Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Альтернариоз пасленовых культур 9
1.2 Современное представление о видовом составе грибов рода Alternariana пасленовых культурах
1.2.1 Таксономия рода Altemaria 14
1.2.2 Молекулярная идентификация видов Altemaria 18
1.2.3 Виды Altemaria - патогены пасленовых культур 19
1.2.4 Внутривидовое разнообразие видов Altemaria, ассоциированных с пасленовыми культурами 23
1.3 Патогенные свойства Altemaria spp. 25
1.3.1 Методы изучения взаимоотношений в патосистеме Altemaria spp. - паслёновые культуры 25
1.3.2 Патогенность возбудителей альтернариоза 29
Глава 2. Материалы и методы исследований 3 2
2.1. Изоляция грибов в чистую культуру 32
2.2 Идентификация и исследование макро- и микроморфологии изолятов 33
2.2.1 Исследование морфологических признаков 33
2.2.2 Оценка влияния условий культивирования на микроморфологические признаки изолятов мелкоспоровых видов 34
2.1.1 Коллекция чистых культур 35
2.3 Молекулярно-генетические методы 35
2.3.1 Выделение ДНК из мицелия грибов 35
2.3.2 Выделение ДНК из гербарного материала 36
2.3.3 Разработка праймеров, специфичных для комплекса видов A. solanV Ъ1
2.3.4 ПЦР с видосиецифичными праймерами 38
2.3.5 ПЦР с универсальными праймерами (UP-PCR) 39
2.3.6 ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (RAPD-PCR) 40
2.3.7 Визуализация результатов амплификации 41
2.4 Оценка патогенносте изолятов Altemaria 42
2.4.1 Условия эксперимента 42
2.4.2 Получение инокулюма и стимуляция спороношения г
2.4.3 Усовершенствование лабораторной методики оценки агрессивности крупноспоровых видов Alternaria 44
2.4.4 Оценка агрессивности видов Alternaria при совместном заражении 44
2.5 Статистические методы 45
Результаты и обсуждение исследований
ГЛАВА 3. Биоразнообразие и распространение грибов рода alternaria на пасленовых культурах на территории России 46
3.1 Разнообразие мелкоспоровых видов Alternaria по микро- и макроморфологическим признакам 46
3.1.1 Анализ морфологических признаков изолятов мелкоспоровых видов AIternaria 46
3.1.2 Влияние условий культивирования на морфологические признаки изолятов мелкоспоровых видов Alternaria
3.2 Разнообразие крупноспоровых видов Alternaria по микро- и макроморфологическим признакам 53
3.3 Распространение видов Alternaria на пасленовых культурах на территории России 3.3.1 Распространение видов Alternaria на картофеле 56
3.3.2 Распространение видов Alternaria на томате 58
3.3.3 Распространение видов Alternaria на перце 59
3.3.4 Распространение видов Alternaria на баклажане 60
3.3.5 Распространение видов Alternaria на декоративных пасленовых 60
3.3.6 Анализ видового состава возбудителей альтернариоза пасленовых культур 61
3.3.7 Создание коллекции чистых культур рода Alternaria 64
Глава 4. Молекулярная идентификация видового и внутривидового разнообразия грибов рода alternaria, распространенных на пасленовых культурах 65
4.1 Молекулярная идентификация видов Alternaria в пораженных растительных тканях 65
4.1.1 Разработка праймеров, специфичных к комплексу видов А. solanf 65
4.1.2 Молекулярная идентификация видов Alternaria в пораженных растительных тканях н
4.2 Дифференциация изолятов комплекса видов lA. solanV по молекулярным маркерам 70
4.3 Сравнительный анализ результатов морфологического и молекулярного исследования изолятов комплекса видов A. solanp 1А
Глава 5. Патогенность видов alternaria по отношению к картофелю и томату 76
5.1 Патогенность крупноспоровых видов Alternaria 76
5.1.1 Усовершенствование лабораторной методики оценки патогенности крупноспоровых видов Alternaria 76
5.1.2 Оценка патогенносте видов A. solani и A. tomatophila 79
5.2 Патогенность мелкоспоровых видов Alternaria 82
Выводы 86
Список использованной литературы
- Современное представление о видовом составе грибов рода Alternariana пасленовых культурах
- Исследование морфологических признаков
- Влияние условий культивирования на морфологические признаки изолятов мелкоспоровых видов Alternaria
- Дифференциация изолятов комплекса видов lA. solanV по молекулярным маркерам
Введение к работе
Актуальность темы. Представители рода Alternaria широко распространены в природе и встречаются на разнообразных субстратах. Многие виды являются возбудителями заболеваний растений, в т.ч. важных сельскохозяйственных культур из семейства пасленовых: картофеля, томата, баклажана, перца и табака. Альтернариоз поражает листья, стебли, клубни и плоды и обладает высокой вредоносностью. Потери урожая картофеля составляют 10-50% (Дорожкин и др., 1973; Воловик, Литун, 1975; Иванюк и др., 2003), потери урожая томатов могут достигать 78%-90% (Сайчук, 1989; Grogan et al., 1975; Rotem, 1994; Chaerani, Voorrips, 2006).
В систематике и номенклатуре рода Alternaria существует множество проблем. В отечественной литературе долгое время поддерживалось и встречается до сих пор мнение о существовании двух самостоятельных заболеваний: альтернариоза и макроспориоза, вызываемых Alternaria solani Sorauer и Macrosporium solani Ellis et Martin соответственно (Гор-денко, Абросимова, 1971; Дорожкин и др. 1973; Анненков, 1987), хотя эти видовые эпитеты были признаны синонимами в середине XX века (Neergaard, 1945; Ellis, 1971) . Кроме того, в работах прикладного характера, связанных с Alternaria, часто можно обнаружить результаты неточной идентификации: исследователи определяют вид возбудителя на основе малоинформативных культуральных и морфологических признаков или оценивая только симптомы заболевания. Такое положение порождает заблуждения о реальном видовом составе возбудителей, их специализации и распространенности.
В последние годы была проведена таксономическая ревизия рода Alternaria и было описано много новых видов, в т.ч. встречающихся на пасленовых. В настоящий момент систематики считают, что с картофелем и томатом консортивно связаны 14 видов Alternaria (Simmons, 1999, 2000, 2007) . Известно, что разные виды Alternaria могут существенно отличаться по физиологическим, экологическим свойствам и хозяйственному значению. Однако в России анализ видового состава возбудителей альтернариоза пасленовых с учетом современных таксономических концепций почти не проводился .
Цель и Задачи исследований. Цель настоящей работы - инвентаризация видового состава возбудителей альтернариоза пасленовых культур в России и анализ разнообразия видов Alternaria по комплексу морфологических признаков, пато-
генности и молекулярным маркерам. В задачи исследований входило:
Описание микро- и макроморфологии изолятов Alternaria .
Определение видового состава грибов рода Alternaria, ассоциированных с культурными растениями семейства пасленовых.
Усовершенствование диагностики возбудителей альтер-нариоза с использованием молекулярно-генетических методов. Подбор ДНК-маркеров для идентификации разных видов Alternaria.
Молекулярно-генетический анализ видового и внутривидового разнообразия крупноспоровых видов Alternaria, доминирующих на картофеле и томатах.
Оценка патогенности и специализации доминирующих видов-возбудителей альтернариоза пасленовых культур.
Научная новизна. Впервые в России на обширном материале различного географического происхождения и согласно современным представлениям о систематике рода проведена идентификация видов Alternaria, ассоциированных с пасленовыми культурами. Установлены границы ареалов видов на территории России. Из шести обнаруженных видов два идентифицированы в России впервые: A. arborescens E.G.Simmons и A. tomatophila E.G.Simmons.
Впервые проведен детальный анализ разнообразия крупноспоровых видов Alternaria на картофеле и томате по комплексу морфологических признаков, агрессивности и молекулярным маркерам.
Впервые изучена роль мелкоспоровых видов Alternaria в развитии заболевания. Установлено, что при совместном заражении с патогенным видом Alternaria мелкоспоровые виды значительно усиливают развитие некрозов.
Практическая Значимость. Создана коллекция штаммов Alternaria с пасленовых культур различного происхождения (4 67 штаммов). Сконструирована пара праймеров AslR/AslF для идентификации комплекса видов М. solani'. Усовершенствован метод молекулярной диагностики альтернариоза пасленовых культур, который позволяет в 90% случаев обнаружить и идентифицировать возбудителей альтернариоза непосредственно в растительной ткани.
Апробация работы. Результаты исследований обсуждались на ежегодных методических комиссиях ГНУ ВИЗР Россельхоза-
кадемии по аттестации аспирантов (Санкт-Петербург, 2008-2 011), а также были представлены на конференциях: Конференция профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного Аграрного Университета «Обеспечение развития АПК в условиях реформирования» (Санкт-Петербург, 2009); V Международная конференция «Изучение грибов в биогеоценозах» (Пермь, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция «Современные иммунологические исследования, их роль в создании новых сортов и интенсификации растениеводства» (Голицино, 2009); IV Региональная молодежная экологическая конференция «Экологическая школа в Петергофе - наукограде Российской Федерации»: «Биоразнообразие и биоиндикация в естественных и трансформированных экосистемах Северозападного региона» (Санкт-Петербург, 2009); Научная конференция аспирантов и молодых ученых "Генетика и селекция" (Санкт-Петербург, 2010); Второй Междисциплинарный микологический форум (Москва, 2010); Всероссийская научная конференция «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России» (Москва, 2 010) .
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ: проекты № 07-04-00096 и № 09-04-13753-офи_ц; Правительства Санкт-Петербурга (комитета по науке и высшей школе): ПСП № 10506; фонда 000 "Технологии. Внедрение. Наука": проект № 12650.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 в изданиях, рекомендуемых ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, 3 приложений, содержит 23 таблицы, 11 рисунков. Список библиографических источников включает 2 06 наименования, в том числе 159 на иностранных языках.
Место проведения работы. Научно-исследовательская работа проводилась в лаборатории микологии и фитопатологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ВИЗР) в 2008-2011 гг.
Автор выражает искреннюю благодарность доктору Э. Сим-монсу (США) за предоставленные штаммы, доктору биологиче-
ских наук Н. В. Мироненко за помощь в проведении молеку-лярно-генетических исследований, кандидату биологических наук Ф. Б. Ганнибалу за общую методическую поддержку.
Современное представление о видовом составе грибов рода Alternariana пасленовых культурах
Хотя альтернариоз распространен повсеместно, заболевание в основном проявляется в зоне с частыми дождями, высокой влажностью и относительно высокой температурой 24-29С. Эпифитотии на картофеле и томате могут случаться и в умеренном климате с обильными утренними росами (Rotem, Reichert, 1964), поскольку основной вид-возбудитель A. solani способен развиваться в широком диапазоне температур 4-36С (Pound, 1951).
На территории России альтернариоз ежегодно поражает до 47% растений картофеля в Центральном, Волго-Вятском, Центрально-Черноземном и Дальневосточном районах (Воловик, Литун, 1975). Развитие болезни отличается в разных агроклиматических зонах. Так, в Ленинградской области поражалось до 44% растений со степенью развития болезни в среднем 14%; в Вологодской, Смоленской, Брянской, Владимирской, Ярославской и Свердловской областях поражалось от 43% до 89% растений со степенью развития болезни 15-81%; в Чувашии и Марий Эл поражалось до 100% растений со степенью развития болезни 75% (Воловик и др., 1971). В Приморском и Хабаровской краях степень поражения растений картофеля достигала 40-50% (Коняева и др., 1980), на Камчатке - 50% (Саламатова, 1987). По оценкам исследователей уровень развития альтернариоза картофеля в Белоруссии в среднем составляет 50-70% (Дорожкин и др., 1973; Иванюк и др., 2003; Иванюк, Журомский, 2007).
По оценкам исследователей снижение урожая картофеля в европейской части России составляет 30-60% (Коняева и др., 1980; Дмитриева, 1988), на Дальнем Востоке достигает 40-50% (Нелен, Васильева, 1958; Рог-Кустов, 2003), на Камчатке - от 20% до 50% (Саламатова, 1987). Потери урожая картофеля в Белоруссии находятся в пределах 15-40% (Дорожкин и др., 1973; Иванюк и др., 2003; Иванюк, Журомский, 2007). Альтернариоз также является вредоносным заболеванием томатов. На территории России и Белоруссии уровень развития заболевания на томате составляет 20-86%) (Петровская, Столпникова, 1992). В Молдавии развитие альтернариоза томата в закрытом грунте достигает 40-45%), в открытом грунте - 50-55%) (Сайчук, 1998). В Индии альтернариозом поражается до 72% всех растений томата (Kumar et al., 2007).
Вредоносность альтернариоза обусловлена потерями урожая вследствие уменьшения фотосинтетической поверхности листьев и прямого поражения плодов и клубней (Rotem, 1994).
Потери урожая томата на территории России ежегодно отмечались в Астраханской, Брянской, Владимирской, Новгородской и Амурской областях (Осницкая, 1966). В Белоруссии потери урожая томатов составляли 23-36% при уровне развития болезни в закрытом грунте — до 80%, в открытом — до 60%о (Дорожкин, Иванюк, 1978); в Молдавии потери урожая достигают 10% на устойчивых сортах и 70% - на восприимчивых (Сайчук, 1989). По разным оценкам потери урожая томатов вследствие заболевания альтернариозом в Европе, Северной Америке, Азии и странах Африки достигают 78%-90% (Grogan et al, 1975; Sherf, MacNab, 1986; Rotem, 1994; Chaerani, Voorrips, 2006; Kumar et al, 2007), в т.ч. потери урожая из-за плодовой гнили - 20-40% (Sherf, MacNab, 1986; Bose et al., 2002).
Альтернариоз баклажана и перца также распространен по всей зоне выращивания этих культур: в Северной и Южной Америке (США, Канаде, Боливии и др.), в Европе и Азии (России, Болгарии и др.), Азии (Израиль, Индия и др.) и Австралии (Neengaard, 1945; Halfon-Meiri, Rylski, 1983; Vlotoglou, kalogerakis, 2000; Raja et al., 2006).
В настоящее время основными мерами борьбы с альтернариозом остается соблюдение севооборота, использование незараженного семенного материала и обработки фунгицидами. Применение фунгицидов часто экономически неоправданно и, по некоторым данным, малоэффективно (Sherf, MacNab, 1986; Bussey, Stevenson, 1991; Demir, Levent, 2002; Chaerani et al, 2007). Альтернативой выступает возделывание устойчивых сортов, однако, среди культивируемых сортов картофеля и томатов полностью устойчивые к заболеванию сорта отсутствуют (Дорожкин, Иванюк, 1978; Иванюк и др., 2003; Rotem, 1994; Vloutoglou et al, 2000; Demir, Levent, 2002; Rodriguez et al, 2006). Устойчивость картофеля и томатов к альтернариозу определяется возрастом растений: ранние и среднеранние сорта более восприимчивы, чем поздние (Rotem, 1994; Demir, Levent, 2002). Показателями устойчивости также являются инкубационный период, число некротических пятен, скорость их увеличения и способность к продуцированию спор на поверхности листьев (Pelletier, Fry, 1989, 1990; Christ, 1991; Christ, Haynes, 2001; Rodriguez et al., 2006).
Устойчивость зависит от многих особенностей растения. Так, с устойчивостью к альтернариозу коррелируют физиологические и биохимических показатели: осмотическое давление, содержание сухих веществ, проницаемость мембраны, активность ферментов (например, пероксидазы и о-дифенолоксидазы) и продуцирование фитоалексинов ришитина и любимина (Иванюк и др., 2003). Известно, что на уровень устойчивости пасленовых существенно влияет соотношение азот-фосфор в минеральном питании (Barclay et al., 1973).
Исследование морфологических признаков
Разделение смеси продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 1% или 1,5% агарозном геле. Агарозный гель готовили, смешивая навеску агарозы и буфер трис-борат-ЭДТА (ТВЕ-буфер: 89 мМ трис-HCL, 89 мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, рН 8.0). Полученную смесь нагревали до полного растворения агарозы, затем охлаждали до температуры 60С и добавляли раствор этидиум бромида для визуализации ДНК (конечная концентрация в геле 0.5—2.0 мкг/мл). После затвердевания геля в заливочной рамке её помещали в электрофоретическую камеру заполненную ТБЕ-буфером и вынимали гребенку. В пробирки с продуктами амплификации добавляли 2,5 мкл загрузочного буфера (15% фикол; 0,025% бромфеноловый синий; 0,025% ксиленцианол), перемешивали и вносили в лунки агарозного геля 5-10 мкл ПЦР-продукта. Для определения концентрации и веса продукта амплификации в гель вносили маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler ЮОЬр или Gene Ruler Express.
Электрофоретическое разделение продуктов ПНР проводили при напряжении 5-10 В на см длины геля. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора с длиной волны 254—312 нм. Положительными считали пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полосы положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считали отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы по размеру значительно отличались от фрагмента в положительном контроле.
Определение патогенности изолятов проводили в лабораторных условиях заражением листовых дисков пасленовых культур суспензией конидий.
Для заражения использовали листья растений, выращенных в лабораторных условиях. Картофель сорта «Невский» культивировали в пластиковых ведрах (диаметр 20 см, высота 20 см) и пластиковых контейнерах (длина 40 см, ширина 20 см, глубина 20 см), рассаду томатов различных сортов - в пластиковых горшках диаметром 12 см, высотой 10 см по 4 растения в каждом, затем рассаживали по 1 растению в глиняные горшки диаметром 15 см, высотой 12 см. Выращивание проводили на торфяном грунте («Садовая земля», ООО «Агрогатчинторф», Санкт-Петербург) при 20-25С и постоянном искусственном освещении. Полив и подкормку растений производили по мере необходимости.
Пробочным сверлом из листьев :вырезали диски диаметром 10 мм, при этом использовали листья среднего яруса 4-6 недельного возраста растений (Дорожкин, 1978; Киселев, 1985). Диски помещали в герметичные пластмассовые контейнеры (влажные камеры), стерилизованные спиртом, на увлажненную фильтровальную бумагу. При необходимости, листовые диски механически повреждали проколом в центе. Для смачивания фильтровальной бумаги, уложенной на дно влажных камер, использовали воду для дисков томата и 4 гаМ раствор 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) для дисков картофеля (Bussey, Stevenson, 1991).
Для заражения в центр диска наносили каплю 10 мкл суспензии конидий, в контроле на диск наносили 10 мкл стерильной воды. Влажную камеру инкубировали в термостате КС-200 СПУ в режиме: 16 ч. освещения люминисцентными лампами (10 ламп OSRAM L 18W/640 cool white, расположенных вертикально) при 24С и 8 ч. темноты при 18С. Учет заражения проводили визуально оценивая процент площади некроза листового диска. Каждый вариант опыта был представлен тремя повторностями по 10 листовых дисков.
Для получения инокулюма изоляты комплекса A. solani выращивали в чашках Петри на среде V4 под эритемными лампами (две лампы ЛЭ-30, длина волны 400-500 нм, на расстоянии 30 см от поверхности полки) при 22-24С в течение 7 сут. Затем с поверхности колоний стерильным скальпелем удаляли воздушный мицелий и помещали под эритемные лампы для формирования конидиеносцев. Через 1-2 сут. для формирования спороношения чашки помещали на 1-2 сут. в холодильник при 4С.
Для получения инокулюма изоляты мелкоспоровых видов Alternaria выращивали на картофельно-морковном агаре в течение 7 сут при 22-24С и полном затемнении.
Инокулюм получали смывом конидий непосредственно с колоний в стеклянных чашках Петри, добавляя 5 мл стерильной водой с tween-60 (0,01%). Определение концентрации производили подсчетом числа конидий в камере Горяева, после чего разбавляли суспензию до нужной концентрации стерильной водой. 2.4.3 Усовершенствование лабораторной методики оценки агрессивности крупноспоровых видов Alternaria
Оптимальный инкубационный период устанавливали, оценивая результаты инокуляции листовых дисков томата сорта «Агата» суспензией конидий вида A. solani концентрацией 5x103 конидий/мл ежедневно с 3 по 7 сутки.
Оптимальную инфекционную нагрузку при оценке патогенности крупноспоровых видов определяли, проводя параллельное заражение листовых дисков томата сорта «Агата» суспензиями конидий в следующих концентрациях: 2,5x103, 5хЮ3, 1x104, 5х104 конидий/мл. Результаты инокуляции учитывали на 5 сут.
Оптимальный сорт томата для определения патогенности вида А. solani определяли, проводя параллельное заражение листовых дисков 10 сортов томатов инкулюмом с концентрацией 5хЮ3 конидий/мл. В работе использовали ультраранние (Полярный скороспелый и Сибирский скороспелый), раннеспелые (Агата, Балтийский, Бенито, Красная стрела, Ракета и Сибирский румянец) и среднеспелые (Демидов и Парадиз) сорта томата. Учеты результатов заражения проводили на 5 сут.
Оценку совместного действия видов A. tenuissima и A. solani в патогенезе готовили систему смешанных инокулюмов с концентрациями 1хЮ2, 1хЮ3, 1хЮ4, 1x10s конидий/мл суспензии мелкоспорового вида и 5хЮ2, 1хЮ3, 5x103 конидий/мл крупноспорового вида в различных сочетаниях. Проводили заражение как механически поврежденных, так и неповрежденных листовых дисков. В качестве контролей использовали незараженные диски и диски, зараженные моносуспензиями. Результаты оценивали на 5 сут после инокуляции.
Влияние условий культивирования на морфологические признаки изолятов мелкоспоровых видов Alternaria
При проведении ПЦР был получен положительный результат при амплификации с ДНК крупноспоровых видов: A. acalyphae, A. cichorii, А. cirsinoxia, A. dauci и A. porri. Однако эти виды специализированы к поражению растений других семейств: акалифы (сем. Enphorbiaceae), цикория, бодяка (сем. Asterdceae), моркови (сем. Umbelliferae) и лука (сем. Allidceae) соответственно.
Таким образом, разработанная пара праймеров обладает частичной групповой специфичностью для крупноспоровых видов Alternaria, но такая групповая специфичность не может быть причиной ложно-положительных результатов при идентификации видов Alternaria, распространенных на пасленовых культурах. Разработанная пара праймеров AslF/AslR может быть использована для идентификации комплекса видов iA. solan? на картофеле и томате.
Молекулярную идентификацию видов Alternaria осуществляли с помощью ПЦР с специфичными праймерами. Были получены следующие результаты, сопоставленные с результатами выделения возбудителей из этих же образцов традиционным методом с помощью влажных камер (табл. 4.1.2.1).
При амплификации с праймерами AslR/AslF положительный результат был получен для 19 проб, тогда как при амплификации с праймерами AUViTS4, обладающими сходной специфичностью (McKay et al, 1999), -только для 7 проб, причем положительные результаты праймеров ALPATS4 совпадали с положительными результатам праймеров AslR/AslF. Вероятно, что ПЦР с праймерами ALP/ITS4 обладает меньшей чувствительностью, что является причиной ложно-отрицательных результатов. Таблица 4.1.2.1 Результат амплификации ДНК грибов из пораженных растительных тканей со специфичными праймерами результаты традиционного метода и ПЦР совпадают вид найден только с помощью ПЦР вид, не найден с помощью ПЦР, но обнаружен традиционным методом Результаты, полученные молекулярным и традиционным методами, на 82% совпадали. Если принять, что обнаружение вида хотя бы одним методом — это положительный результат, а не обнаружение обоими методами - отрицательный (отсутствие патогена этого вида), то с помощью ПНР обнаружено 97% всех возбудителей, а традиционным методом — 84%. Из всех обнаруженных возбудителей 15% патогенов комплекса А. solani и 29% патогенов вида A. infectoria были найдены только молекулярным методом.
Представители комплекса A. solani очень чувствительны к условиям среды и могли утратить жизнеспособность в результате обработок фунгицидами. Кроме того, во влажных камерах изоляты этих видов не всегда образуют спороношение, поэтому при обилии конидий других видов могут быть не замечены. Вид A. infectoria характеризуется сравнительно малой скоростью роста и невысокой интенсивностью спороношения, поэтому при наличие на некротическом пятне других видов грибов, в т.ч. других видов Alternaria он может быть не выявлен.
Из всех обнаруженных возбудителей альтернариоза в 8% образцов А. solani был найден только традиционным методом. Это можно объяснить малым объемом материала, который отбирается для молекулярного анализа. Из пораженного листа растения вырезается 1 пятно, которое не обязательно содержит все виды возбудители, присутствующие в образце. Поэтому для большей достоверности необходимо брать 2-3 пятна одного образца.
Таким образом, молекулярный методы с использованием специфичных праймеров позволяют быстро и с высокой достоверностью идентифицировать видовой состав возбудителей альтернариоза.
С помощью молекулярных методов обнаружено присутствие ДНК мелкоспоровых видов комплекса A. alternatd во всех образцах, тогда как ДНК видов комплекса A. solanf встречалась только в части образцов, что согласуется с полученными нами ранее результатами об ограниченной зоне распространения видов комплекса A. solanf и повсеместном распространении мелкоспоровых видов Alternaria. 4.2 Дифференциация изолятов комплекса видов tA. solan? по молекулярным маркерам
Была проведена дифференциация изолятов комплекса видов A. solani с применением молекулярно-генетических методов: UP-PCR с 4 праймерами и RAPD с 1 праймером. Для этого из коллекции были выбраны 67 изолятов различного географического и субстратного происхождения, которые включали типовые изоляты видов A. solani и A.tomatophila, а также изолят вида A. dauci в качестве внешней группы. В результате были получены 18 маркеров, на основании которых построена матрица различий. Происхождение изолятов и маркерные последовательности представлены в таблице 4.2.1.
Дифференциация изолятов комплекса видов lA. solanV по молекулярным маркерам
Распределение на кладограмме эталонных штаммов также коррелировало с субстратным происхождением. Штамм вида A. solani оказался в «картофельном» кластере, а штаммы вида A. tomatophila попали соответственно в «томатный» кластер. Можно предположить, что эти два кластера представляют разные виды: один кластер — «томатный» вид А. tomatophila, другой - «картофельный» вид A. solani. Т.к. «томатный» кластер представлен только изолятами с томата, а «картофельный» включает изоляты с разных растений-хозяев, возможно, что вид A. tomatophila обладает более узкой специализацией, чем A. solani. Генетическое различие между видами невелико и составляет 30%. Возможно, вид A. tomatophila является более «молодым» появился в результате специализации отдельных клонов из популяций A. solani к паразитированию на томате.
Таким образом, мы впервые показали присутствие на территории России нового вида-возбудителя альтернариоза пасленовых культур - А. tomatophila.
Анализ размера конидий изолятов A. solani и A. tomatophila, идентифицированных с помощью молекулярно-генетических методов, позволил уточнить описания видов и провести условную границу между морфологическими параметрами видов (рис. 4.3.1).
Изоляты обоих видов комплекса образуют конидии с близкой длиной корпуса, однако конидии вида A. tomatophila имеют более длинные апикальные выросты. Тем не менее, диапазоны варьирования морфологических параметров видов A. solani и A. tomatophila перекрываются, поэтому не всегда возможно надежно идентифицировать изоляты комплекса Л. solanf без привлечения молекулярно-генетических методов. 210,0 190,0 170,0 150,0 130,0
Оптимальный инкубационный период устанавливали, оценивая результаты инокуляции листовых дисков томата сорта «Агата» суспензией конидий изолята вида A. solani MFP604011 с концентрацией 5 103 конидий/мл. Появление первых симптомов инфицирования (развитие некроза) наблюдалось на 2 сут. после инокуляции. Начиная с 5 сут. происходило появление и интенсивное развитие хлорозов листовых дисков, которые затрудняли корректную оценку площади некроза. Таким образом, оптимальным оказался инкубационный период 5 сут., в течение которого происходило значительное развитие некрозов и отсутствовало развитие хлорозов.
Определение оптимальной инфекционной нагрузки. Нанесение 10 мкл суспензии с концентрацией 2,5x103 конидий/мл оказалось недостаточным для заражения - на 5 сут. наблюдались точечные некрозы листового диска под каплей инокулюма. Отсутствие четкой границы хлороз-некроз в вариантах концентраций 1x104 и 5x104 конидий/мл затруднило корректную оценку площади некроза. Оптимальной оказалась концентрацию инокулюма 5x103 конидий/мл.
При учете результатов затруднительно точно визуально оценить площадь некроза, если поражено больше половины диска. Поэтому целесообразно для оценки агрессивности коллекции изолятов A. solani использовать такой сорт томата, при заражении листовых дисков которого некрозы дисков не превышают 50%, но изоляты гриба значительно различаются по агрессивности.
Максимальный диапазон варьирования площади некроза изоляты демонстрировали при заражении сорта Красная Стрела (разница между максимальным и минимальным некрозом составило 40,6%) и сорта Балтийский (разница 36,8%), минимальный диапазон варьирования был показан для сорта Демидов (разница 27,1%).
