Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак эндометрия (РЭ) является наиболее распространенным видом онкогинекологической патологии как в России, так и за рубежом. В России в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями суммарно по всем возрастам РЭ занимает 4-5 место, при этом отмечается увеличение доли заболевших женщин репродуктивного возраста [Чиссов В.И., 2011].
Большинство исследователей признает клиническую, морфологическую и прогностическую гетерогенность контингента больных РЭ даже в пределах одной стадии и подстадии, что определяет целесообразность выделения при раке тела матки дополнительных факторов неблагоприятного прогноза. Непредсказуемость биологического поведения опухоли даже среди больных с одинаковой распространенностью процесса во многом обусловлено вовлечением в канцерогенез различных молекулярных механизмов. В этой связи в последнее время большое значение придается молекулярным маркерам для прогноза клинического течения новообразований и их исхода. В ряде исследований получены доказательства того, что некоторые иммуногистохимические маркеры являются независимыми прогностическими показателями, в том числе при онкогинекологической патологии. Однако согласованного мнения о прогностической роли иммуногистохимических маркеров при РЭ в литературе нет [Чернышова А.Л., 2010], поэтому проблема поиска новых молекулярных критериев прогноза рака эндометрия требует дальнейшего изучения.
В связи с тем, что социальная значимость РЭ в настоящее время велика, актуальной является также проблема выявления в популяции женщин с высоким онкологическим риском по РЭ, что в конечном итоге представляется адекватным направлением в снижении заболеваемости и смертности от этого заболевания. В первую очередь к этой категории относятся пациентки, страдающие гиперпластическими процессами эндометрия (ГЭ). Несмотря на то, что механизм малигнизации ГЭ на сегодняшний день остается неясным, показано, что вероятность развития РЭ велика у пациенток с атипической гиперплазией (до 40%), в то время как для пациенток с типической гиперплазией такой риск значительно ниже, но все же существует (до 10%) [Lacey J.V., 2008].
Объективных и надежных критериев, позволяющих оценить степень онкологического риска у женщин с ГЭ, существует крайне мало. Большинство из них опираются на клинические данные, и описано крайне мало подходов, основанных на молекулярных и биохимических особенностях ткани [Чернышова А.Л., 2003; Бочкарева Н.В., 2010; Burbos N., 2010; Habeeb О., 2010]. Тем не менее, эти подходы имеют ограниченную область применения и широкого применения в практике они не нашли.
Выделение критериев для оценки степени онкологического риска могло бы позволить оптимизировать выбор индивидуальной лечебной тактики и значительно улучшить качество и продолжительность жизни у женщин с ГЭ за счет снижения частоты и объемов хирургического лечения у женщин в постменопаузальном возрасте, уточнения необходимости проведения аблации эндометрия в позднем менопаузальном периоде, а также выявления пациенток с высоким риском развития РЭ и своевременного выполнения им соответствующего лечения.
Теоретической основой разработки критериев для оценки степени онкологического риска и для прогноза течения РЭ может послужить изучение молекулярных механизмов развития гиперпластических процессов и РЭ. В этой связи перспективным является изучение специфических внутриклеточных протеиназ, поскольку известно, что процессы деградации во многом определяют эффективную регуляцию количества и функций многих белков, в том числе ростовых и транскрипционных факторов, участвуют в повышении пролиферативной активности, ингибировании апоптоза, стимуляции неоангиогенеза, функционировании иммунной системы и индукции лекарственной резистентности [Спирина Л.В., 2008; Edwards D., 2009].
Наиболее значимыми системами специфического внутриклеточного протеолиза являются убиквитин-протеасомная и кальпаиновая, и обе они вовлечены в развитие и прогрессирование опухоли. Показана важная роль убиквитин-протеасомной системы в развитии опухолей различных локализаций [Kitagawa K., 2009].
К субстратам протеасомной и кальпаиновой систем можно отнести и локомоторные белки, в частности актинсвязывающие белки и -катенин. Изменение их экспрессионного профиля вносит значительный вклад в приобретение клетками способности к движению, определяя инвазивный и метастатический потенциал трансформированной клетки [Van Troys M., 2008]. Протеолитическая регуляция экспрессии этих белков изучена недостаточно. Единичные литературные данные свидетельствуют о том, что некоторые из этих белков являются субстратами для кальпаинов, другие — для протеасом [Heuz M.L., 2008; Ni X.G., 2008]. Таким образом, экспрессия актинсвязывающих белков и -катенина и, соответственно, процессы клеточной локомоции могут быть тесно связаны с протеасомной и кальпаиновой активностью.
Учитывая важную роль внутриклеточных протеиназ и локомоторных белков в канцерогенезе и их вероятное участие в прогрессии РЭ, изучение состояния протеасомной и кальпаиновой систем и экспрессии актинсвязывающих белков и -катенина представляется актуальным и может послужить основой для разработки маркеров, позволяющих прогнозировать течение РЭ и объективно оценивать риск развития РЭ у пациенток, страдающих ГЭ.
Цель исследования: изучение роли внутриклеточных протеолитических систем в развитии и прогнозе рака эндометрия.
Задачи исследования
-
Изучить активность протеасом, их пулов и субъединичный состав в тканях малигнизированного, неизмененного и гиперплазированного эндометрия.
-
Определить активность кальпаинов в малигнизированном, неизмененном и гиперплазированном эндометрии.
-
Изучить экспрессию актинсвязывающих белков (кофилина-1, гельзолина, тимозина 4, p45-Ser--катенина, Arp3) в ткани рака эндометрия и в гиперплазированном эндометрии.
-
Оценить связь активности протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии.
-
Проанализировать взаимосвязь исследуемых показателей с клинико-морфологическими параметрами рака эндометрия.
-
Оценить значимость исследуемых показателей для прогноза течения рака эндометрия.
-
Создать математическую модель для оценки степени онкологического риска у пациенток с гиперплазией эндометрия на основе определения активности внутриклеточных протеиназ.
Научная новизна
Впервые исследованы активность протеасом и их пулов, а также их субъединичный состав в ткани РЭ и в гиперплазированном эндометрии. Показано усиление протеасом-зависимого протеолиза при РЭ по сравнению с ГЭ с повышением тотальной активности и активности 20S пула. Установлено изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ как по сравнению с неизмененной тканью, так и по сравнению с гиперплазированным эндометрием. В злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц относительно ГЭ. Получены новые данные о связи активности протеасом с глубиной инвазии опухоли в миометрий.
Приоритетными являются полученные данные о значительном повышении активности кальпаинов при РЭ по сравнению с ГЭ, отмечаемой уже при РЭ Iа стадии, с последующим ростом при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий, что указывает на важную роль кальпаинов в развитии РЭ.
Впервые проанализирована взаимосвязь активности протеасом- и кальпаин-зависимого протеолиза с экспрессией локомоторных белков при РЭ и ГЭ. Показано, что и протеасомы, и кальпаины, вероятно, регулируют содержание ряда актинсвязывающих белков и фракций -катенина, влияя тем самым на клеточную подвижность.
Впервые изучена прогностическая роль активности внутриклеточных протеиназ в ткани эндометрия для оценки степени онкологического риска у больных с ГЭ и для прогноза течения РЭ.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты позволяют расширить представления об особенностях функционирования внутриклеточных протеолитических систем при РЭ и обосновать их патогенетическую значимость в развитии этой патологии.
Представленные в работе данные о выраженных различиях в активности кальпаинов при ГЭ и РЭ, а также о взаимосвязи данного показателя с экспрессией локомоторных белков свидетельствуют об участии кальпаинов в процессах, как происходящих в клетке на ранних этапах возникновения злокачественной опухоли эндометрия, так и при развитии заболевания.
Выявленное изменение активности и субъединичного состава протеасом, установленный факт регуляции ими содержания локомоторных белков углубляют представления о возможных механизмах участия убиквитин-протеасомной системы в развитии РЭ.
Результаты исследования могут быть использованы для предсказания риска возникновения РЭ у женщин с ГЭ, для индивидуализации и оптимизации их лечения, а также послужить дополнительными критериями прогноза течения РЭ. Показано, что тотальная активность протеасом является значимым фактором в отношении 3-летней безрецидивной выживаемости больных РЭ, а экспрессия иммунной субъединицы протеасом LMP2 – 3-летней общей выживаемости. Создана математическая модель для оценки степени онкологического риска у пациенток, страдающих ГЭ, включающая активность кальпаинов, активность тотального пула протеасом, возраст пациентки и активность 26S пула протеасом. Чувствительность разработанной модели составила 77%, специфичность – 100%.
Положения, выносимые на защиту
1. Состояние протеасомной и кальпаиновой систем не одинаково в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии. Активность протеасом в злокачественно измененном эндометрии выше, чем в прилегающей неизмененной ткани и в гиперплазированном эндометрии. Изменения активности сопровождаются изменением субъединичного состава протеасом. Активность кальпаинов значительно выше в тканях рака эндометрия, чем в гиперплазированном эндометрии.
2. Корреляционные связи активностей протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков и -катенина в ткани гиперплазированного и малигнизированного эндометрия дают основание предположить наличие протеолитической регуляции кофилина-1 протеасомами, тимозина 4 и -катенина протеасомами и кальпаинами.
3. Определение активности протеасом и кальпаинов в ткани гиперплазированного эндометрия дает возможность прогнозирования риска развития рака эндометрия.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на VI-VIII Региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011-2013), на XI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Москва, 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Начальный рак эндометрия» (Москва, 2011), на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).
Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой прораммы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (государственный контракт П320), Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-04-00169).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения, в том числе 8 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 7 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора
Анализ литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели и задач, выбор методов исследования, проведение экспериментального блока настоящей работы, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и иллюстрирована 16 рисунками. Бибилография включает 214 литературных источников, из которых 24 отечественных и 190 иностранных.
