гц). В масс-спектре МАЛДИ TOF диаммониевой соли бензол- 1,3-бис(0,0 -4 -феноксифенилдитиофосфоновой) кислоты (156) (матрица - никотиновая кислота, бензол) присутствует пик m/z 697 , образованный из молекулы соединения (156) путём присоединении к нему протона и иона натрия [М + Н + Na] . Два интенсивных дублета при 8 0.93 и 0.95 м.д. в спектре ЯМР ХН диаммониевой соли бензол-1,3-бис(0,0 -4 -шо-амилокси-фенилдитиофосфоновой) кислоты (15в) в ацетоне-ёб относятся к терминальным метильным протонам шо-амилокси-группы [фрагмент (СН3)2СН, JHH6.4 ГЦ].
Таким образом, бисдитиофосфоновые кислоты, полученные из резорцина, образуют соответствующие диаммониевые соли. Полученные соли перспективны для синтеза новых 8,8-диэфиров бисдитиофосфоновых кислот в реакциях замещения с органическими и элементоорганическими соединениями с лабильными связями Х-С1 (X = С, Si и т.п.), что может составить предмет отдельной диссертационной работы.
Ряд диаммониевых солей можно расширить, вводя в реакции с бисдитио-фосфоновыми кислотами первичные алкиламины. Среди которых мы выбрали н-гексадециламин (10), реакция которого с бисдитиофосфоновыми кислотами (14а,б) (бензол, 20 С, 1 ч) привела к соответствующим ди-н-гексадецилам-мониевым солям (16а,б) (реакция 9) [114]. з
Спектр ЯМР J1P-{ H} ди-н-гексадециламмониевой соли бензол-1,3-бис-(0,0 -3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновой) кислоты (16а) в бензоле содержит два сигнала при Sp 111.54 и 110.98 м.д. в соотношении 1:1. Химический сдвиг ди-н-гексадециламмониевой соли бензол-1,3-бис(0,0 -4 -фенок ті і сифенилдитиофосфоновой) кислоты (166) в спектре ЯМР Р-{ Н} в бензоле расположен при Sp 105.1 м.д. Полосы поглощения валентных колебаний в группе NH3 в ИК спектрах ди-н-гексадециламмониевых солей (16а,б) смещены в область низких частот (v 3321-3374 см" ) относительно полос поглощения валентных колебаний группы NH4 (v 3150-3421 см"1) диаммониевых солей (15а-в). Метильные протоны СН3СН2 в спектрах ЯМР !Н обеих солей (16а,б) в ацетоне-ёб проявляются в виде триплета при 8 0.81м.д. ( JHH 7.0 Гц). Мультиплеты при 8 2.89 м.д. [соединение (16а)] и 8 2.95 м.д. [продукт (166)] относятся к метиленовым протонам у атома азота (фрагмент CH7CH7.N).
Таким образом, структура резорцина как представителя 1,3-дигидроксибен-золов в реакциях дитиофосфорилирования под действием 2,4-диорганил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидов обусловливает образование стабильных бис-дитиофосфоновых кислот в отличие от дитиофосфорилирования 1,2-дигидрокси-бензолов. Полученные бисдитиофосфоновые кислоты в реакциях с аммиаком и н-гексадециламином превращены в соответствующие диаммониевые соли, представляющие интерес в качестве полупродуктов для синтеза 8,8-диэфиров бис-дитиофосфоновых кислот.
С целью расширения структурных вариаций бисдитиофосфоновых кислот в реакции с 1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидами мы ввели 2-метилрезорцин. S При этом следует выяснить, влияет ли метильный заместитель в положении 2 в молекулах 1,3-дигидроксибензолов на реакционную способность при дитиофос-форилировании 1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидами. Установлено, что 2,4-диарил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфиды (4а,б) реагируют с 2-метил-резорцином (17) в бензоле с образованием твёрдых 2-метилбензол-1,3-бис(0,0 -арилдитиофосфоновых) кислот (18а,б). Взаимодействие 2-метилрезорцина (17) с 2,4-бис(4-феноксифенил)-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидом (46) проходит при 20 С в течение 2 ч, в то же время для завершения реакции с 2,4-бис(3,5-ди-/72/?е/72-бутилфенил)-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидом (4а) потребовалось нагревание при 50 С в течение 1.5 ч (реакция 10) [112, 113]. сн3
Дитиофосфонирование резорцина и 2-метилрезорцина
При сравнении параметров спектров ЯМР Н в ацетоне-ёб установлено, что сигналы протонов дитиофосфоновой кислоты (37а), полученной из a-D-глюкофу-ранозы, смещены в область высокого поля, чем химические сдвиги аналогичных групп протонов кислоты (34а) на основе a-D-аллофуранозы. Сигнал метинового протона фрагмента С Н аллофуранозного производного (34а) находится при 8 4.17 м.д., тогда как сигнал аналогичного протона С Н кислоты (37а) на основе а-D-глюкофуранозы расположен в более высоком поле (8 4.31 м.д.). Ароматические протоны РСС Нг соединения (34а), синтезированного из a-D-аллофуранозы, дают два дублета при 8 7.72 и 7.78 м.д. ( JPH 16.7 и 15.1 Гц, соответственно), в то же время аналогичные протоны глюкофуранозного производного (37а) прояв-ляются в виде 4-х дублетов при 8 7.80, 7.83, 7.84 и 7.87 м.д. ( JPH 15.6, 15.2, 15.2 и 14.7 Гц, соответственно). Таким образом, условия дитиофосфонирования диацето-нидов изомерных a-D-аллофуранозы и a-D-глюкофуранозы практически одинаковы, имеются небольшие различия в параметрах спектров ЯМР ХН полученных на их основе оптически активных дитиофосфоновых кислот.
В этой связи представляет важное значение с точки зрения стереохимии элементоорганических соединений провести сравнительный анализ спектральных данных описанной выше н-гексадециламмониевой соли 0-[1,2:5,6-ди-0-шо-про-пилиден-а-1)-аллофураноза-3-ил]-3,5-ди-/77/?е/77-бутил-4-гидроксифенилдитиофос-фоновой кислоты (35а) (см. реакцию 20) со стереоизомерной н-гексадециламмониевой солью (38), которую мы получили в реакции 0-[1,2:5,6-ди-0-мзо-про-пилиден-а-1)-глюкофураноза-3-ил]-3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гидроксифенилдитио-фосфоновой кислоты (37а) с н-гексадециламином (10) в бензоле при 20 С в течение 2 ч (реакция 22) [115, 116].
Химический сдвиг н-гексадециламмониевой соли дитиофосфоновой кис 11 1 лоты (38), полученной из a-D-глюкофуранозы, в спектре ЯМР Р-{ Н} в бензоле находится в более высоком поле (8р 103.3 м.д.) относительно сигналов соли (35а) (8р 113.0 и 111.3 м.д. в соотношении 1:1), синтезированной на основе a-D-аллофу-ранозы. Смещение сигналов протонов циклических фрагментов в сторону высокого поля наблюдается в спектре ЯМР 1Я в CDC13 н-гексадециламмониевои соли 0-[1,2:5,6-ди-0-мзо-пропилиден-а-Л-глюкофураноза-3-ил]-3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновой кислоты (38) по сравнению с химическими сдвигами аналогичных протонов соли (35а), полученной из a-D-аллофуранозы (рисунок 23). Дублет при 8 4.47 м.д. (JHH2.8 ГЦ), соответствующий метиновому протону С Н соли (38), сдинут в высокое поле по сравнению с сигналом протона соединения (35а) (8 4.26 м.д.). Сходная картина обнаружена и в случае сигналов протонов С Н [8 5.00 и 4.49 м.д. для солей (38) и (35а), соответственно] и С Нг [8 5.88 и 5.75 м.д., соответствующие соединениям (38) и (35а)]. В спектре ЯМР с-гщ соли (38) в CDC13 атом углерода фрагмента РОС Н проявляется в виде двух дублетов при 8 73.5 м.д. ( JQP 18.3 Гц) и 75.4 м.д. ( Jcp22.7 Гц), которые в спектре ЯМР С принимают вид дублетов дублетов ( JCH 173.1 и 177.1 Гц. соответственно). Протоны терминальной метильной группы н-гексадецильного заместителя дают синглет в спектре ЯМР 0-(} (квартет в спектре ЯМР 1JC) соли (38) при 8 14.1 м.д. («/Сн 124.7 Гц), в то же время атом углерода метиленового фрагмента у атома азота NCH2 приводит к триплету (соответственно - син 75 глету в спектре ЯМР С) при 8 40.3 м.д. ( JQH 122.0 Гц). Дублет (синглет в спектре ЯМР С) при 8 67.7 м.д. соответствует двум атомам диоксафосфоланового цикла (фрагмент НС5-С6Н, VCH 153.3 Гц).
Таким образом, использование ацетоновой защиты протонов гидроксиль-ных групп a-D-аллофуранозы и a-D-глюкофуранозы в положениях 1,2 и 5,6 фура-нозного цикла в реакциях дитиофосфонирования под действием 2,4-диорганил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидов является эффективным подходом к синтезу оптически активных дитиофосфоновых кислот и их аммониевых солей с длинноцепными алкильными заместителями, содержащими фармакофорные моносахаридные группы.
Серию дитиокислот фосфора с моносахаридными группами можно дополнить при дитиофосфонировании других моносахаридов ряда сахарных спиртов (альдитов). Среди них можно отметить D-маннит в качестве шестиатомного спирта. В литературном обзоре показано, что в реакции маннита с триамидо-фосфитами образуется бис(бициклофосфиты) [68]. Однако эта реакция протекает с участием всех 6 гидроксильных групп. Можно предположить, что дитиофос-фонирование D-маннита под действием 1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфи-дов, которое до нашей работы изучено не было, могло бы проходить с участием нескольких гидроксильных групп и привести, на наш взгляд, к образованию сложной смеси продуктов. Учитывая результаты дитиофосфонирования a-D-алло-фуранозы и a-D-глюкофуранозы в виде их диацетонидных производных (см. реакции 19 и 21), мы решили ввести D-маннит в реакцию с 1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидами в форме его дициклогексилиденового производного. Две гид-роксильные группы у атомов углерода С и С в молекуле оптически активного 1,2:5,6-ди-0-циклогексилиден-і маннита (39) остаются свободными. В связи с этим можно ожидать, что реакция гликоля (39) с /w/аднорасположением двух гидроксильных групп с 2,4-диарил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидами будет проходить подобно реакциям с другими /72/%шогликолями, например, (2 ,35)-(+)-диметилтартратом [59, 60], этамбутолом [27] и іі-пинандиолом-3,4 [61]. Для проведения реакции 2,4-диарил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфидов (4а,б) с 1,2:5,6-ди-0-циклогексилиден-і маннитом (39) мы использовали мягкие условия (бензол, 20-40 С, 1-2 ч) (реакция 23). В результате проведения реакции 23 выделены оптически активные Л-1,2:5,6-бис(циклогексилидендиокси)-гексан-3,4-бис(арилдитиофосфоновые) кислоты (40а,б) {для соединения (40а) [а] D +2.8 (с 0.72, СбНб)}, химические сдвиги которых в спектрах ЯМР Р-{ Н} в бензоле смещены в сторону низкого поля (8р 90.9-87.6 м.д.), как и сигналы других бисди-тиофосфоновых кислот [27, 59-61]. В ИК спектре Л-1,2:5,6-бис(циклогексилиден-диокси)-гексан-3,4-бис(3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновой) кислоты (40а) в таблетке КВг имеются две слабые полосы поглощения при v 2353 и 2322 см" , относящихся к валентным колебаниям связей S-H (рисунок 24) [115, 116].
Синтез исходных соединений и очистка растворителей
Ряд полученных дитиокислот фосфора и их аммониевых солей испытаны на антимикробную активность на тест-культурах патогенной и условно-патогенной микрофлоры музейных штаммов Staphylococcus aureus (АТСС 29213), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), Bacillus cereus и Candida albicans (ATCC 885-653) кафедры микробиологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России кандидатом биологических наук, доцентом Шулаевой М.П. (заведующий кафедрой микробиологии, доктор медицинских наук, профессор Поздеев O.K.) методом лунок в дим етил сульфоксиде (ДМСО) [136, 137] (таблица 3, приложение). В качестве контроля использовали ДМСО, относительно которого установлено увеличение зоны ингибирования роста культуры микроорганизмов по отношению к практически всем испытанным микробам. Наиболее высокую антимикотическую активность относительно Candida albicans проявили гидрохлорид 4-(имидазол-1-ил)-3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновой кислоты (13) (28 мм), аммониевая соль 0-[4-(1//-пиррол-1-ил)фенил]-3 ,5 -ди-/77/?е/77-бутил-4 -гид-роксифенилдитиофосфоновой кислоты (9) (26 мм) и 0-[4-(1Я-пиррол-1-ил)фенил]-3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновая кислота (7а) (26 мм). Испытанные соединения эффективно подавляют рост бактерий Bacillus cereus и Staphylococcus aureus. Таким образом, изученные дитиокислоты фосфора и их соли наибольшую активность проявляют, в основном, в отношении грам-положительных бактерий и грибов рода Candida.
Методом разведений в питательных средах определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) полученных дитиокислот фосфора и их аммониевых солей в ФГБУН Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН младшим научным сотрудником лаборатории химико-биологических исследований Волошиной А.Д. (заведующий лабораторией химико-биологических исследований, доктор медицинских наук, профессор Зобов В.В.) (таблица 4). Установлено, что н-гексадециламмониевые соли 0-[1,2:5,6-ди-0-изопропилиден-а-1)-аллофураноза-3-ил]-4 -феноксифенил-дитиофосфоновой кислоты (356) и і 1,2:5,6-бис(циклогексилидендиокси)-гексан-3,4-бис(4 -феноксифенилдитиофосфоновой) кислоты (41) избирательно действуют на грампожительные бактерии Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р и Bacillus cereus NCTC 8035. В отношении Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р н-гексадецил-аммониевая соль О-[ 1,2:5,6-ди-0-изопропилиден-а-і аллофураноза-3-ил]-4 -фе-ноксифенилдитиофосфоновой кислоты (356) в 5 раз (МИК 12.5 мг/л), а н-гексадециламмониевая соль D-1,2:5,6-бис(циклогексилидендиокси)-гексан-3,4-бис(4 -феноксифенилдитиофосфоновой) кислоты (41) (МИК 25.0 мг/л) в 3 раза превосходят по антимикробной активности антибиотик хлорамфеникол (МИК 62.5 мг/л). В отношении Bacillus cereus NCTC 8035 эти соли слабоактивны (МИК по 250 мг/л).
Фунгицидная активность бисдитиофосфоновых кислот и их диаммониевых солей на основе резорцинов оценена по отношению к спорам плесневых грибов Aspergillus spp. и Penicillium spp. методом посева на твёрдые питательные среды кандидатом биологических наук, ассистентом кафедры биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Тазетдиновой Д.И. (заведующая кафедрой биохимии и биотехнологии, доктор медицинских наук, профессор Алимова Ф.К.). Для прорастания конидий микромицетов грибов приготовлена агаризованная среда Чапека [138, 139], в которую добавлены бензол-1,3-бис(0,0 -3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифенилдитиофосфоновая) кислота (14а), диаммо-ниевая соль бензол- 1,3-бис[этокси-2-(3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидроксифенилди-тиофосфоновой)] кислоты (23а) и диаммониевая соль бензол-1,3-бис[этокси-2-(4 84
Найдено, что при концентрации веществ 1 мг/мл испытанные соединения оказывают влияние на микромицеты с различной интенсивностью. Также их активность по-разному проявляется в зависимости от рода микромицета. Наибольшей активностью по отношению к грибам родов Aspergillus spp. и Penicillium spp. (количество проросших конидий менее 20 %) обладают диаммониевые соли бензол- 1,3-бис[этокси-2-(3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидрокси-фенилдитиофосфоновой)] кислоты (23а) и бензол-1,3-бис[этокси-2-(4 -фенокси-фенилдитиофосфоновой) кислоты (236) (рисунок 25).
Развитие синтетического аспекта химии дитиокислот фосфора и их аммониевых солей, содержащих фармакофорные группы, может привести к созданию ряда антимикробных препаратов, введению которых в эксплуатацию должно предшествовать выявление их токсичности. Для оценки токсичности синтетических органических соединений проводятся исследования на мутагенные и токсические свойства [139-143]. Изучение мутагенных и токсических свойств полученных на основе резорцинов бисдитиофосфоновых кислот (14а), (146), (22а) и (226) и их диаммониевых солей (23а) и (236) проводили кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Маргулис А.Б. и аспирант Захаров И.С. (заведующая кафедрой микробиологии, доктор биологических наук, профессор Ильинская О.Н.).
Исследование бензол-1,3-бис(0,0 -3 ,5 -дитретбутил-4 -гидроксифенилди-тиофосфоновой) кислоты (14а), бензол-1,3-бис(0,0 -4 -феноксифенилдитиофос-фоновой) кислоты (146), бензол-1,3-бис[этокси-2-(3 ,5 -ди-/72/?е/72-бутил-4 -гидрок-сифенилдитиофосфоновой)] кислоты (22а) и бензол-1,3-бис[этокси-2-(4 -фенокси-фенилдитиофосфоновой)] кислоты (226) на мутагенные эффекты в классическом тесте Эймса без метаболической активации [140, 143] (рисунок 26) на тестерном штамме Salmonella typhimurium ТА 100 показало, что ни одно из изученных соединений ни в одной из исследуемых концентраций не вызывало мутагенных эффектов, о чем судили по отсутствию превышения числа колоний-ревертантов в опытных образцах над негативным контролем. В то же время, обнаружено, что бисдитиофосфоновые кислоты (226) и (146) в разведениях 1:1 и 1:2 не давали колоний-ревертантов, либо их число было очень низким. В разведении 1:10 число ревертантов для этих соединений также было значительно ниже, чем в контроле. Это предположительно может быть связано с тем, что бисдитиофосфоновые кислоты (226) и (146) обладают токсическими эффектами по отношению к Salmonella typhimurium ТА 100, растущей на бедной питательной среде, используемой в тесте Эймса.
