Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Роль эпифиза в механизмах старения и развития возрастной патологии 16
1.1.1. Роль эпифиза в организме 16
1.1.2. Влияние нарушения циркадианных ритмов на старение и развитие возрастной патологии 22
1.2. Роль мелатонина в механизмах старения и развития возрастной патологии 33
1.2.1. Мелатонин: физиологическая роль в организме 33
1.2.2. Возрастные изменения уровня мелатонина 50
1.2.3. Геропротекторный эффект мелатонина 51
1.2.4. Антиканцерогенный эффект мелатонина 54
1.3. Пептидные препараты эпифиза и их влияние на старение и развитие
возрастной патологии 57
1.3.1. Пептидные препараты эпифиза (эпиталамин, эпиталон) 57
1.3.2. Влияние пептидных препаратов эпифиза на физиологические функции организма 63
1.3.3. Влияние пептидных препаратов эпифиза на продолсисителъностъ
жизни 69
1.3.4. Влияние пептидных препаратов эпифиза на развитие опухолей 72
Глава 2. Материалы и методы исследования 75
2.1. Животные 75
2.2. Препараты 75
2.3. Схема эксперимента 75
2.4. Методы изучения параметров гомеостаза 79
2.4.1. Физиологические (неинвазивные) методы исследования 19
2.4.1.1. Оценка динамики массы тела 79
2.4.1.2. Оценка потребления корма и воды 80
2.4.1.3. Изучение поведенческих, психоэмоциональных и когнитивных функций 80
2.4.1.4. Изучение физической работоспособности 81
2.4.1.5. Исследование мочи 83
2.4.1.6. Изучение показателей репродуктивной функции 83
2.4.1.7. Рентгенография 84
2.4.2. Биохимические методы исследования крови 84
2.4.2.1. Определение показателей углеводного, жирового, белкового и электролитного обмена 84
2.4.2.2. Определение гормонов в сыворотке крови 87
2.4.3. Биохимические методы исследования тканей и органов, 92
2.4.3.1. Изучение интенсивности сеободнорадикалъных процессов 92
2.4.3.2. Определение содержания общего белка 94
2.4.4. Патоморфологические методы исследования 94
2.4.5. Оценка продолжительности жизни и темпа старения 96
2.5. Статистическая обработка результатов исследования , 96
Глава 3. Результаты собственных исследований 97
3.1. Возрастная динамика показателей биологического возраста и возрастной патологии у крыс, находящихся в различных условиях освещения 97
3.2. Исследование показателей биологического возраста, возрастной патологии и спонтанного канцерогенеза у крыс, получающих мелатонин и эпиталон в различных режимах освещения 149
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 233
4.1. Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию 233
4.2. Влияние мелатонина и эпиталона на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию в различных световых режимах 284
Заключение 329
Выводы 331
Список литературы 334
- Влияние нарушения циркадианных ритмов на старение и развитие возрастной патологии
- Определение показателей углеводного, жирового, белкового и электролитного обмена
- Возрастная динамика показателей биологического возраста и возрастной патологии у крыс, находящихся в различных условиях освещения
- Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию
Введение к работе
Актуальность проблемы Прогресс медицины и ее успешное развитие в экономически развитых странах приводит к постепенному увеличению средней продолжительности жизни и, в силу этого, к прогрессивному старению населения [Анисимов В.Н., 2003; Rajaratnam S.M.W., Arendt J., 2001]. Непрерывное увеличение продолжительности жизни является одной из причин увеличения доли пожилых в общей численности населения [Arking R., 1991]. Это приводит к увеличению общественного и научного интереса к проблемам теоретической и экспериментальной геронтологии [Khavinson V.Kh., 2002]. Основная задача геронтологии и гериатрии - сделать жизнь пожилых людей более здоровой и активной - становиться все более актуальной. Изучение структурно-функциональной организации и механизмов регуляции систем жизнеобеспечения в норме и при развитии процесса старения является одной из проблем фундаментальной геронтологии pilmanV.M., 1994].
Ряд вопросов о механизмах старения в различных условиях, под действием различных стрессорных факторов можно исследовать, только проводя экс- • перименты на животных. Лабораторные животные, как модельные системы для изучения старения, возрастной патологии у людей и для разработки подходов к лечению, имеют большое значение [Каркищенко Н.Н., 2004].
Различные стрессорные воздействия могут привести к увеличению продолжительности жизни или к ее сокращению. Одним из регуляторов физиологических ритмов у человека и животных является смена циркадианного цикла дня и ночи. Установлено, что воздействие света ночью напрямую связано с серьезными проблемами поведения, а также с состоянием здоровья и развитием злокачественных новообразований [Хавинсон В.Х., и др., 2003; Di Lorenzo L. et al., 2003; Ha M., Park J., 2005; Anisimov V.N., 2006]. Эксперименты на плодовых мушках показали, что воздействие постоянного освещения приводит к уменьшению продолжительности их жизни. У грызунов ночное освещение приводит к нарушению овуляторного цикла и к последующему развитию опухолей в молочной железе, яичниках и матке [Анисимов В.Н., 2003; Prata Lima M.F. et al., 2004; Filipski E. et al., 2005]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о повышенном риске развития рака молочной железы и толстой кишки у работников ночных смен и о сниженном риске у слепых женщин [Rafhsson V. et al., 2001; Pukkala E. et al., 2002; Reynolds P. et al., 2002; Schernhammer E.S. et al., 2003]. В настоящее время воздействию светового загрязнения (включенного освещения ночью) подвергается довольно большое число людей. Вот почему становиться актуальным экспериментальные исследования, выясняющие роль нарушения светового режима в процессе старения и канцерогенеза.
На Северо-Западе России (в условиях Карелии) наблюдается своеобразный фотопериодизм, проявляющийся длинным световым днем в весеннелетний период (с середины мая до середины июля - сезон «белых ночей») и короткой продолжительностью дня в осенне-зимний период (4,5 часов). Модифицирующее действие постоянного освещения на физиологические процессы организма описано многими исследователями [Солонин Ю.Г., 1998; Анисимов В.Н. и др., 2003; Батурин Д.А. и др., 2004; Van der Beek Е.М., 1996; Wehr T.A., 2001; Stevens R.G., 2006]. Однако влияние сезонных колебаний освещенности, как естественного нарушения циркадианного ритма, изучено недостаточно.
Разработка новых геропротекторов, способных задержать старение всего организма или наиболее важных органов и систем, и исследование их влияния на возрастные гормонально-метаболические и иммунологические изменения является одним из актуальных направлений в геронтологических исследованиях. В связи с этим встает вопрос о безопасности длительного применения средств продления жизни, что включает в себя не только непосредственные побочные и токсические эффекты, но и отдаленные последствия, например, развитие новообразований. В ряде работ показано, что геропротекторы обладают антиканцерогенными свойствами, однако при длительном применении некоторых из них наблюдается увеличение частоты развития опухолей [Анисимов B.H., 2003]. Поэтому актуальным является всестороннее комплексное изучение действия геропротекторов в эксперименте, позволяющее оценить их действие на процессы старения, развитие возрастной патологии и новообразований.
К наиболее перспективным геропротекторам относят препарат мелатонин (МЛТ) и пептид эпиталон (ЭПТ), регулирующий функцию эпифиза [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001; Анисимов В.Н., 2003]. Известно, что с возрастом наблюдается снижение уровня индольного гормона эпифиза МЛТ в организме [Raitier M.N., 1992; Arendt J., 2005; Anisimov V.N., 2006; Di Bella L., Gvalano L., 2006], что вызывает большой интерес к изучению этого гормона, обладающего разнообразными эффектами. Во многих работах при использовании МЛТ отмечено увеличение продолжительности жизни [Pierpaoli W., Regelson W., 1994; Mocchegiani E. et al., 1998], тогда как в других опытах наблюдалось отсутствие увеличения продолжительности жизни и возрастание частоты опухолей [Романенко В.И., 1983]. Применение МЛТ угнетает канцерогенез у пинеалэктомированных крыс или животных, содержащихся в стандартном чередующемся или постоянном режиме освещения [Baturin D.A. et al., 2001]. Представленные данные предполагают возможность использования МЛТ в качестве препарата для профилактики развития злокачественных новообразований у людей, подвергающихся световому загрязнению.
Синтетический пептид ЭПТ [Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003], стимулирующий продукцию МЛТ, обладает способностью увеличивать среднюю и максимальную продолжительность жизни и замедлять темп старения у плодовых мух. У мышей разных линий ЭПТ оказывает неоднозначное действие [Попович И.Г., 2004]. Действие ЭПТ на крыс в сочетании с различными световыми режимами ранее не изучалось. Исследование геропротекторных свойств МЛТ и ЭПТ в различных световых режимах, включая и естественное освещение на Северо-Западе России (Карелия), в сравнительном аспекте является весьма актуальным.
Длительное наблюдение за лабораторными животными позволяет оценить динамику различных маркеров биологического возраста, процесс развития возрастной патологии и опухолей, а также изучить влияние различных световых режимов и исследуемых препаратов на старение и спонтанный канцерогенез. Биомаркерами возраста и гомеостаза в исследованиях часто служат такие показатели, как масса тела, количество потребляемого корма, поведенческие тесты, физическая работоспособность, репродуктивная функция, уровень свободнорадикальных процессов и многие биохимические параметры (уровень гормонов, состояние углеводного и жирового обменов и др.) [Анисимов В.Н., 2003]. В качестве интегрального показателя темпа старения используют динамику выживаемости и смертности животных.
Следует отметить, что исследования с комплексным использованием этих критериев, наряду с известными показателями интенсивности канцерогенеза (частота опухолей, латентный период и др.) при изучении влияния такого стрессирующего фактора как нарушение светового режима, в том числе и сезонного колебания освещенности на Северо-Западе России, и применения геропротекторов (мелатонина и эпиталона) не проводились.
Цель исследования Целью диссертационного исследования явилось комплексное сравнительное изучение длительного влияния различных световых режимов (стандартный чередующийся режим, постоянное освещение, естественное освещение Северо-запада России, постоянная темнота) в сочетании с применением геропротекторов (мелатонина и эпиталона) на показатели биологического возраста, развитие возрастной патологии и спонтанный канцерогенез у самцов и самок крыс, а также оценка темпов старения организма и развития ассоциированных с возрастом различных патологических процессов.
Задачи исследования В соответствии с указанной целью были сформулированы и последовательно решены следующие задачи:
1. Изучить влияние различных световых режимов (стандартный освещение, постоянное освещение, естественное освещение Северо-Запада России, постоянная темнота) на биомаркеры гомеостаза и старения, развитие возрастной патологии, показатели продолжительности жизни и спонтанный канцерогенез у крыс.
2. Сравнить темпы изменения биомаркеров гомеостаза и старения, показателей продолжительности жизни, развития возрастной патологии у крыс при различных световых режимах.
3. Оценить влияние экзогенного мелатонина на продолжительность жизни, показатели гомеостаза и биологического возраста, а также на развитие спонтанных опухолей у крыс при различных световых режимах.
4. Оценить влияние эпиталона на продолжительность жизни, показатели гомеостаза, биологического возраста и развитие спонтанных опухолей у крыс при различных световых режимах.
5. Провести сравнительный анализ эффективности мелатонина и эпиталона в различных световых режимах и оценить перспективы их дальнейшего изучения в качестве средств профилактики преждевременного старения и предупреждения новообразований у человека в условиях светового загрязнения.
Научная новизна исследования Соответственно поставленным задачам в диссертационной работе впервые установлено, что в условиях модулированного фотопериодизма (постоянное освещение, естественное освещение Карелии, постоянная темнота) у крыс возникают нарушения функционирования основных систем организма, сопровождающиеся более ранним развитием возрастной патологии по сравнению с особями, находящимися в стандартном чередующемся режиме освещения.
Впервые изучено влияние различных световых режимов на показатели гомеостаза и биологического возраста (потребление корма и воды; масса тела; диурез; эстральный цикл; поведенческие реакции; физическая и умственная работоспособности; уровень свободнорадикальных процессов в тканях; биохимические показатели зкирового, углеводного и белкового обменов; гормональный
статус), развитие спонтанных опухолей и продолжительность жизни у крыс.
В работе впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о неблагоприятном действии естественного освещения Карелии («белые ночи» в летний период и удлиненная темновая фаза в осенне-зимний период) на показатели гомеостаза, продолжительность жизни и риск развития спонтанных опухолей.
Впервые изучено влияние экзогенного мелатонина и синтетического пептида эпиталона на биомаркеры старения и гомеостаза, продолжительность жизни и возникновение спонтанных опухолей у крыс, содержащихся в различных световых режимах.
Впервые проведена комплексная оценка эффективности применения мелатонина и эпиталона на показатели старения и гомеостаза, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у самцов и самок крыс при различных режимах освещения.
Научно-практическая значимость работы Метод комплексной оценки влияния различных режимов освещения и применения препаратов (мелатонина и эпиталона) на старение, показатели гомеостаза, развитие возрастной патологии и спонтанного канцерогенеза является достаточно адекватным и оптимальным, что позволяет экстраполировать полученные результаты на человека.
Выявленные закономерности следует учитывать при идентификации факторов риска ускоренного старения, преждевременного развития возрастной патологии, возникновения и развития доброкачественных и злокачественных новообразований, а также для разработки научно-обоснованных мер их профилактики.
Применение мелатонина и эпиталона замедляет возникающее полиорганное снижение функциональных резервов организма, проявляющееся снижением толерантности к стрессорным воздействиям, и снижает риск возникновения спонтанных опухолей, что свидетельствует о глубокой связи механизмов старения и канцерогенеза.
Выявление геропротекторного эффекта и антиканцерогенных свойств мелатонина и эпиталона у животных, содержащихся в условиях нарушенного светового режима, свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этих препаратов в качестве средств профилактики ускоренного (преждевременного) старения и рака в группах повышенного риска (лица, проживающие в северных районах России или работающие при инвертированном освещении).
Положения, выносимые на защиту
1. Содержание самцов и самок крыс в условиях постоянного освещения сопровождается ускоренным старением многих функциональных систем и организма в целом, развитием возрастной патологии и спонтанных опухолей, уменьшает продолжительность жизни.
2. Содержание самцов и самок крыс в условиях световой депривации тормозит возрастные изменения большинства показателей биологического возраста и старения, снижает риск развития опухолей и увеличивает продолжительность жизни.
3. Содержание в условиях естественного режима освещения Карелии проявляется у самцов и самок крыс неблагоприятным влиянием на биомаркеры старения и гомеостаза, увеличением риска развития опухолей и уменьшением продолжительности жизни.
4. Применение препаратов эпифиза (мелатонина и эпиталона) оказывает защитный эффект, уменьшает неблагоприятное влияние постоянного освещения, улучшает показатели гомеостаза, замедляет процессы старения и увеличивает продолжительность жизни.
5. Пептидный препарат эпифиза эпиталон обладает более выраженными геропротекторными и антиканцерогенными свойствами, чем мелатонин, в условиях нарушенного светового режима, и является перспективным препаратом для исследования в геронтологии и для практического применения в гериатрии, в частности, для коррекции нарушений гомеостаза, возникающих в условиях нарушенного фотопериодизма.
Публикации Основные научные результаты диссертационной работы опубликованы в печатных работах (61 работа). Из них в периодических изданиях, выпускаемых в РФ, рекомендованных ВАК Минобразования России для публикации результатов по диссертациям на соискание ученой степени доктора наук, опубликовано 27 работ. Все результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях.
Работа поддержана грантами РФФИ 2004-2006 № 04-04-49168-а «Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни, возрастную патологию и их фармакологическая коррекция»; РГНФ 2004-2006 № 04-06-00120а «Белые ночи на Европейском Севере - как фактор, нарушающий функцию репродуктивной системы. Возможности фармакологической коррекции»; РГНФ-Север 2004-2006 №04-06-49602 а/с «Модельное исследование адаптационных возможностей организма при изменении циркадианных ритмов в течение годового цикла при проживании в северных климатогеографических зонах»; РФФИ-Север 2005-2007 №05-04-97525-р_север_а «Экспериментальные основы влияния освещенности на гормональный статус и некоторые биохимические показатели в условиях Карелии»; РФФИ 2007-2009 №07-04-00546 «Влияние возраста на динамику адаптационных изменений активности ферментов к различным световым режимам и их фармакологическая коррекция»; РГНФ-Север 2007-2009 № 07-06-42602а/С «Белые ночи на Русском Севере - как фактор, нарушающий возрастную адаптацию водно-солевого обмена. Возможности фармакологической коррекции».
Апробация диссертации Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных форумах: Ш, V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (СанктПетербург, 2003; 2007); Ш Международной научной конференции "Состояние биосферы и здоровье людей" (Пенза, 2003); П Международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (Москва, 2004); 11-15 Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2004; 2005; 2006, 2007, 2008); VI международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2004); V международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005) ХШ международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Международный симпозиум «Жизнь и работа на Севере» (Костомукша, 2003); 10 симпозиум «Витамины и адаптация» (Йена, Германия, 2005); 4 Интернациональное совещание «Психоэмоциональные, поведенческие и когнитивные расстройства у пожилых - ABCDE» (Болонья, Италия, 2006); 14 Европейский биогеронтологический конгресс (Москва, 2006); Международной конференции «Погода и биосистемы» (СПб, 2006); Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); Конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи, 2006); V и VI Европейском конгрессе по старению (Австрия, 2006; Санкт-Петербург, 2007); ХП Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007); Международном конгрессе «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» (СанктПетербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «50 лет мелатонину: итоги и перспективы исследований» (Санкт-Петербург, 2008), Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2007,2008).
Структура и объем диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Объем работы составляет 373 страницы. Список литературы содержит 401 источник, в том числе 155 отечественных и 246 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 70 таблицами и 79 рисунками.
Влияние нарушения циркадианных ритмов на старение и развитие возрастной патологии
Чередование циркадианного цикла дня и ночи - важный регулятор физиологических ритмов у живых организмов [Young M.W., Kay S.A., 2001; Bell-Reppert S.M., Weaver D.R., 2002; Roeniieberg Т., Merrow M., 2003; Pedersen D. et al., 2005]. После введения искусственного света изменились как световой режим, так и продолжительность воздействия света на человека. Воздействие света в ночное время стало существенной частью современного образа жизни. С этим связано множество серьезных расстройств поведения и здоровья, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак [Reiter R.J., 2002; Anisimov V.N., 2003; Knutsson А., 2003; На М., Park J., 2005; Jasser S.A. et al, 2006]. Согласно гипотезе «циркадной деструкции», свет ночью подавляет ночную секрецию мелато-нина в эпифизе и нарушает эндогенный циркадный ритм [Stevens R.G., 2006]. Важно отметить, что старые животные более чувствительны к изменениям фотопериода, чем молодые [Anisimov V.N., 2003]. Согласно данным эпидемиологических исследований установлено, что увеличивающееся световое загрязнение ответственно за рост заболеваемости раком молочной железы (МЖ) и толстой кишки [Davis S. et al., 2001; Hansen J., 2002; Schernliammer E.S. et al., 2003; Schemliammer E.S., Hankmson S.E., 2005; Stevens R.G., 2006].
В адаптации организма к периодическим изменениям окружающей среды циркадианные ритмы играют существенную роль. Циркадная система включает в себя три ключевых компонента: эндогенные «часы», генерирующие циркадный ритм; афферентный путь, определяющий циркадный ритм в соответствии с астрофизическим днем; и эфферентный путь, распределяющий сигналы по периферическим органам [Korf H.W. et al., 2003]. В 2002 г. была обнарулсена до этого еще неизвестная функция клеток нервного узла сетчатки глаза — регуляция реакций, не связанных с визуальным световым ответом: реакция поведения на свет, синтез эпифизарного мелатонина и латентный период засыпания [Berson D.M. et al., 2002; Panda S. et al., 2005]. Эти нейроны соединяются с СХЯ гипоталамуса [Арушанян Э.Б., 2005]. Молекулярный часовой механизм в СХЯ составлен из взаимодействующих положительной и отрицательной обратных связей регулирующих петель основных циркадных «часовых» генов [Reppert S.M., Weaver D.R., 2002; Korf H.W. et al., 2003; Reddy A.K. et al., 2005], которые регулируют функции клеток, контролирующих экспрессию генов ключевого клеточного цикла деления и генов апоптоза [Fukuhara С, 2004]. Хотя циркадианные ритмы генерируются эндогенно, они не функционируют изолированно от окружения, а подстраиваются внешними сигналами, предупреждая естественные временные вариации часовых генов Clock и Email. Клетки центральной части СХЯ получают иннервацию непосредственно от сетчатки глаз [Reppert S.M., Weaver D.R., 2002] и экспрессируют c-fos, Perl и Рег2 в ответ на сдвигающие фазу световые импульсы. В этих клетках ритмическая экспрессия Per J и Рег2 отсутствует или эти гены экспрессируются в противо-фазе к их экспрессии в наружной части СХЯ [Fu L., Lee С.С., 2003]. Центральные нейроны СХЯ осциллируют в ответ на световой сигнал, и хотя их пульсация увеличивается в нейронах СХЯ, свет индуцирует экспрессию часовых генов в СХЯ только в ночное время [Reppert S.M., Weaver D.R., 2002]. Электролитическое разрушение СХЯ нарушает большинство циркадианных ритмов организма [Reppert S.M. et al., 1981]. В ряде работ приводятся данные, свидетельствующие о возрастной деструкции нейронов СХЯ, снижении их электрической активности или нарушении ритма и уменьшении числа рецепторов к мелатони-ну [Hofman М.А., Swaab D.F., 1994; Watanabe A. et al., 1995; Zhou J.N. et al., 1995; Dubocovich M.L. et al., 1998], снижении амплитуды и длины периодов циркадианных ритмов [Анисимов В.Н., 2003].
Общее число нейронов в СХЯ и объем их ядер у грызунов с возрастом не изменяется. Полагают, что нарушения циркадианных ритмов обусловлены изменениями в системе передачи регулирующих сигналов. Важную роль в этих механизмах могут играть цитокины, поскольку экспрессия мРНК некоторых из
них, например, INF-yR и TNF-a, в нейронах СХЯ с возрастом снижается. В настоящее время известно несколько основных циркадианных «часовых» генов (Perl, Рег2, РегЗ, Ciy-1, Cry-2, Clock, Bmall/МорЗ, Tim и др.) [Reppert S.M., Weaver D.R., 2002; Korf H.W. et al., 2003; Reddy A.K. et al., 2005]. С возрастом многие циклические функции организма постепенно нарушается как у человека, так и у других млекопитающих [Комаров Ф.И. и др., 2004]. Это возрастные нарушения гормональных ритмов, сна-пробуждения, температуры тела, многих поведенческих реакций. У людей старше 60 лет наблюдался пололсительный фазовый сдвиг циркадианного ритма большинства физиологических показателей с его последующей десинхронизацией [Gubin D., Gubin G., 2001].
Недавние наблюдения показали, что у грызунов имеются возрастные нарушения в функции циркадианного осциллятора на уровне индивидуальных клеток СХЯ. D.E. Kolker и соавт. (2004) обнаружили нарушение суточного профиля экспрессии генов Clock и Bmall в СХЯ старых хомячков и не наблюдали влияния возраста на суточный профиль экспрессии генов Perl и Рег2 в постоянной темноте. Экспрессия генов Per уменьшалась с возрастом в СХЯ старых крыс; в другой работе не наблюдалось подобных изменений [Yamazaki S. et al., 2000]. У мышей экспрессия mPerl и тРег2 была ритмичной, с возрастом экспрессия тРег2 снижалось, mPerl не изменялась, а уровень экспрессии mClock и mCryl не зависел от возраста мышей. Данные об отсутствии возрастных изменений в уровне экспрессии гена Perl у мышей и Clock у хомячков были получены другими исследователями [Kolker D.E. et al., 2004]. Экспрессия часовых генов крыс существенно менялась с возрастом в периферических тканях. В печени старых крыс экспрессия гена Per в вечерние часы была снижена. Экспрессия гена Bmall у старых крыс вечером повышалась по сравнению с 13-месячными особями. Установлено, что циркадианная экспрессия генов часовых ритмов нарушается при клеточном старении, также как и широкий спектр физиологических, эндокринных и поведенческих ритмов. Не ясно, являются ли они следствием изменений в центральном или периферических осцилляторах или механизмом, который опосредует синхронизацию между осцилляторами. В то время как стимулируемая светом индукция экспрессии генов Perl и Рег2 снижена в СХЯ гипоталамуса старых крыс, цикличность экспрессии важнейших часовых генов существенно не изменяется с возрастом, как в СХЯ, так и в эпифизе. S. Yamasaki и соавт. (2000) показали, что в СХЯ молодых и старых крыс циркадианиый ритм экспрессии гена Perl мало отличается, а в периферических тканях старых животных наблюдаются его серьезные нарушения.
M.W. Hurd и M.R. Ralph (1998) исследовали роль циркадианного ритма в старении на золотистых хомячках Mesocricetus auratus с мутацией ритмоводителя tau. Результаты показали, что нарушения циркадианного ритма сокращают продолжительность жизни животных, тогда как их восстановление с помощью имплантации фетального СХЯ увеличивали ее почти на 20%. Разрушение осциллятора приводило к сокращению продолжительности жизни животных [DeCoursey P.J. et al., 2000], а мутации в часовых генах мышей - к преждевременному старению животных, развитию различных патологических процессов и сокращению продолжительности жизни, тогда как хорошая экспрессия часовых генов mPerJ, тРег2, mClock и mCryl рассматривается как фактор, определяющий долголетие у мышей, несущих ген a-MUPA [Анисимов В.Н., 2003].
Определение показателей углеводного, жирового, белкового и электролитного обмена
Поведенческие, психоэмоциональные и когнитивные функции изучали ежемесячно у самцов всех групп. Наблюдения производили с 17 до 20 часов в звукоизолированной комнате. Расположение окружающих предметов, источника света и экспериментатора было строго фиксировано в течение эксперимента. Для исключения ориентировочной реакции, связанной с запахами, после каждого исследования используемые предметы протирали влажной тряпкой. Регистрацию поведенческой, двигательной активностей и физической работоспособности проводили под визуальным контролем с введением данных в компьютер. При этом отмечали начало и конец определенных видов деятельности.
Поведенческие реакции изучали в тесте «открытое поле» [Буреш Я. и др., 1991]. Поле площадью 1 м2, расчерченное на 100 квадратов, позволяло оценивать особенности поведения животного в условиях умеренного стресса, вызванного открытым пространством. Крысу помещали в один из периферических квадратов и в течение 3-х минут учитывали число пересеченных квадратов (горизонтальная активность), число вставаний на задние лапы (вертикальная активность), реакции фризинга (замирание), груминга (умывание), число фекальных болюсов и уринаций. Психоэмоциональные проявления (вокализация, пячение, прижимание ушей, нюханье, скуление, зевание, чихание, стучание зубами, отряхивание, грызение) оценивали по трехбалльной системе [Родина В. И. и др., 1993]. Учитывали количество животных, возвратившихся и не возвратившихся на исходную позицию. Регистрировали показатели, как за первую минуту тестирования, так и за весь период выполнения теста. Тест «челночный лабиринт» использовали для оценки нервно-психических процессов, прежде всего когнитивных [Навакатикян М.А., Платонова Л.Л., 1988]. В конце лабиринта, имеющего форму куба (1 м3) и состоящего из 6 отсеков, соединенных проходами шириной 10 см, помещали пищевое подкрепление (кусочки сыра массой 0,1 г). За сутки до проведения эксперимента крыс подвергали сеансу ознакомления (исследовательская стадия эксперимента). Крысам позволялось свободно перемещаться по лабиринту и изучать его, без какого-либо подкрепления или наказания. При этом время нахождения в лабиринте не ограничивалось. Во время второй стадии тестирования голодное животное запускали в лабиринт и наблюдали за его поведением. После каждого успешного прохождения лабиринта экспериментальные животные получали пищевое подкрепление. Время проведения эксперимента - 5 минут. Во время эксперимента регистрировали: количество пройденных отсеков; время прохождения лабиринта; количество крыс, достигших конца лабиринта (рис. 5).
Для оценки статической работоспособности использовали тест «горизонтальный экран-сетка» (рис. 6), Тест заключается в подвешивании животного на горизонтальный экран, при этом крыса пытается удержаться, противодействуя силе тяжести. Экран размером 40x60x1 см представлял собой металлическую сетку, состоящую из прутьев 4 мм в диаметре, которую устанавливали горизонтально на высоте 80 см от уровня пола. Крысу помещали на горизонтальную сетку, плавно отпускали, экран переворачивали. Животное повисало, зацепившись за сетку лапами. Продолжительность теста составляла 3 минуты. Регистрировали длительность удержания животного на экране и число животных в группе, способных удержаться на сетке до конца тестирования. Если в течение этого времени крыса падала вниз, ее сажали на сетку снова, в общей сложности до трех раз. Подсчитывали суммарное время удержания по всем трем повторам вместе и латентность первого падения [Анисимов В.Н. и др., 2001].
Для оценки динамической работоспособности использовали тест «принудительного плавания» (рис. 7). Тест осуществляли в цилиндрическом сосуде диаметром 70 см, высотой слоя воды 1 м и температурой воды 33С. Учитывали продолжительность плавания крыс с грузом (8% от массы тела) до появления первых признаков утомления [Бобков Ю.Г. и др., 1984].
Ежемесячно самцов помещали в 19.00 на сутки в индивидуальные обменные металлические клетки, снабженные поилками. Полученное в опыте количество мочи измеряли мерной пробиркой. Мочу собирали в течение 24 часов, после чего ее количество регистрировали.
Биохимический анализ мочи производили в день завершения эксперимента, поскольку при длительном хранении содержание в моче органических и неорганических веществ может изменяться [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982]. Определение в моче содержания глюкозы и кетонов производили с помощью тест-полосок для анализа мочи «Multistix 10 SG» (фирма «Байер», США). Свежие пробы мочи собирали в сухие чистые сосуды, тест-полоски быстро окунали в мочу. Полоски использовали для визуального тестирования путем сравнения с цветовой шкалой на баночке с тест-полосками. Результат тестирования по параметрам тест-полоски оценивали через 2 минуты.
У самцов фиксировали время опущения яичек в мошонку. У самок фик 84 сировали время открытия влагалища, и, начиная с 3-месячного возраста, ежедневно в течение 2-х недель один раз в три месяца брали влагалищные мазки для изучения эстральной функции. Известно, что в различные фазы овулятор-ного цикла у грызунов влагалищное содержимое имеет неодинаковый состав, легко определяемый при микроскопии. Весь овуляторный цигсл крысы условно делился на следующие стадии: 1) диэструс или стадия покоя; 2) проэструс или стадия подготовки к течке; 3) эструс или стадия течки; 4) метаэструс или стадия после течки. Соответственно этим фазам изменялся состав влагалищного содержимого. Мазки готовили по общепринятой методике [Кабак Я.М., 1968] из влагалищного содержимого, полученного утром в одно и то же время посредством введения во влагалище крыс ватного тампона. Свежеприготовленные мазки без фиксации и окраски сразу же микроскопировали при увеличении в 70 раз. Результаты исследования вагинального содержимого фиксировали в журнале. Оценивали следующие параметры: длительность эстрального цикла, соотношение фаз овуляторного цикла; рассчитывали относительное число коротких, средних и длинных циклов, процентное соотношение фаз эстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. 2.4.1.7. Рентгенография Пять особей из каждой исследуемой группы в возрасте 6, 12, 18 и 24 месяцев исследовали рентгенографически для определения возрастных изменений скелета. Измеряли кифотический угол Кобба. Исследование проводилось под легким эфирным наркозом.
Возрастная динамика показателей биологического возраста и возрастной патологии у крыс, находящихся в различных условиях освещения
Влияние различных режимов освещения на динамику массы тела крыс. С возрастом масса тела увеличивалась во всех световых режимах (рис. 9). Следует отметить, что индивидуальная масса животных в группах весьма варьировала, и с возрастом число крыс, имеющих массу большую или меньшую средних показателей, различалась. Значимый прирост массы тела наблюдался у самок в режиме NL. Вес тела самцов в режиме NL и самок в режиме LL в трехмесячном возрасте был достоверно выше по сравнению с весом крыс в группе LD, а у крыс, находящихся в условиях DD, достоверно ниже. В дальнейшем, с 6 по 18 мес, самки в режиме NL весили достоверно меньше, чем самки в режиме LD. Самцы, содержавшиеся в режиме NL, весили больше контрольных крыс в возрасте 21 мес. В LL режиме самки весили меньше контрольных в возрасте 6, 15,18, 21 месяцев. В DD режиме самки весили достоверно меньше особей контроля на протяжении всего эксперимента. Самцы, находящиеся в условиях NL, DD и LD, имели максимальный вес в возрасте 15 мес. Самцы, находящиеся в режиме LL, имели наибольший вес в 12-месячном возрасте. У самок во всех режимах освещения не наблюдалось возрастного снижения массы тела. Вес тела в 15 мес. у самок и самцов в условиях LD был на 51% и 60% больше, чем у таковых в 3 мес. Наименьший прирост по массе наблюдался в режиме LL: самцы весили на 49%, а самки - на 32% больше, чем в трехмесячном возрасте. Наибольший прирост массы имели крысы, находящиеся в режиме DD: самки весили на 78%, а самцы - на 115% больше, чем в возрасте 3 месяцев.
Таким образом, наибольший прирост по массе тела наблюдался в режиме DD, наименьший прирост - в режиме LL; максимальный вес у самцов в режимах NL, DD и LD наблюдался в 15 месяцев, а у самцов в режиме LL - в 12 ме Влияние различных режимов освещения на динамику потребления корма. Регулярные измерения потребления корма выявили достоверное повышенное потребление корма самцами в условиях NL и LL, по сравнению с крысами в условиях LD в возрасте 18 и 21 месяцев. На табл. 2 можно видеть, что потребление корма варьировало в различные возрастные периоды, причем наблюдались как периоды повышенного потребления корма, так и его снижения, что соответствовало сезонам года. В зимние и осенние месяцы потребление корма увеличивалось, а в весенние и летние месяцы снижалось. У всех животных отмечалась тенденция к снижению потребления корма в 24-месячном возрасте.
Таким образом, влияние светового режима на количество потребляемого корма проявлялось у самцов в условиях LL и NL в возрасте 18 и 21 месяца в виде повышенного потребления по сравнению с LD режимом. Влияние различных режимов освещения на динамику потребления жидкости. На протяжении эксперимента потребление жидкости (питьевой воды) животными во всех экспериментальных группах (табл. 3) было относительно стабильным, изменяясь в зависимости от возраста и времени года. Летом потребление воды было большим по сравнению с потреблением в зимние месяцы, что обусловлено более высокой температурой в помещениях в это время. Наибольшие показатели потребления воды у крыс группы LD и DD приходились на 18 месяцев, что говорит о функциональном росте животных до данного возраста. Особи, находящиеся в режиме LD, имели потребление воды на одном уровне в течение 15-18 месяцев. У крыс в режимах NL и LL максимальное потребление воды приходилось на 12 месяцев, в дальнейшем происходило снижение этого показателя. Таким образом, максимальное потребление жидкости самцами крыс в различных световых режимах приходилось на разные возрастные периоды: в режимах LL и NL - на 12 месяцев, а в режимах LD и DD - на 18 месяцев. Результаты изучения психоэмоционального поведения и двигательной активности крыс в тестах «открытое поле» представлены в таблицах 4-5. Влияние различных режимов освещения на психоэмоциональное поведение и двигательную активность в тесте «открытое поле». В результате проведенных в 1-месячном возрасте исследований по поведенческим показателям теста "открытое поле" оказалось, что крысы, находящиеся с момента рождения в условиях NL, характеризовались длинным латентным периодом первого движения (свыше 10 сек.) и выхода в центр (свыше 70 сек.), низкой горизонтальной активностью (в среднем 10 пересеченных квадратов за первую минуту и 15 - за все время эксперимента) и низкой вертикальной активностью (в среднем 2 стойки на периферии, отсутствие стоек в центре). Около 30% крыс осуществляли реакцию груминга, продолжительность реакции составляла более 10 сек. с нарушением нормальной последовательности стадий груминга (у 50% тестировавшихся животных). Эти животные имели низкий показатель дефекации (0 фекальных болюсов) и 10% уринаций. Реакция фризинга имела место при тестировании, у 10%) животных этой группы продолжительность реакции замирания составляла более 3-х минут. Психоэмоциональные проявления оценивались в 1-2 балла. 30% исследуемых животных этой группы возвращалась на исходную позицию. Вся исследовательская активность осуществлялась, в основном, в течение первой минуты тестирования (табл. 4).
Крысы, находящиеся в условиях DD в течение первых 7 дней, характеризовались коротким латентным периодом первого движения (до 3 сек.) и коротким латентным периодом выхода в центр (до 15 сек.), высокой горизонтальной активностью (в среднем 52 пересеченных периферических и центральных квадратов за первую минуту и 83 - за все время эксперимента), высокой вертикальной активностью (в среднем 6,5 стоек на периферии и в центре за первую минуту и 14 - за время эксперимента). Горизонтальная и вертикальная активности у этой группы была достоверно больше как в течение 1-ой минуты теста, так и на протяжении всего исследования. На 1-ой минуте исследования реакция груминга отсутствовала, длительность груминга была наименьшей (менее 10 сек.), сама реакция носила незавершенный характер, не достигая финальных стадий. Тестируемые животные имели средний показатель вегетативного баланса (1—2 фекальных болюса и 0 уринаций). Реакция фризинга отсутствовала, психоэмоциональные проявления в виде вокализации, прижимания ушей, отряхивания и пячения имели место (оценивались в 2-3 балла). 10% исследуемых животных этой группы возвращались на исходную позицию (табл. 4).
Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию
Иррегулярные циклы в виде анэструса появились, как и при фиксированном режиме освещения, только к году жизни и составили 7% от общего количества, а к полутора годам жизни - 12% (рис. 14). Синдрома персистирующего эструса ни у одного животного в данной группе не наблюдалось. Также, в группах крыс, находящихся в режимах LD и DD, существенных возрастных изменений в соотношении фаз овуляторного цикла зафиксировано не было.
Таким образом, в условиях постоянного и естественного освещений наблюдалось ускорение возрастной динамики эстральной функции по сравнению с режимом LD, и замедление возрастной динамики - в режиме DD. Влияние различных режимов освещения на динамику изменений костного скелета. Рентгенография костного скелета крыс (рис. 15) позволила высчитать кифотический угол Кобба. У крыс не наблюдалось достоверных различий в группах наблюдения, но с возрастом угол Кобба увеличивался. Таким образом, световые режима не оказывали достоверного влияния на возрастные изменения костного скелета крыс. Влияние различных режимов освещения на динамику заболеваний. Возрастная динамика заболеваний, обнаруженных у крыс самцов, представлена в таблицах 11-14. У 3% самцов, находящихся в режиме LD, в возрасте 6 месяцев обнаруживались риниты; в 9 месяцев у 1,8% самцов встречались конъюнктивиты и кератиты; в 15 месяцев у 5,3% - пневмонии и у 1,8% - отиты. Катаракта и инфекции мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта у крыс-самцов в данном режиме освещения не обнаруживались (табл. 11). В условиях полной темноты самцы крыс болели реже и данные заболевания у них обнаруживались в меньшем проценте случаев. Конъюнктивиты и кератиты впервые диагностировались в возрасте 18 месяцев (14,3%), риниты - в возрасте 6 месяцев (1,9%). Практически не различалось количество крыс, имеющих пневмонию, в LD и DD режиме. У крыс этой группы не встречались отиты, катаракта, инфекции ЖКТ и мочевыводящих путей (табл. 12). У самцов крыс, находящихся в LL режиме, в возрасте двух лет чаще встречались такие заболевания как риниты, отиты, пневмонии, конъюнктивиты и кератиты. В отличие от предыдущей группы данные заболевания проявлялись в более раннем возрасте: отиты, конъюнктивиты и кератиты - в возрасте 6 месяцев; пневмонии - в 12 месяцев. У самцов в условиях LL диагностировалась катаракта (у 23,1% крыс в возрасте двух лет), инфекции мочевыводящих путей (у 3,4% особей в возрасте двух лет) и ЖКТ (у 15,4% особей в возрасте двух лет). Данные заболевания впервые обнаруживались в 15-18 месяцев (табл. 13). В естественном режиме освещения у самцов риниты, конъюнктивиты и кератиты впервые обнаруживались в том же возрасте, что и у самцов в режиме LD, но количество животных с данными заболеваниями было большим, чем в стандартном режиме освещения. Так воспалительные заболевания глаз в возрасте 9 месяцев встречались у 3,1% особей (в режиме LD - у 1,8%), риниты в возрасте 6 месяцев - у 14,3% особей (в режиме LD - у 3%). Пневмонии впервые обнаруживались у самцов в этом режиме на 3 месяца раньше, чем у самцов в режиме LD. В возрасте двух лет эти крысы чаще болели пневмониями, ринитами, воспалительными заболеваниями глаз, отитами. У самцов в режиме NL, также как и в режиме LL, обнаруживалась катаракта, инфекции ЖКТ и мочевы-водящих путей, которых не наблюдалось в режиме LD (табл. 14). У самок, находящихся в режиме LD воспалительные заболевания глаз впервые обнаруживались в 12 месяцев у 3% особей; пневмонии - в 15 месяцев у 4,1% самок; риниты - в 6 месяцев у 2% крыс, а отиты - в возрасте 18 месяцев. Инфекций мочевыделительной системы и ЖКТ, а также катаракта у самок в этом режиме не наблюдалось (табл. 11). В условиях DD самки крыс болели реже и данные заболевания у них обнаруживались в меньшем проценте случаев. Конъюнктивиты и кератиты впервые диагностировались в возрасте 18 месяцев (6,1%), риниты - в возрасте 9 месяцев (1,5% ), пневмонии — в возрасте 15 месяцев (6,5%). У самок крыс этой группы не встречались отиты, катаракта, инфекции ЖКТ и мочевыводящих путей (табл. 12). У самок крыс, находящихся в LL режиме, чаще встречались и раньше диагностировались риниты, отиты, пневмонии, конъюнктивиты и кератиты. В отличие от самок, находящихся в LD режиме, риниты, конъюнктивиты и кератиты диагностировались в 6 месяцев; отиты - в 9 месяцев; пневмонии - в 12 месяцев. У самок в условиях LL обнаруживались: катаракта, инфекции мочевыводящих путей и ЖКТ, которые не наблюдались у крыс в условиях LD. Эти заболевания впервые обнаруживались в 18-месячном возрасте (табл. 13).
В NL режиме у самок риниты, конъюнктивиты и кератиты впервые диагностировались в том же возрасте, что и у самцов. Количество заболевших животных было большим, чем в стандартном режиме освещения. Так воспалительные заболевания глаз в возрасте 9 месяцев встречались у 5,1%) самок, риниты в возрасте 6 месяцев - у 15,2% особей, пневмонии в возрасте 12 месяцев — у 8,5% самок, инфекции ЖКТ в возрасте 21 месяца - у 8,1% крыс. В возрасте 18 месяцев диагностировались катаракта (2,5%), инфекции мочевыделительной системы (2% ), отиты (2,1%). Самки чаще болели пневмониями, ринитами, воспалительными заболеваниями глаз, отитами, чем особи в режиме LD . У самок в режиме NL, также как и в режиме LL, обнаруживалась катаракта, инфекции ЖКТ и мочевыводящих путей, которых не наблюдалось в режиме LD (табл. 14).
Таким образом, в условиях LL и NL наблюдалось повышение количества заболеваний воспалительной природы и катаракт, а в условиях DD - снижение заболеваемости по сравнению с аналогичными параметрами в условиях LD.
