Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1 Эпимеризация авермектина 11
1.2 Методы синтеза авермектина 16
1.3 Методы деградации молекулы авермектина 20
1.4 Получение 4 и 4а-производных авермектина 22
1.5 Получение 4-производных авермектина 28
1.6 Получение оксо-соединений авермектина 35
1.7 Получение различных алкилпроизводных авермектина 40
2 Химическая часть 47
2.1 Разделение метильной и этильной компонент авермектина ВЭЖХ 48
2.2 Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот 53
2.3 Силилирование авермектина по 5-гидроксильной группе 59
2.4 Ацилирование силильного производного авермектина по 4-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот 60
1.1 Ацилирование авермектина ангидридами холеновых кислот 70
1.2 Ацилирование авермектина по 4-гидроксильной группе ангидридами холеновых кислот 74
3 Экспериментальная часть 79
3.1 Исходные соединения 79
3.2 Применяемые методы анализа 79
3.3 Методики синтеза соединений 80
3.3.1 Ацилирование авермектина малеиновым ангидридом 80
3.3.2 Ацилирование авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты 81
3.3.3 Ацилирование авермектина ангидридом 5-фенилбицикло[2.2.1]гептан-2,3-дикарбоновой кислоты 81
3.3.4 Ацилирование авермектина ангидридом трицикло[3.2.2.02,4 ]нон-8-ен-6,7-дикарбоновой кислоты 82
3.3.5 Ацилирование авермектина ангидридом циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоновой кислоты 83
3.3.6 Ацилирование авермектина ангидридом бензол-1,2-дикарбоновой кислоты 84
3.3.7 Ацилирование авермектина ангидридом бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2,3-дикарбоновой кислоты 84
3.3.8 Ацилирование авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1] гексан-2,3-дикарбоновой кислоты 85
3.3.9 Ацилирование авермектина ангидридом 3,4,5,6-тетрахлорбензол-1,2-дикарбоновой кислоты 86
3.3.10 Силилирование 5-ОН группы авермектина трет-бутилдиметилсилилхлоридом 87
3.3.11 Удаление силильной защиты 88
3.3.12 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом малеиновой к-ты 88
3.3.13 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой к-ты 89
3.3.14 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 5-фенилбицикло[2.2.1]гептан-2,3-дикарбоновой кислоты 89
3.3.15 Ацилирование авермектина ангидридом трицикло[3.2.2.02,4 ]нон-8-ен-6,7-дикарбоновой кислоты 90
3.3.16 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом циклогексен-1,2-дикарбоновой кислоты 91
3.3.17 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом бензол-1,2-дикарбоновой кислоты 92
3.3.18 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2,3-дикарбоновой кислоты 93
3.3.19 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 3,4,5,6-тетрахлорбензол-1,2-дикарбоновой кислоты 93
3.3.20 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1 ]гексан-2,3-дикарбоновой кислоты 94
3.3.21 Синтез ангидрида А5-Зр-ацетоксихоленовой кислоты 95
3.3.22 Синтез ангидрида А4-3-кето-холеновой кислоты 95
3.3.23 Синтез ангидрида дегидрохоленовой кислоты 96
3.3.24 Ацилирование авермектина ангидридом А5-Зр-ацетоксихоленовой кислоты 96
3.3.25 Окисление по Оппенауэру холеновой кислоты 97
3.3.26 Ацилирование авермектина ангидридом А4-3-кето-холеновой кислоты 97
3.3.27 Ацилирование авермектина ангидридом дегидрохоленовой кислоты 98
3.3.28 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом А5-ЗР-ацетоксихоленовой кислоты 99
3.3.29 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом дегидрохоленовой кислоты 100
3.3.30 Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом А4-3-
3.3.31 Методика разделения метильной и этильной компонентов авермектина методом ВЭЖХ 101
3.3.32 Методика скрининга противопаразитарной активности 5-О-производных авермектина За-і на олигохетах Tubificidal tubifex 102
Заключение 104
Список принятых сокращений 105
- Получение 4 и 4а-производных авермектина
- Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот
- Ацилирование авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты
- Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1 ]гексан-2,3-дикарбоновой кислоты
Получение 4 и 4а-производных авермектина
Полный синтез авермектина был рассмотрен в статьях [21, 22]. Изначально также получали агликон из трех субъединиц, состоящих из фрагмента гексагидробензофурана (А), спирокеталя - сегмент (B), а также ациклической части (С), включающей атомы C9-C15. Каждый из сегментов синтезировали отдельно и затем соединяли. Присоединение осуществляли в последовательности B+C (B - C) + А, и полный синтез завершали путем присоединения к агликону дисахарида L-олеандрозил-L- олеандрозы.
Также 16-стадийный синтез единичного фрагмента спирокеталя молекулы авермектина В1 описан в статье [23]. В другой работе [24] синтезировали олигосахариды из тиофенилсахаров через гликозилфториды, которые затем использовали для синтеза авермектина В1а.
В работе [25] сообщается о первом синтезе (+)-авермектина B1a. Его получение основано на стереоспецифическом полном синтезе "северного" C11-C28 сегмента молекулы авермектина, полученного из (S)-яблочной кислоты и L-изолейцина и последующим соединением с функционализированным "южным" сегментом, макролактонизации, стереоконтролируемого гликозилирования.
Важным фактором при планировании синтеза авермектина является наличие необходимых единиц дисахаридов. Данишевский с сотрудниками [26] решили эту проблему, разработав полный синтез олеандрозил-олеандрозы (10 стадий из ацетальдегида до гликаля - аналога 2-4"-ацетата). Другой полный синтез производных дисахаров был описан Николау [27], Ватс [28] и Барретом [29]. Альтернативный метод состоял в получении олеандрозил-олеандрозы путем химической деструкции природного авермектина [30]. В другой работе [31] для получения желаемого дисахарида авторы предлагали двухстадийную деструкцию авермектина, используя озон, метилсульфид и далее DBU (схема 1.7).
Авермектин является одним из нескольких натуральных продуктов, который получают с помощью итерационного гликозилирования, то есть посредством образования связи с олигосахаридами. В работе [32] присоединение различных остатков сахаров, катализируемое олеандрозил-дисахаридами, происходило тандемно без полного биохимического синтеза авермектина. Это исследование значительно расширило набор известных D-сахаров нуклеотидных субстратов и обеспечило быстрый одностадийный синтез для создания 50 различных гликозилированных авермектинов. 1.3 Методы деградации молекулы авермектина
Помимо введения в структуру авермектина различных функциональных групп, ряд авторов [33, 34] также проводили и его деструкцию, чтобы получить соответствующие функциональные сегменты. Последние могут быть использованы для подтверждения структуры промежуточных соединений, а также в качестве прекурсоров гибридных или полусинтетических аналогов (схема 1.8). В статье [35] рассмотрена деструкция авермектина с помощью DBU в метаноле с получением нескольких продуктов, основным из которых был дельта-2,3-секо-метиловый эфир кислоты, который может быть использован, как исходный материал для синтеза аналогов авермектина. При выборе в качестве растворителя диэтиламин был получен единственный продукт (выход 90 %) дельта-2,3-изомер авермектина B1 (схема 1.9). O Me
В работе [36] были рассмотрены несколько возможных путей деградации авермектинов, в том числе кислотно-катализируемое сольволитическое замещение группы олеандрозы, что приводило к моносахариду и агликону, а также присоединение молекулы растворителя к 22-23 двойной связи авермектина. При гидролизе авермектина в водном THF, содержащем 10 % концентрированной H2SO4, получалась смесь моносахаридов 5 и 6 агликона (рисунок 1.3), из которой чистые агликоны были выделены только с помощью колоночной хроматографии. При применении кислотно-катализируемого метанолиза чистый агликон 6 также не был получен. Замена метанола на 2-пропанол привела к селективному расщеплению только олеандрозил-олеандрозы связи и получению моносахарида 7 с хорошим выходом.
Из полученного 4а-гидроксипроизводного авермектина получали другие продукты (рисунок 1.4), замещенные по 4а-положению авермектина [38]. модействие бромэтилсилильного эфира авермектина в присутствии трибутилхлорида олова (n-Bu3SnCl), азодиизобутиронитрила (AIBN) и цианоборогидрида натрия (NaCNBH3), и последующая обработка продукта перекисью водорода (окисление по Тамао). Авторы отмечали получение неожиданного продукта реакции - 17-членного циклического лактона 9, полученного с большим выходом (46 %), чем ожидаемый 16-членный лактон 8 (менее 5 %), и связывали это с тем, что происходила внутримолекулярная перегруппировка циклогексильного радикала в более устойчивый циклопентилметильный радикал (схема 1.13). HO
К-(фенилселено)фталимид/ BuP/ CH С1 Схема 1.14 Перегруппировка селеноксида в пиридине в присутствии перекиси водорода приводила к единственному изомеру 13. Примечательно, что оба синтеза (11 в 12 в 13) могут быть осуществлены в одну стадию с выходом более 90 %. Сульфонилирование продукта 14 и последующий бромонолиз гладко приводил к продукту 15 (схема 1.15). сравнении с авермектином B1а и ивермектином против желудочно-кишечных гельминт. Наиболее серьезными проблемами перед любым синтезом этих молекул являются контроль конфигурации и подавление подвижности С2-стереоцентра.
Производные авермектина, модифицированные по 3 и 4 положению, описаны в патенте [43]. 3-Гидрокси- и 4-оксо-, эпокси- и гидрокси-(гидроксиметил-)-производные получали из природного авермектина путем экзоциклического смещения 3,4-двойной связи в 4,4а-положение и образованием 3-гидроксигруппы. 4а-метильную группу замещали на фенилселеногруппу используя N-(фенилселено)фталимид. Соединение 23 далее обрабатывали пероксидом водорода в пиридине с получением стереоизомерной пары 23А и 23В (рисунок 1.5).
Ацилирование авермектина по 5-гидроксильной группе ангидридами дикарбоновых кислот
Производные авермектина, в которых одно из 4а, 5 или 4 положений замещено на фтор группу, описаны в патенте [52]. Соединения были получены замещением гидроксильной или другой легко уходящей группы на фтор. Фторпроизводные проявили высокую активность против паразитов и сельскохозяйственных вредителей.
Для повышения стабильности полученного соединения при применении его в качестве сельскохозяйственного инсектицида, авторы описывали получение соли бензойной кислоты 4"-деокси-4"-эии-метиламино-авермектина [53]. После силилирования по 5 гидроксильной группе авермектина, продукт подвергали взаимодействию с оксалилхлоридом и ДМСО в сухом СН2С12. Продукт 5-0-ТЬЮМ8-4"-оксоавермектин вводили в реакцию с ледяной уксусной кислотой в метаноле, газообразным метиламином и цианоборогидридом натрия с получением 4"-дезокси-4"-эии-метиламино-авермектина. После удаления силильной защиты и обработки бензойной кислотой получали желаемую соль с выходом 95 %. Фотоаффинное мечение было успешно применено учеными Merck в действии авермектинов с использованием радиоактивного лиганда 27 (рис. 1.8), в котором 4 -амино-4 -дезокси-авермектин был связан с 4-азидо-3-иодсалициловой кислотой, присоединенной к аминогруппе с помощью -аланил--аминокапроил цепочки [54]. Фотоаффинность (сродство, появляющееся под действием света) была рассмотрена позднее другими авторами [55]. Эфиры 28 были получены в две стадии обработкой агликона 5-О-трет-бутилдиметилсилилавермектина N-(2,2,2 трихлорэтоксикарбонил)--аланином и пивалоилхлоридом в присутствии триэтиламина. Ацилирование незамещенной аминогруппы проводили бензоилхлоридом для получения соединения 28а или производными азидобензойной кислоты для получения соединений 28b-28d в присутствии DCC или N-гидроксисукцинимидил эфира 4-азидо-2-гидроксибензойной кислоты и 4 гидрокси-2-иодобензойной кислоты для 28е и 28f соответственно. Соединения эфирного типа 29-31 были получены из агликона 5-О-трет бутилдиметилсилилавермектина, моносахарида 5-О-трет бутилдиметилсилилавермектина, 5-О-трет-бутилдиметилсилилавермектина B1a сочетанием с феноксиэтоксиметилхлоридом или 2-(2-азидо-4 йодофенокси)этоксиметилхлоридом и последующим снятием защиты с 5-гидроксильной группы. В результате данного исследования был получен набор фотоаффинных проб, являющихся эффективными против млекопитающих и насекомых (рисунок 1.8). он о
В статье [56] авторы также отмечали получение неожиданного циклического производного в реакции 4",5,7-О-три-триметилсилил-(ТМ8)-авермектин-8,9-оксида с п-толуолсульфокислотой в водном THF (схема 1.21), в то время как взаимодействие авермектин-8,9-оксида в подобных условиях приводило к получению ожидаемого 8,9-диола.
Схема 1.21 Высокая биологическая активность авермектин-8,9-оксида побудила изучить синтез и реакции других эпоксидов авермектина. Так в [57] рассмотрен способ получения авермектин Bl-3,4-оксида, а также аналогов на его основе. Для получения нужного 7-О-ТМS-авермектина В1 исходный авермектин обрабатывали N,O-бис-триметилсилил-трифторацетамидом (BSTFA), затем десилилировали две триметилсилил-эфирные группы п-толуолсульфокислотой. Продукт подвергали эпоксидированию в присутствии трет-бутилгидропероксида и оксида ванадия с получением авермектин Bl -3,4-оксида (схема 1.22).
Реакционную способность полученного авермектин Bl-3,4-оксида проверяли на взаимодействии с нуклеофилами: триэтиламин/тиофенол и 4-метокси-2-фенилэтиламин/DBU в метаноле. Однако продукты реакции обладали меньшей биологической активностью, чем исходное соединение.
Во время экспериментов связанных с окислением, авторы [58] обнаружили, что ацетат ртути селективно реагирует с 3,4-двойной связью в результате замещения у C3-атома и сдвига двойной связи в 4,5-положение, превращая аллильную метоксигруппу в лабильный виниловый эфир. Авермектин дает при нагревании с Hg(OAс) в безводном толуоле при 100 С в течение 30-60 минут метиловый эфир 3а-ацетокси-4,5-енола в качестве основного продукта с выходом 73 %. Эфир ацетоксиенола не был стабильным в условиях реакции и постепенно
преобразовывался в 5-оксо-авермектин B2а, уже ранее полученный из авермектина окислением MnO2. Кетон также можно было получить в результате гидролиза эфира енола в ледяной уксусной кислоте в течение 5 часов при комнатной температуре, что происходило с одновременным устранением 3а-ацетокси группы (схема 1.23). Стереоспецифическое восстановление кетона NaBH4 приводило к 5-оксо-авермектину B2a с выходом 74 %.
Стадии окисления авермектина, включающие синтез 5-оксо-производных путем окисления аллильного C5-гидроксила оксидом марганца (IV) были рассмотрены в статье[59].
Получение 8а-оксо-авермектина описано в работе [60]. Исходный авермектин с защищенными гидроксильными группами в 5-,7- и 4-положениях обрабатывали пиридинийдихроматом в диметилформамиде и получили с выходом 70 % 8а-оксо-производное авермектина (схема 1.24).
Схема 1.24 Важным шагом в получении производных авермектина является поиск реагентов, обеспечивающих селективное гидрирование двойных связей в молекуле. Большим достижением было получение ивермектина при гидрировании С22-23 двойной связи катализатором Уилкинсона [61]. Гидрирование авермектина водородом с палладием на угле привело к получению ряда продуктов восстановления, в основном 10,11,22,23-тетрагидропроизводных. В поисках реагента с необходимой региоспецифичностью авторы [62] предложили для селективного насыщения 10,11-двойной связи гипобромную кислоту, получаемую из N-бромацетамида в водном ацетоне.
Ацилирование авермектина ангидридом циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты
Анализ данных таблицы свидетельствует, что противопаразитарные соединения более активны по сравнению с известными средствами. Так, например, как видно из таблицы 2.2, известное средство «клозантел» значительно уступает предлагаемым соединениям. Что же касается авермектина В1, то при его использовании для поражения 80-100 % олигохет при концентрации 25 мкг/мл необходима экспозиция в течение 180 минут, тогда как при использовании предлагаемых соединений для достижения такого же эффекта требуется в шесть раз меньше времени (30 минут).
Анализ противопаразитарной активности 4-О-производных авермектина в НИЛ Бионаноиммунологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина на олигохетах Tubificidal tubifex показал, что все полученные и исследованные вещества имели аналогичную высокую активность, превосходящую активность известных препаратов, используемых в качестве контроля. Следовательно синтезированные новые карбоксилсодержащие 5-О- и 4-О-ацилпроизводные авермектина могут быть использованы для замены препарата, к которому развилась резистентность у паразитов с течением времени.
Ацилирование авермектина ангидридами холеновых кислот Следующим аспектом нашей работы была попытка провести ацилирование авермектина ангидридами, содержащими стероидный фрагмент. Поскольку стероиды обладают высокой биологической активностью, то можно было предположить, что стероидные производные авермектина проявят, помимо противопаразитарной активности, дополнительный набор свойств. В связи с этим перед нами стояла перспективность синтеза новых препаратов на основе авермектина и холеновых кислот с целью улучшения их фармакокинетических свойств, таких как растворимость, биодоступность и низкая токсичность. Для получения ангидридов были опробованы несколько методик с пентаоксидом фосфора и Л -дициклогексилкарбодиимидом в сухом хлористом метилене. Реакция с пятиокисью фосфора не прошла, с DCC впервые был получен ангидрид 5-Зр-ацетоксихоленовой кислоты 8 с выходом 78 % (схема 2.5).
Для получения 4-3-кето-холенового ангидрида сначала проводили окисление холеновой кислоты по Оппенауэру (схема 2.7). К раствору холеновой кислоты в сухом толуоле прибавляли свежеперегнанный циклогексанон и раствор изопропоксида алюминия Al(i-PrO)3 в сухом толуоле. Реакционную смесь кипятили 3 часа, обрабатывали 30 % раствором уксусной кислоты, органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaHCO3 и после перегонки с водяным паром получили продукт реакции с выходом 66 %.
Далее авермектин ацилировали ангидридами Д5-ЗР-ацетоксихоленовой, 4-3-кето-холеновой, дегидрохоленовой кислот по методике, указанной выше, в сухом хлористом метилене и DMAP в качестве катализатора в течение 15-20 суток при комнатной температуре. После обработки получали продукты реакции 14-16 с выходом от 76-87 % (схема 2.8). О
Доказательство структур продуктов, ацилированных по 5-ОН группе ангидридами стероидных структур, основано на данных ЯМР 1Н спектроскопии и хромато-масс спектрометрии. ПМР спектр молекулы авермектина оставался постоянным и изменения, отраженные в ЯМР 1Н-спектре относились только к ацильному фрагменту. Например, в случае соединения 16 появились сигналы от 18-СH3 и 19-СН3 групп в области 1,12 м.д. и 1,02 м.д. соответственно (рисунок 2.13). Рисунок 2.13 - Спектр ЯМР 1Н соединения 16
Необходимо отметить, что молекула авермектина термолабильна, она не выдерживает нагревания при высокой температуре, так как это приводит к исчезновению биологической активности. Этим определяется относительно невысокая температура реакции и достаточно большая длительность процесса ацилирования.
Таким образом, взаимодействием стероидных карбоновых кислот с N,N-дициклогексилкарбодиимидом в сухом хлористом метилене впервые получены ангидриды 5-3-ацетоксихоленовой, 4-3-кетохоленовой, дегидрохоленовой кислот. Также синтезированы ранее не описанные стероидные 5-О- производные авермектина путем его ацилирования ангидридами соответствующих кислот.
Ацилирование авермектина полученными ангидридами стероидных молекул по 4"-ОН группе проводили, предварительно получив соединения (рисунок 2.14) с силильной защитой 5-ОН группы, как указано выше. Alk = Me, Et
После выделения продукты реакции подвергались гидролизу для снятия TBDMS-защиты. Реакцию проводили действием на раствор ацилированного 5-OBDMS-производного в THF 0,1 N водным раствором HCl при комнатной температуре и перемешивании, контроль реакции осуществляли по ТСХ.
Доказательство структур продуктов, ацилированных по 4-группе ангидридами стероидных структур, основано на данных ЯМР 1Н спектроскопии и масс спектрометрии. ПМР спектр молекулы авермектина оставался постоянным и изменения, отраженные в ЯМР 1Н-спектре относились только к ацильному фрагменту. Например, в случае соединения 19 появились сигналы от 18-СH3 и 19-СН3 групп в области 1,13 и 1,03 м.д. соответственно, 2.06 м.д. от -CH3(-ОAc), сигналы в области 0,92 м.д. и 0,12 м.д. от силильной группы (рисунок 2.15).
Рисунок 2.15 - Спектр ЯМР 1Н соединения 19
В масс-спектре был обнаружен пик молекулярного иона соединения 19 1402,8926 [M+NH4]+ (рисунок 2.16).
Масс спектр высокого разрешения соединения 19 В случае соединения 17 появились сигналы от 18-СH3 и 19-СН3 групп от стероидной молекулы в области 1,12 и 1,02 м.д. соответственно, сигналы в области 0,92 м.д. и 0,12 м.д. от силильной группы (рисунок 2.17).
Впервые синтезированы стероидные 4-О-производные авермектина путем ацилирования 5-ОBDMS-авермектина ангидридами 5-3-ацетоксихоленовой, 4-3-кетохоленовой, дегидрохоленовой кислот.
Синтезированные 5-О- и 4-О-производные авермектина, содержащие стероидный фрагмент, переданы на биологические испытания в НИЛ Бионаноиммунологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина. Предварительные данные показали, что активность авермектинов, содержащих стероидные фрагменты выше, чем у аналогичных производных нестероидных карбоновых кислот.
Таким образом, поскольку все синтезированные соединения проявили высокую противопаразитарную активность, то каждое из них в дальнейшем может быть использовано для замены препарата, к которому развилась резистентность у паразитов в результате систематического применения. При выборе веществ для расширенных испытаний и возможного практического применения, на первый план выступали такие характеристики, как доступность и цена исходных соединений, а также простота получения и выделения целевых продуктов. Кроме того, имеет значение молекулярная масса соединений, поскольку меньшая молекулярная масса обеспечит лучшую эффективность при использовании. Для расширенных испытаний и в качестве продукта, рекомендованного для внедрения, был выбран гемималеинат авермектина. В случае возникновения резистентности у паразитов, он может быть заменен любым синтезированным нами соединением.
Лекарственные препараты на основе синтезированных в данной работе веществ могут найти широкое применение – для лечения крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, пушных животных, а также птиц и рыб.
Результаты исследования могут быть использованы для постановки опытно конструкторских работ (ОКР) по разработке промышленного производства препаратов, а последующие работы приведут к коммерческим продуктам, которые, учитывая отсутствие на рынке предложения новых противопаразитарных средств, найдут спрос не только в России, но и на международном рынке противопаразитарных лекарственных препаратов.
Ацилирование силильного производного авермектина ангидридом 4,5-дибромбицикло[2.2.1 ]гексан-2,3-дикарбоновой кислоты
Растворяют 0,200г (2,29Ю 5 моль) авермектина в сухом СН2С12, вносят 0,043 г (5,92Ю-5 моль) ангидрида А4-3-кето-холеновой кислоты и добавляют каталитическое количество 4-диметиламинопиридина (DMAP) (10мг). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 13 суток (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь выливают в воду. Полученный мелкокристаллический осадок экстрагируют этилацетатом (3x10 мл), объединенные органические фракции сушат MgS04, фильтруют и упаривают в вакууме. Получают 230 мг продукта. Выход 87 %. Т. пл. 169-173
Ацилирование авермектина ангидридом дегидрохоленовой кислоты
Растворяют ОДООг (1,15хЮ 4 моль) авермектина в сухом СН2С12, вносят 0,180г (2,29хЮ-4 моль) ангидрида А4-3-кето-холеновой кислоты и добавляют каталитическое количество DMAP (10мг). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 22 суток (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь выливают в воду. Полученный мелкокристаллический осадок экстрагируют этилацетатом (3x10 мл), объединенные органические фракции сушат MgS04, фильтруют и упаривают в вакууме. Получают 230мг продукта. Выход 79 %. Т. пл. 154-157 С. Разделение проводилось на жидкостном хроматографе 1100 LC/MSD фирмы AgilentTechnologies (США) с колонкой HiQ (С18) 5мкм, 4,650 мм (PeekeScientific, США), расход элюента 3,750 мл/мин., объем пробы варьировался в зависимости от концентрации веществ от 0,5мкл до 12мкл. Детекторы: УФ-спектрофотометрический детектор (DAD), детектор по светорассеиванию в паровой фазе (SEDEXLT-ELSD85 (Sedere, France)) и одноквадрупольный масс-селективный детектор с ионизацией при атмосферном давлении в режиме электрораспыления (ЭР, API-ES) и химической ионизацией при атмосферном давлении (ХИАД, APCl). В качестве подвижных фаз использовали: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле/воде (5/95), 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Авермектин - время удерживания: Пик 1 – минорная компонента (метильная) – 2,214 мин, пик 2 – мажорная компонента (этильная) – 2, мин. Гемисукцинат авермектина - время удерживания: Пик 1 – минорная компонента (метильная) – 1,793 мин, пик 2 – мажорная компонента (этильная) – 2,376 мин.
При изучении противопаразитарной активности был использован экспресс метод оценки биоцидной активности с применением олигохет Tubificidal tubifex в качестве тест-объектов [90]. Образцы соединений по 10мг (взвешиваются на электронных весах) вносят в плоскодонные колбочки (объем 20-30 мл). Наливают по 10 мл этилового (или изопропилового) спирта и перемешивая растворяют. Далее продолжают разведения до концентраций в интервале от 1 мкг\мл до 100 мкг/мл с шагами 5-10 или 10-20 мкг/мл. Растворы нужной концентрации выливают в чашки Петри с диаметром 5-10 см, куда переносят по 10-15 особей олигохет произвольных размеров, фиксируя время. Наблюдая за активностью червей через 30, 60, 120 или 180 мин находят концентрацию, при которой достигается 50% гибель олигохет. Наиболее эффективные соединения отбираются для дальнейших исследований. Олигохеты культивируются в прозрачных стеклянных емкостях, наполненных пресней водой. Двигательная активность фиксируется визиуально. Результаты наблюдения записываются в таблицах в лабораторных журналах. В качестве контроля используют применяемые в настоящее время в ветеринарии препараты: абамектин, ивермектин, клозантел и другие.
При определении активности исследуемое вещество растворяют в воде при определенной концентрации, затем в полученное средство (препарат) вносят олигохеты по 10 - 20 особей и выдерживают, в течение 1 - 3 ч, после чего подсчитывают общее количество олигохет А в каждом из растворов исследуемого вещества, количество активно подвижных нематод B, количество нематод с нарушенной подвижностью C и количество неподвижных нематод D, вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении по формуле 1 - [B + (C 0,5) + (D 0)] /A 100, находят концентрацию исследуемого образца при которой смертность олигохет составляет 50% (СК50), и определяют противопаразитарную активность путем сравнения СК50 исследуемого образца и эталонного образца известной концентрации. Проводили определение нематоцидной активности c использованием предлагаемого средства при концентрации 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл. Результаты исследования средств, содержащих соединение общей формулы 3а-i, приведены в таблице 2.3 химической части и в приложении.
