Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Рак легкого: статистика, классификация, эпидемиология, патогенез 10
1.2. Генетический полиморфизм и предрасположенность к злокачественным заболеваниям 18
1.3. Генетический полиморфизм и метаболизм ксенобиотиков 20
1.4. Гены, кодирующие ферменты фазы I метаболизма ксенобиотиков, и их связь с риском рака легкого 23
1.4.1. Полиморфизм CYP1A1 гена и предрасположенность к раку легкого 23
1.4.2. Полиморфизм CYP2E1 гена и предрасположенность к раку легкого 29
1.5. Гены, кодирующие ферменты фазы II метаболизма ксенобиотиков, и их связь с риском рака легкого 37
1.5.1. Ген глютатион S-трансферазы Ml и предрасположенность к раку легкого 38
1.6. Комбинация генотипов CYP1A1 и GSTM1 и связь с риском рака легкого 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Пациенты и доноры 45
2.2. Выделение ДНК 45
2.3. Генотипирование 46
2.3.1. Идентификация аллелей гена CYP1А1 46
2.3.2. Идентификация аллелей гена GSTM1 47
2.3.3. Идентификация аллелей гена CYP2E1 47
2.4. Статистический анализ
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследовании
3.1. Полиморфизм гена CYP1A1 и предрасположенность к раку легкого 50
3.1.1. Распределение генотипов CYP1A1 гена у здоровых и больных РЛ 50
3.1.2. Распределение генотипов CYP1A1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого 53
3.1.3. Генотипы гена CYP1A1 и модификация риска РЛ в связи с курением 54
3.1.4. Распределение аллелей генотипов гена CYP1A1 у мужчин и женщин 56
3.2. Полиморфизм гена GSTM1 и предрасположенность к раку легкого 57
3.2.1. Распределение генотипов гена GSTM1 у здоровых и больных РЛ 57
3.2.2. Распределение генотипов гена GSTM1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого 59
3.2.3. Полиморфизм гена GSTM1 и модификация риска рака легкого в связи с курением 61
3.2.4. Распределение генотипов гена GSTM1 у мужчин и женщин 62
3.3. Комбинация генотипов CYP1A1 и GSTM1 и риск развития рака легкого 63
3.3.1. Распределение комбинаций генотипов CYP1A1 и GSTM1 среди курильщиков и некурящих здоровых доноров и больных РЛ 63
3.3.2. Комбинация генотипов генов CYP1A1 и GSTM1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого 70
3.3.3. Комбинация генотипов генов CYP1A1 и GSTM1 у мужчин и женщин 73
3.4. Полиморфизм гена CYP2E1 и предрасположенность к раку легкого 74
3.4.1. Распределение генотипов гена CYP2E1 у здоровых и больных РЛ 74
3.4.2. Распределение генотипов гена Rsal/CYP2E1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого 77
3.4.3 Rsal полиморфизм гена CYPIIE1 и модификация риска РЛ в связи с курением 78
3.4.4. Распределение генотипов гена Rsal/CYPIIEl у мужчин и женщин 79
3.4.5. Распределение генотипов гена Dral/CYPIIEl генотипов у здоровых и больных РЛ 79
3.4.6. Распределение генотипов гена Dral/ CYPIIE1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого 82
3.4.7. Полиморфизм гена Dral/CYPIIEl и модификация риска развития рака легкого в связи с курением 83
3.4.8. Полиморфизм гена Dral /CYPIIE1 у мужчин и женщин 84
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
4.1. Полиморфизм гена CYP1A1 и предрасположенность к раку легкого 86
4.2. Полиморфизм гена GSTM1 и предрасположенность к риску развития РЛ 91
4.3. Комбинация генотипов генов CYP1A1 и GSTM1 и предрасположенность к раку легкого 96
4.4. Полиморфизм гена CYPIIE1 и предрасположенность к раку легкого 102
4.5. Пожилые доноры как контроль в молекулярно-эпидемиологических исследованиях 104
Выводы 109
Список литературы 110
- Генетический полиморфизм и метаболизм ксенобиотиков
- Распределение генотипов CYP1A1 гена у здоровых и больных РЛ
- Комбинация генотипов генов CYP1A1 и GSTM1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого
- Полиморфизм гена CYP1A1 и предрасположенность к раку легкого
Введение к работе
Рак легкого (РЛ) - одно из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований. РЛ является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний у мужчин и занимает второе место (после рака молочной железы) у женщин (Hung R.J. et al., 2003). В разных географических регионах у мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев РЛ на 100000 человек в год, заболеваемость женщин - в 6-10 раз ниже. В России ежегодно от РЛ погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. В Санкт-Петербурге РЛ сохраняет первое место в структуре смертности от новообразований (Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000; Барчук А.С., Мерабишвили В.М., Кисельникова И.В., 2001). 80-90% случаев рака легкого вызвано курением (Худолей В.В., 1999; Заридзе Д.Г., 2000). В то же время известно, что РЛ возникает не у всех курильщиков, и этот факт позволяет предполагать существование генетических факторов риска. В настоящее время наибольший интерес в молекулярно-генетических исследованиях РЛ вызывают онкоассоциированные генные полиморфизмы. Установлено, что присутствие в генотипе «неблагоприятных» аллелей генов HRAS-1 и L-MYC может повышать риск возникновения РЛ (Weston A. et al., 1992,1994; Tamai S. et al., 1990; Fong K.M. et al., 1996; Zborovskaya I. et al., 1996). Предполагается, что индивидуальная предрасположенность к развитию РЛ также связана с полиморфизмом генов, продукты которых принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма (Bartsch Н. et al., 2000; Benhamou S. et al., 2002; Garcia-Closas M. et al., 1997). Следует учитывать, что сведения о влиянии «неблагоприятных» полиморфных аллелей и их сочетаний на риск РЛ противоречивы. Невысокая воспроизводимость результатов работ, выполненных в разных лабораториях, по крайней мере, отчасти объясняется низкой пенетрантностью нормальных генных полиморфизмов (Shields P.G.,
Harris C.C., 2000; Imyanitov E.N. et al., 2003).
В связи с тем, что вероятность развития онкологических заболеваний в течение жизни для женщин составляет 38%, а для мужчин — 48%, в традиционных контрольных выборках, представленных лицами среднего возраста, присутствует значительное количество потенциальных онкологических пациентов (Ries L.A. et al., 1996). В целях увеличения демонстративности молекулярно-эпидемиологического анализа в настоящей работе использовалась дополнительная группа сравнения, состоящая из пожилых онкологически-здоровых лиц. Как показали предыдущие эксперименты, подобный нетрадиционный подход может существенно увеличить эффективность изучения генных полиморфизмов (Белогубова Е.В. и соавт., 2000; Того А.В. и соавт., 1999).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить причастность некоторых полиморфных генов, продукты которых принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма, к риску возникновения РЛ. В связи с этим поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать распределение аллелей ключевых генов метаболизма ксенобиотиков полиморфных генов CYP1A1, GSTM1, CYP2E1 у здоровых жителей Санкт-Петербурга.
2. Сравнить распределение аллелей данных генов в группах здоровых доноров и больных РЛ. Выявить полиморфные варианты, ассоциированные с риском возникновения рака легкого.
3. Установить, наблюдается ли связь между наличием определенных аллелей генов и гистологическим типом опухолей.
4. Изучить влияние комбинаций неблагоприятных аллелей перечисленных генов на риск возникновения рака легкого.
5. Оценить перспективность использования пожилых индивидуумов без онкологических заболеваний в анамнезе в качестве дополнительной контрольной группы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях.
Положения, выносимые на защиту:
1. Носительство аллеля т2 гена CYP1A1 ассоциировано с повышением риска плоскоклеточного РЛ.
2. «Дефицитный» генотип GSTM1 проявляет тенденцию к преобладанию у больных РЛ по сравнению с пожилыми лицами контрольной группы.
3. Комбинация т2-содержащего генотипа CYP1A1 и «дефицитного» варианта GSTM1 увеличивает риск РЛ в большей степени, чем каждый из перечисленных полиморфизмов по отдельности.
Научная новизна полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования были получены следующие приоритетные данные:
1. Обнаружено, что замена Т С в аллеле гена CYP1A1 ассоциирована с повышенным риском возникновения плоскоклеточного рака легкого.
2. Показано, что генотип GSTMl(-) ассоциирован с незначительным увеличением риска рака легкого.
3. Выявлено, что неблагоприятная значимость аллеля с заменой т6235С гена CYP1A1 усиливается при условии сочетания с дефицитным генотипом GSTM1.
4. Показано отсутствие взаимосвязи между полиморфизмом гена CYP2E1 и предрасположенностью к РЛ.
5 Продемонстрировано, что включение в исследование пожилых доноров в качестве дополнительной контрольной группы увеличивает демонстративность исследований онкоассоциированных полиморфизмов.
Практическая значимость. Диссертация имеет научно-практический характер.
В частности, данные об ассоциации полиморфизма генов GSTM1 и CYP1A1 и их сочетаний с предрасположенностью к РЛ, могут быть использованы для оценки индивидуального риска развития данного заболевания. Это позволит выделить группу людей, которым особенно противопоказано как курение, так и работа, связанная с канцерогенными воздействиями. Усиленное медицинское наблюдение за подобными индивидуумами увеличит возможность ранней диагностики, что, в свою очередь, должно положительно влиять на результаты лечения.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на объединенной научной конференции отдела биологии опухолевого роста НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова и лаборатории молекулярной генетики ГБ№31 (январь, 2004), а также на заседании кафедры оториноларингологии с клиникой Санкт-Петербургского Государственного Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова (февраль, 2004).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 122 публикации на русском и английском языках.
Генетический полиморфизм и метаболизм ксенобиотиков
Метаболические превращения проканцерогенов табачного дыма начинаются с их окисления при участии ряда ферментов. Эти энзимы кодируются генами суперсемейства цитохромов Р450. В настоящее время их описано более 10 семейств. Однако исследования показали, что в метаболизме ПАУ и НА участвуют только несколько видов цитохромов: CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1, CYP2D6. В связи с этим полиморфизм генов, кодирующих эти ферменты, стал предметом изучения молекулярных онкологов.
Во многих исследованиях, изучавших связь курения с риском возникновения рака легкого, отмечалось, что канцерогены табачного дыма повышают активность ферментов, участвующих в их метаболизме. В частности, было показано, что активность арилгидрокарбонгидроксилазы (АГТ, CYP4501A1) резко возрастает под влиянием полициклических углеводородов. Этот фермент кодируется геном CYP1A1, локализованным на длинном плече хромосомы 15 (15q22q-24). Он состоит из 7 экзонов и 6 интронов общей протяженностью 5810 п.о. (Jaiswal А.К., 1985; Kawajiri К, 1986).
С помощью фенотипирования была обнаружена корреляция между увеличенной активностью фермента CYP1A1 и повышенным риском возникновения карцином бронхов у курильщиков (Pasquini R. et al., 1988; Peterson D. et al., 1990). Однако уровень активность АГТ, выявляемый этим способом, не позволяет определить количество и состояние (гомо- и гетерзиготное) аллелей, ответственных за повышенную активность фермента. ДНК- типирование лишено этого недостатка и позволяет выявить носителей общих и редких аллелей. Рестрикционный анализ при помощи эндонуклеазы рестрикции Mspl выявляет полиморфный сайт на 3 -конце гена CYP1А1 на расстоянии 1194 п.о. от 7 экзона к З -области. Дикий аллель характеризуется отсутствием Mspl-сайта. Именно с мутантным аллелем гена CYP1А1 связана повышенная активность АГТ.
Изучение Mspl-полиморфизма гена CYP1A1 и его связь с риском возникновения рака легкого привлекли внимание большого ряда исследователей (Hirvonen A. et al., 1992, 1993; Tefre Т. et al., 1991; Kesley К. et al., 1994; Bartsch H. et al., 2000).
Hirvonen A. et al. (1993) на курящих 118 здоровых донорах, 77 больных-РЛ и 30 пациентах с неонкологическими заболеваниями легкого изучали полиморфизм гена CYP1A1. Исследователи не обнаружили различий в распределении аллелей у больных раком легкого и здоровых доноров. Гомозиготные носители дикого типа составляли у здоровых 77%, у больных РЛ - 81%. Гетерозиготные аллели найдены у здоровых в 19%, а у больных с опухолями легких - в 19,5% случаев. Гомозиготный генотип с мутациями присутствовал в 1,6% у здоровых, у больных такие аллели отсутствовали. Не было найдено различий в частоте аллелей при сравнении пациентов с разными гистологическими типами РЛ. У больных с другими легочными заболеваниями гетерозиготное состояние гена наблюдалось в 13% случаев.
Не выявили связи полиморфизма гена CYP1A1 с РЛ и на норвежской популяции (Tefre Т. et al., 1991).
Kelsey К. et al. (1994) также пытались найти связь между редким аллелем гена CYP1A1 и риском развития РЛ. Авторы сформировали сходные по полу, возрасту, роду занятий, вероисповеданию группы, включавшие 97 здоровых доноров и 72 пациента с РЛ. Ассоциация между риском возникновения рака легкого и каким-либо аллелем исследуемого гена не выявлена. Так, у больных РЛ гетерозиготного носительство редкого аллеля встречалось в 16% случаев, тогда как в контрольной группе такой генотип выявлялся в 23% случаев. Среди онкологических больных гомозиготный генотип с мутантными аллелями имели только двое, у здоровых - один.
Авторы объясняют отсутствие связи между генетическим полиморфизмом и предрасположенностью индивидуумов к злокачественным заболеваниям легкого не только небольшой выборкой исследуемых групп, но и тем, что у белых и афро-американцев мутации в Mspl-сайте гена CYP1A1 встречаются реже, чем в японской популяции. Авторами была также предпринята попытка установить связь между заболеванием РЛ и продолжительностью курения. В то время как курящие в группе с РЛ встречались в 52,8%, в одной контрольной группе - работники больниц и церквей - в 17,7% и во второй -добровольцы из онкологических программ в - 24 % , то сравнивать такие группы нам представляется неправомерным.
В исследованиях Drakolis N. et al. (1994) на немецкой популяции изучался полиморфизм 2-х областей гена CYP1A1 (Mspl-сайт и А4889Г в 7 экзоне) у 142 больных РЛ и у 171 пациента с неонкологическими заболеваниями легкого. Частота аллелей дикого типа при исследовании Mspl-полиморфизма у больных РЛ составляла 91,5%, у контрольных индивидуумов - 92,7%. Частота гомозиготного генотипа с мутацией у опухолевых больных и в контрольной группе была схожей (7,5% против 7,3%). Также не было выявлено различий во встречаемости мутантного аллеля при изучении опухолей легкого различного гистологического типа.
Вторая мутация, которую исследовали данные авторы, - точковая мутация А4889Г в 7 экзоне, приводящая к замене изолейцина на валин в кодируемом белке. Активность фермента не меняется, однако из-за нарушения связывания белка с гемом снижается его способность к индукции. Данное изменение приводит к большому накоплению ПАУ- ДНК аддуктов в лейкоцитах у курильщиков. Этот полиморфизм исследовался методом аллель-специфической ПЦР. Впервые Hayashi S. (1991) показал, что у пациентов с РЛ мутантный аллель, кодирующий в белке валин, встречается чаще, чем у здоровых. Изучение частоты генотипов и аллелей гена CYP1A1 в исследованиях Drakolis N. et al. выявило двукратное увеличение представленности мутантных аллелей у онкологических пациентов по сравнению со здоровыми. Риск возникновения РЛ у носителей мутантного аллеля увеличивался в два раза (OR-2,16 (CL 0,96-5,11; Р=0,033).
Авторы проанализировали анамнез курения у пациентов с РЛ. Было обнаружено, что мутантные аллели встречались, главным образом, у некурящих в 20% случаях (OR=7,52; Р=0,006). Эта работа продемонстрировала связь риска возникновения рака легкого с мутацией А4889Г гена CYP1A1 и показала, что гомозиготные носители такой мутации имеют увеличенный риск возникновения РЛ даже при таких слабых канцерогенных воздействиях как пассивное курение. Однако существуют работы, отрицающие значение упомянутых мутаций в данном гене для риска возникновения РЛ. Так, не обнаружили связи между полиморфизмом MspI/CYPlAl и риском возникновения РЛ Shields P. et al., (1993), изучавшие афро-американцев и белых. Исследование проводилось на 56 больных с РЛ и сходных по возрасту, полу, социальному положению 46 индивидуумах, составляющих 2 контрольные группы. В первую входили 31 человек с хроническими обструктивными заболеваниями легкого и курильщики, потребляющие более 40 пачек/год, во вторую - 15 человек онкологических больных без РЛ. Было обнаружено, что у афро-американцев мутантный аллель данного гена встречался чаще, чем у белых. Однако небольшая выборка внутри каждой группы не позволила обнаружить статистически значимых различий между больными с РЛ и контрольной группой.
Распределение генотипов CYP1A1 гена у здоровых и больных РЛ
Сравнение распределения генотипов у больных с плоскоклеточным РЛ (ПлРЛ) и ДСВ показало тенденцию к увеличению встречаемости CYP1A1 mlm2 генотипа у больных с данным гистологическим вариантом опухоли (Р=0,065). При сравнении частоты аллеля т2 в данных группах различия были статистически достоверными (Р=0,030). При сопоставлении пациентов с ПлРЛ с группой ПД наблюдаемые отличия становились еще более очевидными (Р=0,042 и Р=0,017 для генотипа mlm2 и частоты т2 аллеля, соответственно).
Напротив, сравнение генотипов и аллелей генаСУРІАІ у больных с диагностированной аденокарциномой легкого (АК) с группами ДСВ и ПД показало, что у онкологических пациентов чаще встречался дикий аллель. Так, гомозиготный дикий генотип ml ml встречался у больных с АК на 12%, 6% и 5% чаще, чем в группах больных РЛ, ДСВ и ПД, соответственно. Генотип mlm2 в тех же группах встречался реже на 10%, 5% и 5%, соответственно. Генотип m2m2 у больных с АК легкого не выявлен, а у пациентов с РЛ, ПД, ДСВ он обнаруживался в 2%, 1% и 1% случаев, соответственно. Однако различия между группами не достигали уровня статистической достоверности (Р=0,615), что скорее всего, было связано со сравнительно небольшим числом пациентов с АК - 27 человек. Пациенты с МкРЛ имели распределение генотипов и встречаемость аллелей близкое к таковым в контрольных группах.
Сопоставление встречаемости генотипов и аллелей CYP1A1 в группах курильщиков среди ПД, ДСВ и пациентов с РЛ обнаружило незначительные различия между этими группами (табл. 5 и рис. 4). В контрольных группах ПД и ДСВ встречаемость генотипов mlml, mlm2, m2m2 и частоты аллелей ml, m2 у курильщиков не различались (80%, 20%, 0% и 80%, 19%, 1%, а также 90%, 10% и 90%, 10%, соответственно). У некурящих здоровых доноров 2-х контрольных групп (ПД и ДСВ) частоты генотипов и аллелей
CYP1A1 также были сходны (80%, 20%, 1% и 89%, 11%; 77%, 21%, 1% и 88%, 12%, соответственно). В группе курильщиков-пациентов с РЛ распределение генотипов и аллелей показало, что встречаемость генотипов mlml, mlm2, m2m2 и частоты аллелей ml, m2 составляли 73%, 26%, 2% и 85%, 15%, соответственно. У некурящих пациентов с РЛ эти значения были равны 78%, 22%, 0% и 89%), 11%, соответственно. Видно, что у некурящих уровень mlml несколько повышен, гетерозиготный генотип mlm2 встречается реже и гомозигота m2m2 не выявлена. Однако статистически значимых различий в частоте встречаемости генотипов и аллелей гена CYP1A1 между группами курильщиков и некурящих - пациентов с РЛ, курильщиков-пациентов и курильщиков ДСВ и ПД, а также как курящих и некурящих доноров разных возрастных групп, так и некурящих (больных и здоровых) не наблюдалось (Р=0,235 РЛ кур против ДСВ кур и ПД кур; Р=0,888 РЛ некур против ДСВ некур и ПД некур; Р=0,770 РЛ кур против РЛ некур; Р=0,724 ДСВ кур против ДСВ некур; Р=0,957 ПД кур против ПД некур) ( табл. 5 и рис. 4).
Сравнение генотипов и аллелей гена CYP1A1 у мужчин и женщин среди групп ПД, ДСВ и пациентов с РЛ выявило, что у мужчин редкие аллели в группах ДСВ и у онкологических больных встречались чаще по сравнению с женщинами (14% против 9% и 14% против 11 %, соответственно) (табл. 5 и рис. 5). В то же время у мужчин из группы ПД мутантные аллели присутствовали несколько реже, чем у женщин (10% против 11 %, соответственно). Как видно из представленных данных, вариантный аллель у мужчин из групп ДСВ и пациентов с РЛ встречается чаще, чем у женщин. У ПД - мужчин доля этого аллеля была несколько снижена по сравнению с женщинами той же группы. Обращает на себя внимание тенденция к статистически значимым различиям между мужчинами и женщинами ДСВ (Р=0,099). Сравнение распределения генотипов и аллелей среди мужчин и женщин в группах пожилых доноров и онкологических пациентов не выявило подобных различий (Р=0,766 ПД муж против ПД жен; Р=0,776 РЛ муж против РЛ жен).
Таким образом, изучение Mspl-полиморфизма гена CYP1А1 у больных раком легкого и здоровых индивидуумов (ДСВ и ПД) показало, что редкий аллель гена CYP1A1 выявляются у больных РЛ несколько чаще, чем в контрольных группах. Однако учитывая низкую представленность аллеля т2 в популяции СПб и небольшие различия в его встречаемости, имеющие место между пациентами с РЛ и контрольными группами, не представляется возможным считать аллель т2 гена Mspl/C YP1А1 маркером предрасположенности к РЛ.
Комбинация генотипов генов CYP1A1 и GSTM1 у пациентов с различными гистологическими типами рака легкого
Были проанализированы комбинации генотипов CYP1A1 и GSTM1 у больных с различными гистологическими типами рака легкого: плоскоклеточным, мелкоклеточным и аденокарциномой. Данные такого исследования приведены в табл. 7 и 8.
Встречаемость комбинации генотипов CYP1A1 mlml и GSTM1(+) в группе больных плоскоклеточным РЛ была незначительно снижена по сравнению с ПД и ДСВ (29% против 42% и 39%) (Р =0,115 ПлРЛ против ПД, ДСВ). В то же время у пациентов с МкРЛ и АК уровень таких генотипов несколько превышал значения контрольных групп (44% и 45% против 42% и 39%), но не достигал статистически значимого уровня (Р=0,753 МкРЛ против ПД, ДСВ; Р=0,722 АК против ПД, ДСВ). При сочетании CYP1A1 mlml и нулевого варианта GSTM1 в группах ПД, ДСВ и пациентов с РЛ встречаемость таких генотипов была выявлена у 37%, 40% и 40% обследованных, соответственно (Р=0,832 РЛ против ПД, ДСВ). У больных с ПлРЛ и МкРЛ и пациентов с АК легкого доля данных генотипов составляла 34%, 39%, 41% (Р=0,702 ПлРЛ против ПД, ДСВ; Р=0,860 МкРЛ против ПД, ДСВ; Р=0,840 АК против ПД, ДСВ). Сравнение частоты комбинации генотипов CYP1A1 mlm2 и GSTM1(+) также не выявило различий между данными группами: 13%, 8%, 12%, 14%, 6% и 14% - представленность упомянутых генотипов у носителей в группах ПД, ДСВ, РЛ, ПлРЛ, МкРЛ и АК (Р=0,315 РЛ против ПД, ДСВ; Р=0,231 ПлРЛ против ПД, ДСВ, Р=0,255 МкРЛ против ПД, ДСВ; Р=0,308 АК против ПД, ДСВ). При сравнении частоты комбинации генотипов CYP1A1 mlm2 и GSTM1(-) между когортами здоровых доноров и онкологическими пациентами наблюдалось увеличение мутантных генотипов с 7% и 12%, выявляемых у ПД и ДСВ, до 13% и 20% у больных РЛ и ПлРЛ (Р=0,091 между группами РЛ, ПД, ДСВ; Р=0,006 между группами ПлРЛ, ПД, ДСВ). Встречаемость мутантных генотипов у больных с МкРЛ (11%) была сходна с уровнем, наблюдаемым у ДСВ (Р=0,185 между группами МкРЛ, ПД, ДСВ). У больных с АК легкого CYP1A1 гомозиготный генотип по редкому аллелю отсутствовал (Р=0,057 между группами АК, ПД, ДСВ). Сравнение комбинации двух мутантных генотипов между больными РЛ и ПлРЛ и группами ПД и ДСВ (с каждой из групп в отдельности) показало еще большую достоверность различий особенно с ПлРЛ во встречаемости мутаций в исследованных генах у ПД (Р=0,068 РЛ против ПД; Р=0,03 ПлРЛ против ПД) по сравнению с ДСВ (Р=0,859 РЛ против ДСВ; Р=0,126 ПлРЛ против ДСВ).
Из данных, представленных в таблице 9, видно, что генотипы с мутациями чаще встречались у больных РЛ, особенно ПлРЛ. Приведенные результаты свидетельствуют также о том, что, отличия, наблюдаемые между онкологическими пациентами и ПД, выражены заметнее, чем при использовании в качестве контрольной группы ДСВ. Видно также, что у носителей неблагоприятных генотипов в 2-х генах повышение риска РЛ заметнее, чем в при носительстве только одного неблагоприятного генотипа. Таким образом, сочетание генотипа GSTMl(-) с носительством аллеля т2 гена CYP1A1 ассоциировано с предрасположенностью к РЛ, особенно к ПлРЛ.
Комбинация генотипов CYPlAl ml ml и GSTM1(+) у мужчин и женщин среди ПД была сходной (43% и 42%), (Р=0,968) у мужчин ДСВ и пациентов с РЛ такие генотипы встречались несколько чаще, чем у женщин (45%, 35% и 35% и 24%, соответственно) (Р=0,134; Р=0,458). У ПДтІтІ гомозиготы в сочетании с нулевым вариантом GSTM1 встречались у мужчин и женщин с одинаковой частотой (37%). У мужчин группы ДСВ и пациентов с РЛ данные варианты выявлялись реже, чем у женщин (31%, 38 % и 47%, 53%, соответственно). У носителей аллеля т2 в комбинации с GSTM1(+) генотипом наблюдалось сходное распределение генотипов у мужчин и женщин 3-х исследованных групп (ПД - 12% и 14%, ДСВ - 7% и 10%, РЛ -12% и 12%) (табл. 7). Сочетание GSTMl(-) с носительством редкого аллеля т2 у ДСВ - мужчин выявлялось значительно чаще, чем у женщин (16% и 9%), однако различия не достигали статистической значимости (Р=0,163). В то же время между мужчинами и женщинами в группах ПД и больных РЛ не наблюдалось различий в частоте данной комбинации: ПД - 8% и 7%, РЛ -13% и 12% (Р=0,959 ПД муж против ПД жен; Р=0,845 РЛ муж против РЛ жен) (табл. 7 и рис. 15).
Полиморфизм гена CYP1A1 и предрасположенность к раку легкого
Изучение полиморфизма гена CYP1A1 показало, что в контрольных группах (ДСВ и ПД) встречаемость гомозиготного дикого генотипа (mlml) была равна 79% и 79%, гетерозиготного (mlm2) - 20% и 20%, гомозиготного с мутантными аллелями (m2m2) - 1% и 1% (Белогубова Е.В. и соавт., 2003, 2004). Аналогичное распределение генотипов наблюдалось у здоровых европейцев в опубликованных ранее исследованиях (Tefre Т. et al., 1991; Hirvonen A. et al., 1992; Alexandrie A. et al., 1994) и белых американцев (Garcia-Clossas M. et al., 1997) (табл. 5).
Сравнение генотипов и аллелей CYP1A1 у больных РЛ обнаружило, что гетерозиготный генотип mlm2 встречался на 5% , а редкие аллели - на 3%, чаще, чем в группах ДСВ и ПД, однако имеющиеся различия не были статистически достоверными. Учитывая морфологическую гетерогенность опухолей легкого, был проведен анализ распределения MspI/CYPlAl генотипов и аллелей в зависимости от гистологического строения опухоли. Было обнаружено, что у пациентов с МкРЛ распределение генотипов и встречаемость аллелей CYP1A1 были близки к таковым у здоровых. У пациентов с АК мутантный аллель выявлялся реже, чем у здоровых доноров (7 % и 11%, соответственно). Однако полученные различия не были достоверными, что, возможно, было связано с небольшим размером группы больных с АК- 27 человек (Р=0,647).
Исследование показало, что аллель т2 гена CYP1A1 ассоциирован с предрасположенностью к ПлРЛ. Так, у пациентов с ПлРЛ он встречался в 19% случаев, что было на 8% чаще, чем в группах ДСВ и ПД, и установленные различия были статистически достоверными (Р=0,030 ПлРЛ против ДСВ; Р=0,017 ПлРЛ против ПД, соответственно). Неодинаковая частота носителей аллеля т2 у пациентов с различными гистологическими типами опухолей, возможно, связана с разным влиянием мутантных генотипов на чувствительность различных тканей легкого к канцерогенному действию табачного дыма. Известно, что аденокарцинома развивается из клеток альвеолярного эпителия и бронхиальных желез, мелкоклеточный РЛ -из клеток АПУД системы, а ПлРЛ происходит из клеток мерцательного эпителия бронхов.
Связь между носительством гп2 аллеля и предрасположенностью к возникновению плоскоклеточного рака легкого, продемонстрированная в нашем исследовании, нашла свое подтверждение и в других работах (Alexandrie A. et al., 1994; Kijohara С. et al., 1998). Так, в исследованиях ряда авторов (Kawajiri К. et al., 1990, 1993; Nan Song et al., 2001; Lin P. et al., 2000), выполненных на представителях монголоидной расы, было показано, что присутствие хотя бы одного мутантного аллеля (т2) в генотипе ассоциировано с высоким риском возникновения рака легкого, особенно плоскоклеточного. Le Marchand L. et al. (1998), работая на смешанной популяции, состоящей из европейцев, японцев и гавайцев, обнаружили, что гп2т2 генотип присутствовал у больных РЛ в 10,3% случаев и в 20,3% у лиц с ПлРЛ, причем разница между последними и контрольной группой достигала порога статистической значимости (Р 0,05). Увеличение доли носителей т2 аллеля среди пациентов с ПлРЛ по сравнению с контролем также было выявлено в европейской популяции и у белых американцев (Bartsch Н. et al., 2000). Хотя данные отличия были не столь выраженными как у представителей желтой расы. В то же время существуют исследования, в которых не была показана связь полиморфизма гена CYP1A1 с предрасположенностью к РЛ, в том числе с ПлРЛ (Kelsey К. et al., 1994; Sugimura Н. et al., 1994; Dracolis N. et al., 1994; Kihara M. et al., 1995). Из ряда работ упомянутых авторов неясно, связано ли отсутствие различий между сравниваемыми группами с биологическим фактором или же играет роль особенности постановки экспериментов, набор контрольных групп и т. д. Так, по данным Kihara М. генотип m2m2 гена CYP1A1 среди курящих доноров контрольной группы встречался у 17,8% обследованных и у 16,5% больных раком лёгкого (плоскоклеточным и мелкоклеточным). В то же время у некурящих лиц контрольной группы данный генотип определялся в 11% случаев. Учитывая средний возраст лиц в контрольной группе (50-69 лет), можно предположить, что среди курящих присутствовали индивидуумы с высоким риском развития онкологической патологии. Sugimura Н. et al. (1994) изучали Mspl-полиморфизм гена CYP1A1 и его связь с РЛ у белых и чёрных жителей Рио-де-Жанейро и не нашли связи между данным полиморфизмом и риском возникновения РЛ, несмотря на то, что распределение генотипов и аллелей гена CYP1A1 было сходно с японской популяцией, где наблюдается высокая представленность гп2 аллеля. Не выявили увеличения риска РЛ и при исследовании китайской популяции, выполненном Persson I. et al. (1999). Вывод об отсутствии ассоциации между Mspl-полиморфизмом гена CYP1A1 и предрасположенностью к раку лёгкого был сделан Shields P. et al. (1993). Работа была выполнена на 56 больных РЛ и индивидуумах контрольной группы, состоящей из 31 пациента с хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ) или бронхиальной астмой, потреблявших сигареты больше 40 пачек/год, и 15 больных с опухолями разных локализаций, исключая рак лёгкого и рак мочевого пузыря. Можно предположить, что разнообразный состав контрольной группы (представители белой и чёрной рас, мужчины и женщины, онкологические больные, больные ХОБЛ), малочисленность сравниваемых групп, а также сильное воздействие канцерогенов табачного дыма вследствие потребления большого количества сигарет не позволило различать генетические факторы, влияющие на предрасположенность к РЛ, могли отразиться на негативном результате исследования.
