Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Мелатонин: роль и значение в организме 17
1.1. Общие представления 17
1.2. Ритмы синтеза и секреции мелатонина 19
1.3. Секреция мелатонина в различных условиях обитания человека 22
1.4. Биологические эффекты мелатонина 24
1.5. Экстрапинеальный синтез мелатонина 26
1.6. Мелатонин и опухолевый рост 34
1.6.1. Эффекты мелатонина в культуре опухолей молочной железы, 36
1.6.2. Эффекты мелатонина на клетки меланомы 39
1.6.3. Эффекты мелатонина на клетки опухолей женских репродуктивных органов 42
1.6.4. Эффекты мелатонина на клетки других опухолей 43
1.6.5. Механизмы онкостатического действия мелатонина 45
Глава 2. Мелатонин и старение 50
2.1. Возрастные особенности продукции мелатонина 50
2.2. Возрастные изменения пинеальной железы 51
2.3. Мелатонин и нейродегенеративные процессы, ассоциированные с возрастом 53
Глава 3. Материал и методы исследования 61
3.1. Разработка протокола для определения экскреции 6-сульфатоксимелатонина 61
3.2. Характеристика групп обследуемых пациентов 66
3.2.1. Изучение возрастных особенностей секреции мелатонина 66
3.2.2. Изучение секреции мелатонина у онкологических больных 67
3.2.3. Изучение секреции мелатонина у больных нейродегенеративными заболеваниями .70
3.3. Методы исследования 71
3.3.1. Радиоиммунологическое исследование экскреции 6-сульфатоксимелатонина 71
3.3.2. Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование опухолей и гастробиоптатов 72
3.3.3. Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование экспрессии тау-протеина, белка bcl-x и мелатонина в лимфоцитах крови .73
3.3.4. Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование экспрессии (3-амилоида, тау-протеина и мелатонина в биоптатах желудка и кожи 76
3.4. Статистическая обработка результатов 81
Глава 4. Возрастные особенности секреции мелатонина 82
4.1. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина с мочой в различных возрастных группах 82
4.2. Экспрессия мелатонина в слизистой оболочке желудка при старении 84
Глава 5. Секреция мелатонина у онкологических больных .88
5.1. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина у больных с опухолями различной локализации 88
5.1.1. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при опухолях щитовидной железы 88
5.1.2. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при опухолях молочной железы. 88
5.1.3. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при опухолях яичников 89
5.1.4. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при раке гортани 89
5.1.5. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при раке легкого 90
5.1.6. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при раке желудка. 91
5.1.7. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при раке толстой и прямой кишки 91
5.1.8. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина при раке мочевого пузыря ... .92
5.2. Мелатонин и пролиферация опухолевых клеток: иммуноцитохимические корреляции .94
5.2.1. Корреляции между уровнем экскрецией 6-сульфатокси-мелатонином и пролиферацией опухолевых клеток .94
5.2.2. Корреляции между экскрецией 6-сульфатоксимелатонина и экспрессией мелатонина в опухолевой ткани .98
5.2.3. Корреляции между пролиферативной активностью клеток и экспрессией мелатонина в опухолевой ткани .99
Глава 6. Секреция мелатонина при болезни Альцгеимера 101
6.1. Экскреция 6-сульфатоксимелатонина у пациентов с болезнью Альцгеймера при различной клинической выраженности деменции 101
6.2. Мелатонин и маркеры нейродегенеративных заболеваний: иммуноцитохимические корреляции 103
6.2.1. Экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера 103
6.2.2. Корреляции между экспрессией тау-протеина, белка bcl-x и мелатонина в лимфоцитах крови при болезни Альцгеймера 106
6.2.3. Экспрессия мелатонина, Р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка и коже при болезни Альцгеймера 111
Глава 7. Мелатонин как биологический маркер возрастной патологии 122
Заключение 148
Выводы 150
Практические рекомендации 153
Указатель литературы 154
- Ритмы синтеза и секреции мелатонина
- Разработка протокола для определения экскреции 6-сульфатоксимелатонина
- Корреляции между уровнем экскрецией 6-сульфатокси-мелатонином и пролиферацией опухолевых клеток
- Экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера
Введение к работе
Актуальность проблемы
Мелатонин (МТ) - гормон, играющий важную роль в регуляции гомеостаза организма, впервые обнаружен в 1958 году в пинеальной железе (эпифизе) [241]. Основным метаболитом МТ является 6-сульфатоксимелатонин (6-СОМТ). По концентрации 6-СОМТ в моче можно косвенно судить о продукции МТ эпифизом (94).
За прошедшие сорок пять лет после его открытия было доказано, что МТ является ключевым регулятором биологических ритмов [11, 14, 313]. Данный гормон участвует в обеспечении многих жизненно важных физиологических процессов, таких, как созревание и развитие половых органов; пигментный обмен; метаболизм свободных радикалов; иммунный ответ; регуляция настроения и сна; пролиферация и дифференцировка клеток [5-10, 13, 29, 74, 257].
В настоящее время твердо установлено, что пинеальная железа не является исключительным органом, способным синтезировать МТ [130, 164].
Многочисленными исследованиями показано, что экстрапинеальный МТ широко распространен в организме человека и животных. Клетки, продуцирующие МТ, обнаружены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте и других органах [132,305,225].
Более того, обнаружен активный синтез МТ в неэндокринных клетках -тучных клетках, естественных киллерах, эозинофильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах [226, 227].
Такое широкое распространение МТ в организме отражает его ключевую роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов [315,318].
При старении происходит инволюция пинеальной железы [74], и, как следствие этого, снижается концентрация МТ в организме [11]. Это, в свою очередь, приводит к возрастным изменениям ряда метаболических процессов и негативно отражается на функции многих органов и систем. Однако при этом сведения об изменении уровней секреции экстрапинеального МТ при старении отсутствуют, что ограничивает понимание роли и значения экстрапинеальных источников синтеза этого важного гормона и свидетельствует о необходимости исследований в этом направлении.
Одним из наиболее важных биологических свойств МТ является его способность контролировать клеточное деление [98]. МТ способен ингибировать митоз клеток, вызывая задержку на стадии метафазы. Были опубликованы сообщения, касающиеся ингибирующего действия МТ на рост клеток, зависимых от половых стероидных гормонов [105, ПО], а также на развитие экспериментальных злокачественных опухолей в условиях in vivo и in vitro [102, 111, 123, 124]. На этом основании было выдвинуто предположение о том, что МТ является природным онкостатическим гормоном, способным предотвращать неопластический рост [122].
Подобное обстоятельство определяет актуальность проведения исследований по определению секреции МТ у онкологических больных. Это может иметь не только фундаментальное теоретическое значение для более глубокого понимания эндогенных механизмов, участвующих в процессах неопластической трансформации, но и явиться основой для разработки новых диагностических и прогностических маркеров при опухолевых заболеваниях.
Нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, являются патологическими процессами, ассоциированными с возрастом [39, 73]. Их прижизненная диагностика чрезвычайно трудна, но крайне необходима для выбора оптимального патогенетически обусловленного варианта лечения. Известно, что в механизме развития болезни Альцгеймера важное место занимает нейротоксическое действие свободных радикалов [315]. В последние годы установлено, что МТ, как сильный эндогенный поглотитель свободных радикалов, играет важную роль в защите нейронов от окислительного стресса [322, 323].
В этой связи, проведение исследований по изучению взаимоотношений экстрапинеального МТ с ключевыми молекулами, вовлеченными в патогенез болезни Альцгеймера - р-амилоидом и тау-протеином, может иметь важное значение для разработки прижизненных маркеров нейродегенеративных заболеваний.
Опухолевый рост и нейродегенеративные заболевания являются наиболее значимыми патологическими процессами, ассоциированными с возрастом [73, 75, 202, 203]. Поэтому, в связи с вышеизложенными обстоятельствами, актуальной и необходимой научно-практической задачей является проведение исследований по оценке МТ в качестве возможного биологического маркера этих патологических процессов с целью оптимизации диагностики, оценки прогноза и лечения заболеваний.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение МТ как биологического маркера опухолевых и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.
В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать унифицированный протокол клинических данных для объективной интерпретации результатов определения экскреции 6-СОМТ у человека.
2. Изучить динамику секреции МТ в организме человека при старении.
3. Изучить показатели экскреции 6-СОМТ у больных с опухолями различной локализации и провести корреляционный анализ этих показателей с пролиферативной активностью опухолей.
4. Изучить секрецию МТ у пациентов с болезнью Альцгеймера.
I 5. Верифицировать возможную внемозговую экспрессию ключевых молекул, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера - -амилоида и тау-протеина, для разработки метода прижизненной диагностики этого заболевания.
6. Оценить эффективность использования МТ как биологического маркера при диагностике и прогнозе течения онкологических и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста.
Научная новизна работы
Установлено изменение динамики секреции МТ в процессе старения организма. При этом впервые выявлено, что если уровень пинеального МТ прогрессивно снижается с возрастом, то секреция экстрапинеального МТ остается стабильной до 60 лет. После 60 лет выработка экстрапинеального МТ начинает снижаться, но медленнее, чем уровень пинеального МТ. Это позволяет поддерживать регуляцию тропных к МТ физиологических процессов на достаточно стабильном уровне в пожилом возрасте.
Обнаружено, что при опухолевых процессах секреция МТ изменяется. Эти изменения носят разноплановый характер и зависят как от органной локализации опухоли, так и от степени ее дифференцировки и прогрессии. Уровень экскреции 6-СОМТ прогрессивно снижается при увеличении размеров опухоли и метастазировании.
Установлено, что оперативное удаление опухоли у больных раком молочной железы приводит к восстановлению нормального уровня экскреции 6-СОМТ.
Впервые зарегистрированы достоверные корреляции между величиной экскреции 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза: положительная корреляция между уровнем экскреции 6-СОМТ и пролиферативной активностью опухолевых клеток; отрицательная корреляция между показателями экскреции 6-СОМТ и внутриопухолевым содержанием МТ; отрицательная корреляция между пролиферативной активностью клеток и экспрессией МТ в опухолевой ткани.
У пациентов с болезнью Альцгеймера установлено достоверное снижение экскреции 6-СОМТ. Впервые обнаружена экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и показано отсутствие иммунореактивности к тау-протеину лимфоцитов крови в контрольной группе.
Выявлено значительное снижение синтеза белка bcl-x и уровня МТ в крови при болезни Альцгеймера как за счет уменьшения количества лимфоцитов, продуцирующих эти факторы, так и за счет снижения уровня секреции веществ даже в тех клетках, которые сохранили способность продуцировать bcl-x и МТ.
Впервые обнаружена экспрессия Р-амилоида и тау-протеина в цитоплазме тучных клеток слизистой оболочки желудка и кожи у пациентов с болезнью Альцгеймера, что подтверждает правомочность взглядов на болезнь Альцгеймера как на системное заболевание.
Впервые показана выраженная отрицательная связь между продукцией МТ и экспрессией р-амилоида и тау-протеина в слизистой оболочке желудка, что свидетельствует о протекторной роли экстрапинеального МТ как эндогенного фактора противодействия развитию нейродегенеративных процессов.
Практическая ценность работы
На основании исследования секреции МТ у людей разных возрастных групп разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.
Обнаружение достоверных корреляций между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяет оценить 6-СОМТ как новый перспективный маркер для его применения в онкологической практике в целях оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.
Выявленное снижение экскреции 6-СОМТ у пациентов с болезнью Альцгеймера и установленные корреляции ее показателей со степенью клинической выраженности деменции позволяют расценивать 6-СОМТ как информативный критерий тяжести и прогноза заболевания.
Впервые обнаруженная экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера и отсутствие иммунореактивности к тау-протеину у пациентов контрольной группы позволяют рассматривать тау-протеин как перспективный маркер, а лимфоциты крови как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой ценности МТ как биологического маркера при диагностике, оценке прогноза течения и эффективности лечения патологических процессов, ассоциированных с возрастом, в частности нейродегенеративных и онкологических заболеваний.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработан унифицированный протокол клинических данных, позволяющий объективизировать интерпретацию полученных результатов при определении экскреции 6-СОМТ у человека.
2. Секреция МТ с возрастом прогрессивно снижается, однако, динамика этого процесса неодинакова для пинеального и экстрапинеального МТ. Стабильная выработка МТ в желудочно-кишечном тракте до 60 лет и ее более медленное снижение по сравнению с пинеальным МТ в старческом возрасте обеспечивает регуляцию физиологических процессов на достаточном уровне.
3. Достоверные корреляции между экскрецией 6-СОМТ и показателями опухолевого гомеостаза позволяют оценить МТ как новый перспективный неинвазивный маркер для оптимизации диагностики и оценки прогноза развития опухоли.
4. Обнаружение экспрессии тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера позволяет рассматривать этот белок как перспективный маркер, а лимфоциты крови как удобный объект для прижизненной диагностики болезни Альцгеймера.
5. Резкое снижение выработки антиапоптозного фактора bcl-x и МТ, обладающего сильными антиоксидантними свойствами, в лимфоцитах крови у пациентов с болезнью Альцгеймера свидетельствует о непосредственном участии продуктов окислительного стресса в апоптотической гибели нейронов при нейродегенеративных процессах.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Мелатонин: общебиологические и онкорадиологические аспекты» (Обнинск, Россия, 1992); I Международной конференции по нейроиммуноэндокринологии (Локарно, Швейцария, 1993); научном семинаре Отдела гистологии и микроскопической анатомии Академического центра Университета Антверпена (Антверпен, Бельгия, 1993); 1-ом конгрессе Международной Ассоциации патологоанатомов (Москва, Россия, 1995); Международной конференции CYTO-95 (Саутхэмптон, Великобритания, 1995); 1-ом Онкологическом конгрессе СНГ (Москва, Россия 1996); научном семинаре Центра биомедицинских исследований университета Тюбингена (Тюбинген, Германия, 1996); XIV Международном конгрессе по гистохимии и цитохимии (Киото, Япония, 1996); конференции Норвежского общества гастроэнтерологов (Трондхейм, Норвегия, 1997); Международной конференции CYTO-97 (Йорк, Великобритания, 1997); 3-й Международной конференции «Пинеальная железа и рак» (Блауберин, Германия, 1997); научной сессии Израильского общества гистохимии (Тель-Авив, Израиль, 1999); 2-ом Европейском конгрессе по биогеронтологии (Санкт-Петербург, Россия, 2000); научном семинаре Института цитологических исследований (Валенсия, Испания, 2000); научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2001» (Санкт-Петербург, Россия, 2001); научном семинаре Института анатомии II Университета Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2001); научном семинаре Лаборатории по изучению биологических ритмов Университета Пастера (Страсбург, Франция, 2001); Международном симпозиуме «Мелатонин: клиническое значение и терапевтическое применение» (Поляница-Здрой, Польша, 2001); Международном геронтологическом Форуме (Валенсия, Испания, 2002);
научном семинаре Нидерландского Института мозга (Амстердам, Голландия, 2002); научной конференции «Биологическая, медицинская и ветеринарно-медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества» (Санкт-Петербург, Россия, 2003); 6-ом Европейском конгрессе по микроскопии (Пула, Хорватия, 2003); Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, Россия, 2003).
Реализация результатов исследования
Результаты исследований используются в научной, педагогической и практической деятельности Медицинского радиологического научного центра РАМН, Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской государственной медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ, Санкт-Петербургской клинической больницы РАН, Центра биомедицинских исследований Тюбингенского университета (Германия), Института цитологических исследований (Валенсия, Испания).
Публикации
По теме диссертации опубликована 41 работа, в том числе 1 монография.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертационная работа являлась научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и Медицинского радиологического научного центра РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 201 странице содержит 12 таблиц и иллюстрирован 20 рисунками. Указатель литературы содержит 384 источника, из которых отечественных - 83, зарубежных - 301.
Ритмы синтеза и секреции мелатонина
Интенсивность метаболизма МТ зависит от уровня освещенности [93, 96, 129]. Установлено, что активность ГИОМТ в пинеальной железе крыс после содержания животных в темноте в течение 50 суток в 10 раз превышает активность того же фермента у животных, находившихся то же время в условиях постоянного освещения. Уровень ГИОМТ в пинеальной железе ночью в 3.5 раза выше, чем днем [95]. Это коррелирует с показателями, свидетельствующими о повышении концентрации МТ в пинеалоцитах ночью, тогда как уровень серотонина в них ночью в 7-9 раз ниже, чем днем. Возможно, ночью и в условиях искусственной темноты серотонин используется для повышения синтеза МТ. Таким образом, показана четкая зависимость синтеза МТ от циркадианных ритмов [11, 95, 313].
Свет является мощным физическим фактором, который, действуя даже короткое время, ингибирует синтез и секрецию МТ. Обнаружено, что короткий импульс полученного света, даже в ночное время, подавляет продукцию МТ. Влияние светового импульса на синтез МТ зависит от многих его физических составляющих — длины волны, мощности светового потока и даже спектра [95, 270].
Установлено, что световые импульсы эффективно подавляют синтез МТ. Однако при этом отмечаются видовые различия. Так, для белых крыс достаточно 0.0005 мВ/см2 мощности светового потока, чтобы достоверно снизить продукцию МТ, в то время как для земляных белок для достижения подобного эффекта уровень светового облучения должен быть не меньше 1850мВ/см2[89, 201].
Подавляющий эффект света по отношению к продукции МТ зависит также и от его спектра. Для уменьшения секреции МТ у хомяков наиболее эффективен голубой свет. На крыс эффективнее всего действует белый свет в сочетании с зеленым, голубым и красным [279]. Красный свет не может расцениваться как индиферентный по отношению к синтезу МТ, так как показано, что облучение красным светом в 16.00 часов более сильно подавляет синтез МТ, чем в 24.00 часа [381].
Известно, что синтез МТ в пинеальной железе напрямую зависит от уровня норадреналина, синтезируемого постсинаптическими нервными волокнами в супрахиазматическом ядре [48]. Было установлено, что депрессивный эффект ночного воздействия светом обусловлен резким уменьшением синтеза норадреналина в нервных волокнах и сопровождается снижением уровней цАМФ и N-ацетилтрансферазы в пинеальной железе [276].
У людей, как и у животных, также наблюдается различие в дневном и ночном уровнях синтеза и секреции МТ. Ночью в сыворотке крови человека концентрация МТ возрастает примерно в 30 раз по сравнению с дневным уровнем [93, 253, 278]. Дневной/ночной ритм изменения концентрации МТ также продемонстрирован в слюне, женском молоке, амниотической жидкости и моче [77, 80].
Пик ночной секреции МТ приходится на 2 часа ночи. Ночной максимум продукции МТ у человека по его концентрации в крови составляет -75 pg/ml. Общее количество МТ, синтезируемого в организме человека в течение 24-часового периода составляет 30 мкг, причем 80% этого количества синтезируется в ночное время [94].
Циркадианный ритм синтеза МТ появляется сразу после рождения плода. Во внутриутробном периоде дневной/ночной ритм не существует, поскольку циркадианная система ритма, как было показано в специальных исследованиях, не формируется до рождения, а созревает прогрессивно после рождения [48]. Дневные/ночные различия содержания МТ в крови, взятой из пуповины, связаны с синтезом гормона в организме матери, а не новорожденного [318]. Для становления дневного/ночного ритма секреции МТ требуется достаточно долгое время. Существование дневного/ночного ритма возникает в возрасте 9-12 недель у нормально родившихся 9-месячных младенцев и регистрируется на 2-3 недели позже у недоношенных детей [48]. На 24-ой неделе со дня рождения секреция МТ составляет 25% от уровней значений, регистрируемых у взрослых людей. Низкие ночные концентрации МТ повышаются к 2-3 годам, потом значительно снижаются к 15-20 годам и устанавливаются на уровне половозрелого организма [182, 230].
Данные о сезонных вариациях синтеза МТ в организме человека противоречивы и не носят достоверных отличий, несмотря на изменение продолжительности светового дня в различные времена года [243]. Большое количество работ посвящено изучению факторов, влияющих на секрецию МТ. При этом следует отметить, что анализ литературы не выявил отчетливых половых различий в продукции МТ у человека в различные возрастные периоды его жизни. Изменения в секреции МТ не обнаружены и на разных стадиях менструального цикла. В процессе родов уровни содержания МТ практически не изменяются [191].
Питание отражается на секреции МТ. После двух дней голодания наблюдалось снижение уровня МТ в крови на 19%, в то же время при нормальном получении голодающими глюкозы уровень МТ не изменялся [200]. Другие авторы отмечают, что после 72-дневного голодания дневные уровни МТ увеличились, а ночные уровни остались неизмененными [137, 138, 196].
Установлено влияние физических упражнений на содержание МТ в организме. Отмечалось, что физические упражнения увеличивают дневные уровни МТ в крови у женщин, которые уменьшаются и приходят постепенно в норму с увеличением интенсивности упражнений [254]. При этом было выявлено, что выполнение упражнений поздним вечером (т.е. в течение стадии физиологического повышения секреции МТ) замедляло увеличение его концентрации по сравнению с выполнением упражнений утром и днем. Высокоинтенсивные упражнения, выполняемые ночью (при уже имеющихся высоких ночных уровнях МТ), приводили к еще большему увеличению его секреции - на 50%. Упражнения любой интенсивности, также выполняемые ночью, приводили к задержке на 2-3 часа увеличения секреции МТ следующей ночью.
Разработка протокола для определения экскреции 6-сульфатоксимелатонина
Известно, что синтез МТ имеет четко выраженный циркадианный ритм и реагирует не только на световые импульсы, но и на воздействие определенных химических препаратов. Поэтому при изучении МТ и его метаболитов в качестве потенциально возможных биологических маркеров патологических процессов у человека, следует строго унифицировать временные интервалы и протокол сбора образцов биологических жидкостей (кровь, моча, спиномозговая жидкость, слюна) для последующего радиоиммунологического или иммуноферментного анализа. Учитывая эти обстоятельства, основной методологической задачей нашего исследования явилась тщательная разработка протокола определения основного метаболита МТ 6-СОМТ в моче обследуемых людей.
Выбор 6-СОМТ в качестве маркера базировался на том, что при определении МТ в сыворотке крови забор крови необходимо проводить в 2 часа ночи. Данное обстоятельство обуславливает, с одной стороны, нахождение пациента в стационаре, с другой, связано с неудобствами и беспокойством для больных. В настоящее время, более широкое распространение получил метод фиксированного наблюдения, заключающийся в определении ночной экскреции основного метаболита МТ - 6-СОМТ. Пробы мочи для анализа 6-СОМТ забираются у пациентов в 8 часов утра. Это позволяет не тревожить больных в течение ночи и представляет собой простой неинвазивный метод, удобный как для скриннинговых, так и для мониторинговых исследований.
Формирование 6-СОМТ в печени - двуступенчатый процесс, в котором МТ вначале преобразуется в 6-гидромелатонин-микросомальную монокси-цитохромную Р-450 систему, а затем при посредстве цитозолитической сульфат-трансферазы трансформируется в 6-СОМТ.
Установлено, что ночная экскреция 6-СОМТ с мочой, измеренная в 8 часов утра, отражает ночное содержание МТ в крови, измеренное в 2 часа ночи [95]. Таким образом, определение 6-СОМТ в утренних образцах мочи адекватно отражает ночной синтез МТ и представляет собой простой и достоверный метод для определения уровней МТ у здоровых и больных людей. Необходимо отметить, что использование данного метода не приводит к нарушению сна. Нарушения сна могут повлиять на физиологическую секрецию МТ и, тем самым, сказаться на показателях его определения, на самом деле, не отражающих изменений уровней МТ при том или ином заболевании.
Доказано, что достаточно 5-минутного воздействия светом в 150 Lx для быстрой инактивации фермента - N-ацетилтрансферазы и ограничения биосинтеза МТ в пинеальной железе, что приводит к резкому сокращению уровней МТ в крови до дневных концентраций [95]. Учитывая прямую зависимость синтеза МТ от освещенности, при назначении анализа на определение 6-СОМТ пациенты были предупреждены о недопустимости включения источников света в течение ночи, предшествующей утреннему забору проб.
Процесс достоверного определения МТ и его метаболитов предусматривает запрещение применения определенных лекарственных препаратов в предшествующие 5-7 дней и в тот день, когда будет проходить забор образцов мочи для исследования. В первую очередь, это касается а-или (3-блокаторов, так как секреция МТ пинеальной железой контролируется симпатической нервной системой [313] через ряд внутриклеточных процессов, вовлекающих аденилатциклазу, цАМФ, протеинкиназы в активацию ключевого фермента синтеза МТ - N-ацетилтрансферазы. Применение дооперационных успокоительных средств может отрицательно сказаться на секреции МТ. Установлено, что часто используемые для этого бензольные производные диазепина снижают продукцию МТ в пинеальной железе [102]. Применение инсулина отрицательно воздействует на секрецию МТ, хотя прием оральных антидиабетических сульфонил-производных вещества не затрагивает синтез МТ. Отмечено, что повышение уровней МТ происходит под действием многих лекарственных препаратов, действующих на центральную нервную систему. Так, например, нейролитическое средство - хлорпромазин стимулирует продукцию МТ, ингибиторы МАО - клоргилин, транилципрамин, депренил также приводят к повышению МТ в плазме крови, а флувоксамин - антидепрессант, ингибирующий синтез серотонина -основного предшественника МТ, снижает и уровень последнего.
Применение аналога у-эндорфина - дестерозина, обладающего депрессантной активностью, приводит к увеличению секреции МТ. Список лекарств, воздействующих на синтез МТ, постоянно расширяется, подтверждая тем самым, что секреция МТ может изменяться в связи с применением многих фармакологических препаратов. Данное обстоятельство определяет строгий продуманный подход к назначению и ограничению лекарственной терапии в период изучения у больного динамики синтеза и секреции МТ.
Следует принимать во внимание, тот факт, что не только секреция МТ изменяется под воздействием экзогенных факторов, таких как свет и лекарственные препараты, но и то, что пинеальная железа, как интегральная часть нейроиммуноэндокринной системы, также находится под влиянием гормональных и иммунных эндогенных факторов. Поэтому при разработке протокола нами обязательно учитывалось наличие эндокринных и иммунных заболеваний у обследуемого пациента.
Таким образом, учитывая все вышеизложенное, нами был разработан унифицированный протокол данных, заполняемый при клиническом определении экскреции 6-СОМТ у человека. При строгом унифицировании и соблюдении протокола, определение экскреции 6-СОМТ дает четкую оценку изменений синтеза и секреции МТ у пациентов.
Корреляции между уровнем экскрецией 6-сульфатокси-мелатонином и пролиферацией опухолевых клеток
Проведенные исследования по изучению экскреции 6-СОМТ у представителей различных возрастных групп подтверждают ранее полученные данные других авторов о снижении синтеза и секреции МТ при старении организма [171, 211, 252].
Однако нами было установлено, что темпы снижения секреции МТ неодинаковы для пинеальнои железы и для экстрапинеальных источников, в частности для ЕС-клеток, локализующихся в желудочно-кишечном тракте. В то время как снижение синтеза и секреции МТ в пинеальнои железе с увеличением возраста идет достаточно интенсивно, показатели секреции МТ в желудочно-кишечном тракте остаются стабильными до 60 лет. После 60 лет продукция экстрапинеального МТ начинает снижаться.
Полученные результаты, на наш взгляд, могут отражать компенсаторно-приспособительные процессы, протекающие в организме человека при старении, когда организм в течение достаточно длительного времени сохраняет стабильный уровень выработки МТ за счет экстрапинеальных источников его синтеза.
Мы полагаем, что увеличение в старости доли синтезируемого МТ, обладающего цитостатическими и антиоксидантными свойствами, за счет экстрапинеальных источников, возможно, является эндогенным протекторным фактором, снижающим риск возникновения опухолевых и нейродегенеративных заболеваний у пожилых людей.
Изучение роли пинеальной железы и ее гормона МТ в патогенезе опухолевого роста, как уже отмечалось в обзоре литературы, началось в конце 70-х годов XX века с исследований, посвященных анализу его роли при раке молочной железы [123, 124]. Была опубликована гипотеза о том, что пониженная функция пинеальной железы, сопровождающаяся накоплением эстрогена, может стимулировать развитие опухолей [125].
В 1979 году Wetterberg первым из исследователей проанализировал взаимоотношения между МТ и раком молочной железы. Принимая во внимание тот факт, что частота возникновения рака молочной железы очень низка в Японии по сравнению с США, он сравнил циркадианные изменения секреции МТ у здоровых женщин из этих стран. Wetterberg обнаружил более низкие показатели секреции МТ у японских женщин, чем у североамериканских белых женщин. Это, по его мнению, свидетельствовало о прямой связи риска развития рака молочной железы с секреторной деятельностью пинеальной железы.
При анализе циркадианных изменений ритмов содержания МТ в плазме у женщин с первичным раком молочной железы на ранних (I и II) клинических стадиях было установлено существенное снижение уровней ночного МТ у пациенток с эстроген-рецептор-положительными опухолями [122].
Bartsch и Bartsch [111] провели в Индийском национальном раковом центре сравнительное изучение содержания МТ и его циркадианного профиля у пациенток с первичным нелеченным раком молочной железы в постменопаузе и у женщин той же возрастной группы, не страдающих раком.
Обе группы пациенток изучались в течение одного месяца. Образцы мочи брали через каждые 4 часа в течение дня и через один 8- часовой интервал ночью. Из 10 проанализированных пациенток с раком молочной железы, 9 имели первичную нелеченную опухоль и у одной больной возник локальный рецидив. У всех 10 больных было зарегистрировано снижение суточной секреции МТ на 30%, которое сопровождалось задержкой стадии циркадианного пика экскреции МТ в моче. Необычная особенность в этих двух группах была зарегистрирована только у индийских женщин. У них показатели экскреции МТ были выше в течение второй половины дня (14.00 -18.00), чем ночью (22.00 - 6.00). Экскреция МТ у больных раком была на 50% ниже, чем у здоровых людей во второй половине дня и ночью. Показатели экскреции МТ у пациентов с прогрессирующей первичной опухолью (II-IV стадии) демонстрировали более выраженную статистическую достоверность.
Те же авторы провели другое изучение циркадианного ритма МТ в сыворотке крови у пациентов с раком молочной железы в Германии [105]. Были проанализированы 23 пациентки с нелеченными первичными опухолями и 12 больных с повторным лечением. 28 больных с различной неопухолевой патологией молочной железы использовались в качестве контроля. Анализ данных был выполнен двумя способами. Это было обусловлено тем, что некоторые больные в каждой из групп пациентов имели сопутствующие заболевания и получали различное фармакологическое лечение. Первоначально был проведен анализ у всех пациенток в различных группах, независимо от присутствия других патологических состояний или видов лечения. Впоследствии, только те пациентки из каждой группы, которые фактически были здоровы и страдали только опухолевой или неопухолевои патологией молочной железы, были отобраны, сформировав, так называемые, «центральные группы». Кроме того, центральная группа контроля была подразделена на молодых и более старых пациенток так, чтобы каждая из них могла быть сопоставлена с пациентками того же возраста из центральной группы с нелеченными первичными опухолями.
У больных раком молочной железы было обнаружено существенное снижение циркадианной амплитуды МТ (на 67%) по сравнению с контрольными пациентами того же возраста, имеющих фиброаденому или фиброзную мастопатию. Подобное снижение уровней МТ (на 56%) наблюдалось у пациентов клинически одинаковой группы с первичным раком молочной железы и отсутствовало у контрольных лиц соответствующего возраста. Напротив, у пациентов с вторичными раковыми опухолями, которые появились у них в качестве рецидива после хирургического удаления первичной опухоли, не наблюдалось снижения уровня МТ [107].
Экспрессия тау-протеина в лимфоцитах крови пациентов с болезнью Альцгеймера
Проведенные нами исследования экскреции 6-СОМТ у больных раком щитовидной железы показывают, что ночная выработка МТ у данных пациентов снижена по сравнению с представителями контрольной группы. Однако, подавление пинеальной функции при раке щитовидной железы, по-видимому, не является специфическим феноменом, обусловленным присутствием только малигнизированных клеток. Нами было установлено, что у пациентов с благоприятным течением заболеваний щитовидной железы (простой зоб, аденомы, тиреоидит Хашимото) также происходит статистически достоверное снижение (на 60%) экскреции 6-СОМТ по сравнению с пациентами контрольной группы, не страдающими заболеваниями щитовидной железы.
На наш взгляд, эти данные свидетельствуют о том, что развитие заболеваний щитовидной железы, независимо от того, относятся они к злокачественным новообразованиям или нет, может подавлять выработку пинеального МТ. Не исключено, что снижение уровня циркулирующего МТ может иметь негативное значение для прогноза течения заболевания. Это может быть обусловлено тем, что МТ контролирует тиреоидную функцию, в том числе митотическую активность фолликулярных клеток щитовидной железы [330] и включение 3Н-тимидина в ДНК клеток щитовидной железы [373]. Пинеалэктомия, стимулирущая рост щитовидной железы, может су лужить косвенным подтверждением этого предположения [374].
Вышеприведенные данные подтверждают наблюдения о подавлении циркадианной амплитуды МТ в плазме у пациентов с рецидивирующим зобом [272]. Представляется вероятным, что изменения в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси, модулируемые МТ, могут реципрокно влиять на пинеальную железу или, что тиреоидные факторы роста, секретируемые соответствующими опухолями, ингибируют выработку МТ [213]. Другой возможный механизм вероятно заключаться в том, что местные изменения гомеостаза, формирующиеся в щитовидной железе при опухолевом росте, негативным образом влияют на верхний шейный ганглий, который осуществляет симпатический контроль как над щитовидной, так и над пинеальной железами [94].
Известно, что злокачественная опухоль гортани у мужчин является андроген-зависимым новообразованием и имеет соответствующие рецепторы к стероидным половым гормонам. В карциномах гортани обнаружены рецепторы как к тестостерону, так и к эстрогену [207]. Поэтому и нормальная, и неопластическая ткань гортани являются эндокринно-зависимыми структурами, подверженными влияниям изменений, происходящих в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси, а также воздействию МТ.
Злоупотребление алкоголем и табакокурением являются основными факторами риска развития рака гортани [99, 342, 378]. При этом, возрастные изменения уровня циркулирующего тестостерона, наряду с результатом усиленного потребления алкоголя и табакокурения, по-видимому, могут являться важными ко-факторами, которые определяют чувствительность клеток гортани к опухолевой трансформации, первично обусловленной указанными вредными привычками [277].
Однако точная роль андрогенов в патогенезе рака гортани остается в значительной мере неясной. Максимум частоты возникновения рака гортани обнаруживается при сниженном уровне андрогенов, обусловленном возрастом, несмотря на то, что андрогены оказывают стимулирующее действие на слизистую оболочку гортани и её опухоли [379]. Аналогичный парадокс описан для рака простаты, который чаще всего развивается у пожилых мужчин, и во многих случаях является андроген-зависимым процессом [34].
При этом, повышенная аутокринная и паракринная продукция цитокинов, обусловленная увеличенной экспрессией онкогенов, может рассматриваться как компенсаторный механизм в отношении снижения уровня циркулирующих андрогенов, физиологически контролирующих развитие простаты и её функций, провоцирующий начальный и автономный рост злокачественных опухолей простаты.
Аналогичные механизмы могут лежать в основе развития рака гортани у пожилых мужчин, о чем свидетельствуют факты повышенного уровня циркулирующих андрогенов у этих пациентов [110].
Зарегистрированный негативный эффект потребления алкоголя на уровень циркулирующего МТ [342] может усугублять эндокринные расстройства у больных раком гортани. Это может выражаться в повышении уровня циркулирующего тестостерона, вследствие ингибирующего действия МТ на репродуктивную систему.
Снижение уровня циркулирующего МТ при злоупотреблении алкоголем, возможно, непосредственно стимулирует развитие рака гортани. Это может быть обусловлено ослаблением способности МТ поглощать свободные радикалы [339], нейтрализовать метаболиты этанола и ингредиенты табака (часто употребляемого вместе с алкоголем), обладающие высоким мутагенным потенциалом для ткани гортани.
Основной результат, полученный в наших исследованиях по изучению экскреции 6-СОМТ у больных с неоперированным первичным раком гортани, заключается в обнаружении явного влияния размера опухоли на ночную выработку МТ. Нами установлено, что при наличии относительно небольших опухолей (Т2) уровень секреции МТ заметно повышен, тогда как при наличии больших (Т4) опухолей отмечается подавление секреции МТ.
![Направления совершенствования организации раннего выявления и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов активного трудоспособного возраста в городской поликлинике [Электронный ресурс]](/i/i/4605/179223.png "Направления совершенствования организации раннего выявления и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов активного трудоспособного возраста в городской поликлинике [Электронный ресурс] Борисов Константин Николаевич")