Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Молекулярные механизмы апоптоза 9
1.1.1. Каспазы 10
1.1.2. Внешний (рецепторный) путь запуска апоптоза 13
1.1.3. Внутренний (митохондриальный) путь запуска апоптоза 17
1.1.4. Гибель через «разрезание» 24
1.2. Рак легкого 27
1.2.1. Эпидемиология рака легкого 27
1.2.2. Классификация рака легкого 30
1.2.3. Этиология рака легкого 31
Рак легкого у курильщиков 31
Рак легкого у некурящих 35
1.2.4. Наследственная предрасположенность к раку легкого 37
1.3 Рак молочной железы 42
1.3.1. Эпидемиология рака молочной железы 42
1.3.2. Классификация рака молочной железы 45
1.3.3. Этиология рака молочной железы 46
1.3.4. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы 48
1.4. Апоптоз и канцерогенез 52
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Общий план работы 60
2.2. Критерии выбора полиморфных генетических вариантов 61
2.3. Группы пациентов и контролей 61
2.4. Выделение ДНК 66
2.5. Оценка встречаемости онкоассоциированных генетических вариантов в группах повышенного онкологического риска и онкологической толерантности 67
2.6. Генотипирование 67
2.7 Статистический анализ 70
Глава 3. Результаты собственных исследований 77
3.1. Выбор кандидатных генов и полиморфизмов 77
3.2. Полиморфизмы, не обнаруженные в изучаемых группах или исключенные из исследования по техническим причинам 80
3.3 Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациенток с повышенной предрасположенностью к РМЖ и в группе онкологически здоровых пожилых женщин 82
3.4 Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациентов с повышенной предрасположенностью к РЛ и в группе онкологически здоровых пожилых мужчин-курильщиков 85
3.5 Молекулярно-эпидемиологическое исследование с традиционным подходом к формированию групп «случай» (пациенты с раком легкого) и «контроль» 89
3.6 Оценка влияния возрастных особенностей контрольной группы на результаты первого этапа исследования 92
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 94
4.1. Сниженная активность процессов апоптоза как фактор риска развития опухолей легкого и молочной железы 94
4.2 Преимущества и недостатки выбранной модели исследования 96
4.3. Распределение частот генотипов выбранных полиморфизмов в изучаемых группах 98
Выводы 103
Список литературы 104
- Внешний (рецепторный) путь запуска апоптоза
- Наследственная предрасположенность к раку легкого
- Генотипирование
- Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациенток с повышенной предрасположенностью к РМЖ и в группе онкологически здоровых пожилых женщин
Введение к работе
Актуальность проблемы
Индивидуальная предрасположенность к возникновению опухолей может быть обусловлена нормальными вариациями генома - генетическими полиморфизмами. Например, было показано, что риск возникновения карцином легкого, мочевого пузыря и толстой кишки увеличивается в случае носительства неблагоприятного сочетания полиморфизмов генов, вовлеченных в метаболизм табачных смол (Schwartz A.G. et al, 2007; Garcia-Closas M. et al, 2005; Hung R.J. et al, 2003). Получено немало данных об аллельных вариантах генов стероидного метаболизма, принимающих участие в формировании риска опухолей репродуктивной системы (Verla-Tebit Е. et al, 2005; Berstein L.M. et al, 2004; Gulyaeva L.F. et al, 2008). Возможная ассоциация между полиморфизмами генов репарации и онкологическим риском также активно изучалась в течение последних лет (Dufloth R.M. et al, 2008; Fontana L. at al, 2008; Huang M.Y. et al, 2008).
Также заслуживают пристального внимания гены, продукты которых принимают участие в апоптотическом ответе клетки на повреждение ДНК. В норме, когда изменения в химической структуре ДНК не могут быть устранены системой репарации, запускается программа клеточного суицида - апоптоза. Однако интенсивность этих процессов может колебаться в достаточно широком диапазоне, что во многом определяется генетической конституцией индивидуума. Таким образом, пониженная эффективность работы апоптотических каскадов может привести к накоплению в организме клеток, содержащих мутации в онкогенах или генах-супрессорах, что, безусловно, сопряжено с увеличением индивидуального онкологического риска. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты некоторых фенотипических исследований, продемонстрировавших связь между сниженной способностью к апоптозу и повышенным онкологическим риском (Wang L.E. et al, 2003; Camplejohn R.S. etal, 2001; Zhao H. etal, 2001; Barber J.В. etal, 2000). Появились отдельные работы, касающиеся встречаемости полиморфизмов генов апоптоза в группах больных раком легкого и раком молочной железы (Frank В. et al, 2005; Zhang X. etal, 2005; MacPherson G. etal, 2004; Wang L.E. etal, 2003; Balkwill F, 2002). Однако систематического исследования, посвященного этой проблеме, до сих пор не проводилось.
Объективные сложности, возникающие при поиске низкопенентратных факторов риска развития заболеваний, в том числе и онкологических, связаны в первую очередь со слабостью искомых ассоциаций. Современные требования к улучшению эффективности молекулярно-эпидемиологических исследований направлены в основном на увеличение размеров используемых выборок и максимальное соответствие между группами пациентов и контролем по всем общим для них параметрам. Однако подобный подход также имеет свои ограничения, которые напрямую связаны с размерами существующих на сегодняшний день коллекций ДНК, а также с доступностью технологий, позволяющих проводить масштабное генотипирование (Imyanitov E.N., 2008). Таким образом, возникает необходимость в разработке альтернативных путей поиска генетических полиморфизмов, повышающих риск развития онкологических заболеваний.
В настоящей работе был использован оригинальный подход к формированию групп пациентов и контроля. Вместо использования случайных выборок, мы оценивали встречаемость изучаемых полиморфизмов в группах, характеризующихся повышенной предрасположенностью и толерантностью к развитию онкологических заболеваний. Отбор пациенток в группу РМЖ производился с учетом наличия следующих признаков: раннее начало заболевания, наличие больных родственников и первично-множественная форма РМЖ. Условий для отбора пациентов с раком легкого в исследуемую выборку было два: раннее начало заболевания и тот факт, что появление опухоли произошло на фоне низкого потребления табачных изделий или у некурящих. В качестве контрольных групп были использованы пожилые онкологически здоровые индивидуумы (женщины и мужчины-курильщики 75 лет и старше), которые, на наш взгляд, обладают повышенной резистентностью к возникновению злокачественных новообразований. Для полиморфизмов, отобранных на этом этапе работе, было проведено традиционное молекулярно-эпидемиологическое исследование.
На основе описанного выше подхода был проведен двухстадийный систематический анализ кодирующих несинонимичных аллельных вариантов генов-участников процесса программируемой клеточной гибели, и изучено их влияние на риск развития рака молочной железы и рака легкого.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлась оценка роли аллельных вариантов генов апоптоза в формировании риска рака молочной железы и рака легкого.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
С помощью баз данных интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) отобрать все кодирующие несинонимичные полиморфизмы основных генов-участников апоптоза, популяционная частота которых была ранее верифицирована и составляет не менее 1%.
Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного онкологического риска (пациентки, имеющие признаки наследственного РМЖ) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые женщины).
Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного риска рака легкого (малокурящие или некурящие пациенты с РЛ) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые мужчины-курильщики).
Выявить генетические варианты с достоверно различающейся частотой в группе экстремального онкологического риска и в группе толерантности и провести их сравнительный анализ в молекулярно-эпидемиологическом исследовании с традиционным подходом к формированию групп «случай» и «контроль».
Научная новизна полученных результатов
В настоящей работе впервые было проведено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование полиморфизмов генов апоптоза, направленное на выявление низкопенетрантных генетических факторов, влияющих на предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в частности, к раку молочной железы и раку легкого.
Практическая значимость
Проведенное исследование генного полиморфизма вносит вклад в разработку ДНК-тестов, направленных на выявление групп повышенного онкологического риска. Полученные значения встречаемости изученных полиморфизмов могут быть в дальнейшем использованы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, посвященных изучению роли апоптоза как в патогенезе рака, так и других заболеваний.
Основные положения, выносимые на защиту
Альтернативой традиционному молекулярно-эпидемиологическому исследованию может служить использованный в работе оригинальный подход к формированию групп пациентов и контроля, характеризующихся повышенной предрасположенностью и толерантностью (соответственно) к развитию онкологических заболеваний.
Более трети от всех полиморфных вариантов, выбранных с помощью базы Entrez SNP интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) на основании верифицированной частоты, не были обнаружены в изученной популяции.
3) Не выявлена ассоциация между исследованными полиморфизмами генов апоптоза и риском развития рака легкого или рака молочной железы, что ставит под сомнение предположение о вовлеченности генетически обусловленного полиморфизма апоптотических механизмов в онкологическую предрасположенность.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (21-23 сентября 2006, Иркутск, Россия), на конференции INTAS «Genomics & Proteomics Workshop 2007» (6-8 September 2007, Киев, Украина), на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (12 октября 2007 г., Санкт-Петербург, Россия) и на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения — 2008» (18 апреля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель включает 252 публикации, в том числе 6 отечественных и 246 зарубежных.
Внешний (рецепторный) путь запуска апоптоза
Инициирующим звеном этого пути является взаимодействие рецепторов TNF (tumor necrosis factor) семейства с их внеклеточными лигандами: TNF-a, TL1A, FasL/CD95L и TRAIL (TNF receptor apoptosis-inducing ligand or Apo2L). Лиганды экспрессируются в иммунокомпетентных клетках и презентируются на мембранной поверхности. Их мишенями становятся поврежденные клетки (инфицированные вирусами, раковые и др.), несущие на себе специфические рецепторы, с которых запускается каскад реакций, приводящий клетку к гибели, их называют «рецепторами гибели» (death receptors) (см. табл.2). Внеклеточный домен каждого из этих рецепторов отвечает за взаимодействие с лигандом, что приводит к тримеризации и кластеризации внутриклеточных доменов, которые обеспечивают трансдукцию апоптотического сигнала через взаимодействие их Death Domain с аналогичными структурными мотивами адаптерных белков (см. табл.2).
TRADD - известный адаптерный белок, соединяющийся с рецепторами TNFR1, DR3 и DR6. Находясь в комплексе с рецептором, TRADD способен присоединять к себе другие DD-содержащие белки, в частности, FADD - белок, в структуре которого присутствуют сразу два модуля, обеспечивающих межмолекулярное взаимодействие - DD и DED. Это дает ему возможность привлекать предшественников инициаторных каспаз procaspase-8/10 через взаимодействие DED доменов, что завершает образование крупного белкового комплекса - death inducing signal complex (DISC). FADD способен напрямую соединяться с внутримолекулярными доменами рецепторов Fas, DR4 и DR5, в этом случае комплекс формируется без участия TRADD. Альтернативный вариант молекулярного состава DISC наблюдается при активации procaspase-2. Многочисленные эксперименты in vivo и in vitro показали, что ассоциация адаптерного белка RAIDD с procaspase-2 происходит через взаимодействие CARDs, a DD модуль RAIDD связывается с белком RIP1, находящимся в комплексе с TNFR1 (Ahmad М. et al, 1997; Hsu К et al, 1996).
В результате формирования DISC создаются все необходимые условия для реализации аутокаталитической активности зимогенов, и происходит активация каспаз первого эшелона (см. таблицу 2). Активные формы протеиназ покидают комплекс и отправляются на поиски своих мишеней в цитоплазму. Их основными стратегическими субстратами являются эффекторные каспазы (Casp3, Casp6, Casp7), работа которых завершает программу суицида.
Существуют также и другие субстраты инициирующих каспаз, активация которых приводит к нарастанию и амплификации апоптозного сигнала. Например, одним из специфичных проксимальных субстратов Caspase-8 является BID, проапоптотический ВНЗ-содержащий член семейства Вс1-2 белков. Это один из примеров пересечения и взаимной инициации двух основных путей реализации программируемой клеточной гибели. Caspase-8 расщепляет полноразмерный BID, находящийся в цитозоле, с образованием укороченной активной формы - tBID, которая транслоцируется в митохондрии и высвобождает cytochrome С (Li Н. et al, 1998). Дальнейшие события совпадают с таковыми при запуске митохондриального сценария развития апоптоза, который будет описан ниже.
Регуляция внешнего пути запуска апоптоза осуществляется множеством различных механизмов на всех его этапах. Здесь мы остановимся лишь на некоторых из них.
Кроме двух уже упомянутых TRAIL-рецепторов - DR4 и DR5, на поверхности клетки существуют еще три рецептора, способных связываться с этим лигандом. Их называют "decoy receptors" - DcRl и DcR2 - что обозначает «приманка» или «ловушка». Третий рецептор - OPG - имеет низкое сродство к лиганду, и потому менее интересен. Внеклеточные участки этих рецепторов полностью повторяют строение и функции соответствующих фрагментов death receptors. Зато внутриклеточный участок DcRl укорочен, a Death Domain - нефункционален, тогда как DcR2 и вовсе не имеет внутриклеточного фрагмента (LeBlanc H.N., 2003). Высокая специфичность этих рецепторов позволяет им успешно конкурировать с death receptors за связь с лигандом, и тримеры, в состав которых входит хотя бы один "decoy" рецептор, уже не способны запустить апоптозный каскад. Еще один рецептор, названный DcR3, является «приманкой» для другого лиганда - FasL (Ashkenazi A. et al, 1999). Механизм его действия оказался идентичен первым двум.
Спонтанная агрегация рецепторов, в отсутствие специфических лигандов, предотвращается их взаимодействием с внутриклеточным белком SODD/BAG4 (silencer of death domain protein). Своим ЫН2-концевым доменом он присоединяется к внутриклеточным фрагментам рецепторов, при этом его С-концевой BAG домен ассоциирован с белками Hsc70/Hsp70 семейства молекулярных шаперонов, которые индуцируют конформационные изменения в DD модулях рецепторов, предотвращая их спонтанную тримеризацию.
За последние годы было обнаружено большое количество белков, содержащих апоптотический DED модуль. Эксперименты показали их вовлеченность в регуляцию апоптозного каскада, но механизмы действия многих из них еще не до конца понятны. Так, было показано, что белки Flash и DEDD усиливают активацию caspase-8 при Fas-индуцированном апоптозе (Stegh А.Н. et al, 1998). Противоположным действием обладает другой DED-белок - Flip (также известный как Flame, CASH, Clarp, Casper, Usurpin, MRIT и I-Flice). В его структуре присутствует также псевдо-каспазный домен, что позволяет ему конкурировать с procaspase-8 и -10 за ассоциацию с их партнерами. Димеризация Flip с зимогенами или присоединение к DD-модулям рецепторов приводит к ингибированию апоптотического сигнала (Tschop J. et al, 1998).
Известно, что стимуляция TNFR1 может привести к активации транскрипционного фактора NF-kappaB, которая запускает интенсивную экспрессию антиапоптотических белков Вс1-2 семейства (Bfl-1, Bcl-X) и ингибиторов апоптоза (сІАР-1, СІАР2, XIAP). Таким образом, принятый сигнал воспринимается клеткой, как сигнал выживания. Интересная модель реализации двойного действия TNFR1-сигнального пути была предложена O.Micheau и J.Tschopp. По их мнению, переключение происходит при последовательном формировании двух различных DISCs. Сначала происходит формирование первого комплекса (комплекс I) с участием TNFR1, TRADD, RIP1 и TRAF2, в этом составе они способны запустить киназную инактивацию IkB, что приводит к высвобождению NF-kappaB и запуску программы выживания. Образование комплекса I приводит к интернализации рецептора и образованию «TNF рецептосомы» В неблагоприятных для выживания условиях такой комплекс оказывается нестабилен, TRADD и RIP1 легко диссоциируют из него и связываются с FADD и procaspase-8, что приводит к формированию цитоплазматического комплекса (комплекс II), и запускается программа клеточного суицида. Если же образование комплекса II ингибировано с помощью Flip, клетка выживает (Micheau О. et al, 2003).
Наследственная предрасположенность к раку легкого
То, что курение может быть не единственной причиной, приводящей к развитию карцином легкого, ни у кого не вызывает сомнения. Как уже упоминалось, до 25% пациентов с этим диагнозом никогда не курили. Но до недавнего времени идея о том, что рак легкого у некурящих может быть в принципе другим заболеванием, не находила фактического подтверждения. История с открытием избирательного механизма действия препаратов Iressa (Gefitinib) и Tarceva (Erlotinib) - ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) - дает основание взглянуть на проблему под другим углом. В 2004 году три независимые группы исследователей установили, что ответ на применение препаратов коррелирует с наличием в опухоли интрагенной мутации EGFR. Оказалось, что эти достаточно редкие мутации (до 10% у европейцев и порядка 25% у населения азиатской части материка) встречаются преимущественно в аденокарциномах легкого. И, что самое важное (в контексте этой главы), достоверно чаще такие мутации находят у некурящих пациентов по сравнению с курящими (Lynch T.J. et al, 2004; Paez J.G. et al, 2004; Pao W. et al, 2004; Kim K.S. et al, 2005; Sugio K. et al, 2006). При этом связь между упомянутым гистотипом и статусом курения была установлена уже давно: аденокарцинома - самый распространенный тип рака легкого у некурящих (Subramanian J., Govindan R., 2007). Все остальные особенности этого заболевания представлены в таблице 3. Риск развития рака легкого у курящих людей был оценен как в 10-20 раз больший по сравнению с некурящими. Ни один из других изучаемых факторов не увеличивал риск более чем в три раза, для большинства же из них эта величина не достигала даже 1,5. Постараемся кратко охарактеризовать те из них, для которых были получены воспроизводимые и наиболее значимые результаты (Subramanian J., Govindan R., 2007; Sun S. et al, 2007): - пассивное курение: сотни работ были посвящены оценке влияния этого фактора на развитие рака легкого во всем мире; в разные годы крупномасштабные исследования в Европе и Америке показывали слабые увеличения рисков, но, зачастую, различия не достигали достоверной значимости; - влияние радона, асбеста, тяжелых металлов и других канцерогенов окруоюающей среды: прямое воздействие перечисленных агентов слабо, но воспроизводимо увеличивает риск развития рака легкого, как у курильщиков, так и у некурящих; - дым и пары, вдыхаемые при приготовлении пищи: большинство исследований проведено на азиатских популяциях, поскольку среди них очень велик процент некурящих женщин с раком легкого; данные необычайно противоречивы, но, по всей видимости, некоторый вклад в увеличение риска все-таки наблюдается; - гормональные факторы: основанием к их изучению стало наличие рецепторов к эстрогенам в опухолях легкого и эксперименты in vivo и in vitro, подтвердившие, что эстрогены способны стимулировать рост и пролиферацию раковых клеток в тканях легкого; однозначного ответа на вопрос о возможной гормональной природе канцерогенеза в легких на сегодняшний день так и не получено, результаты многочисленных работ говорят как в пользу этого предположения, так и опровергают его; - вирусы: сама возможность присутствия ДНК вируса папилломы человека (HPV) в опухолях легкого на сегодняшний день не вызывает сомнений; некоторые исследования показывают, что онкогенные типы HPV 16 и 18 достоверно чаще встречаются в карциномах некурящих пациентов по сравнению с курящими; - генетические факторы: поскольку изучение именно этих аспектов является целью нашей работы, мы остановимся на этом вопросе подробнее в разделе 1.2.4. (Наследственная предрасположенность к раку легкого). Таким образом, хотя слабые ассоциации и были показаны, обнаружение основной причины (или причин), приводящей к развитию рака легкого в отсутствии курения, всё еще остается интересной задачей, требующей скорейшего решения. 1.2.4. Наследственная предрасположенность к раку легкого На Земле более 1,2 млрд. человек остаются потребителями табачных изделий, и только 10 - 20% из них заболевают раком легкого. С другой стороны, ежегодно какое-то количество некурящих людей пополняет ряды заболевших. Поиски объяснения подобной гетерогенности человеческой популяции традиционно приводят нас к заключению, что существенный вклад в её формирование вносит наследственность. Разная степень генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию может быть обусловлена наличием редких высокопенетрантных факторов (мутаций) и/или более часто встречающихся низкопенетрантных факторов (полиморфизмов). Наличие семейных форм заболевания свидетельствует о существовании генетических вариантов, проявляющихся с высокой пенетрантностыо. Первая работа, в которой сообщалось о семейной агрегации рака легкого, появилась более 40 лет назад (Tokuhata G.K., Lilienfeld A.M., 1963), за ней последовали сотни других, но, как это ни странно, вопрос о существовании семейных форм этого заболевания до сегодняшнего дня остается открытым. Систематический анализ, проведенный в 2005 году Matakidou и коллегами (Matakidou A. et al, 2005), включал 52 работы, опубликованные за последние 40 лет и посвященные оценке риска развития рака легкого при отягощенном семейном анамнезе. Полученные данные подтвердили увеличение риска примерно в 2 раза у лиц, имеющих случаи этого заболевания в семье, причем показатели возрастали при учете раннего возраста начала заболевания или увеличении числа больных родственников. Увеличение риска развития заболевания в 1,5 раза наблюдалось при изучении семей некурящих больных, в анализ вошли результаты 11 таких исследований. Еще 7 работ, где применялся близнецовый метод и которые также вошли в описанный анализ, не показали существенного влияния наследственности на предрасположенность к раку легкого у мужчин, хотя оно явно наблюдалось у женщин (Matakidou A. et al, 2005). Многие исследователи считают, что подобное увеличение риска можно объяснить одинаковым влиянием факторов окружающей среды на членов одной семьи (привычка курения, схожая работа, особенности места проживания). Однако этому противоречат работы, где статистические методы учитывали влияние курения, а заметное увеличение риска в 2 — 3 раза при этом все равно сохранялось (Schwartz A.G., Ruckdeschel J.C., 2005).
Другое масштабное исследование по анализу генома членов 52 семей, в каждой из которых было как минимум три человека с раком легкого, гортани или горла, показало, что область предполагаемого сцепления находится на участке 6q23-25 (Bailey-Wilson J.E. et al, 2004). Эта область содержит более 100 генов, и некоторые из них, действительно, могут быть заподозрены в причастности к формированию предрасположенности к РЛ. Обнаружение такого гена (или генов) может значительно продвинуть вперед исследования в этой области. И, наконец, следует упомянуть недавнюю работу, где была описана соматическая мутация Т790М в гене EGFR, ассоциированная с развитием резистентности к тирозинкиназным ингибиторам (Iressa, Tarceva). По мнению авторов, эта мутация может играть определенную роль в наследственной предрасположенности к раку легкого, в данном случае она явилась причиной семейной кластеризации аденокарциномы (Bell D. W. et al, 2005). Правда, другие подобные случаи пока не были описаны.
Генотипирование
То, что курение может быть не единственной причиной, приводящей к развитию карцином легкого, ни у кого не вызывает сомнения. Как уже упоминалось, до 25% пациентов с этим диагнозом никогда не курили. Но до недавнего времени идея о том, что рак легкого у некурящих может быть в принципе другим заболеванием, не находила фактического подтверждения. История с открытием избирательного механизма действия препаратов Iressa (Gefitinib) и Tarceva (Erlotinib) - ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) - дает основание взглянуть на проблему под другим углом. В 2004 году три независимые группы исследователей установили, что ответ на применение препаратов коррелирует с наличием в опухоли интрагенной мутации EGFR. Оказалось, что эти достаточно редкие мутации (до 10% у европейцев и порядка 25% у населения азиатской части материка) встречаются преимущественно в аденокарциномах легкого. И, что самое важное (в контексте этой главы), достоверно чаще такие мутации находят у некурящих пациентов по сравнению с курящими (Lynch T.J. et al, 2004; Paez J.G. et al, 2004; Pao W. et al, 2004; Kim K.S. et al, 2005; Sugio K. et al, 2006). При этом связь между упомянутым гистотипом и статусом курения была установлена уже давно: аденокарцинома - самый распространенный тип рака легкого у некурящих (Subramanian J., Govindan R., 2007). Все остальные особенности этого заболевания представлены в таблице 3.
Риск развития рака легкого у курящих людей был оценен как в 10-20 раз больший по сравнению с некурящими. Ни один из других изучаемых факторов не увеличивал риск более чем в три раза, для большинства же из них эта величина не достигала даже 1,5. Постараемся кратко охарактеризовать те из них, для которых были получены воспроизводимые и наиболее значимые результаты (Subramanian J., Govindan R., 2007; Sun S. et al, 2007): - пассивное курение: сотни работ были посвящены оценке влияния этого фактора на развитие рака легкого во всем мире; в разные годы крупномасштабные исследования в Европе и Америке показывали слабые увеличения рисков, но, зачастую, различия не достигали достоверной значимости; - влияние радона, асбеста, тяжелых металлов и других канцерогенов окруоюающей среды: прямое воздействие перечисленных агентов слабо, но воспроизводимо увеличивает риск развития рака легкого, как у курильщиков, так и у некурящих; - дым и пары, вдыхаемые при приготовлении пищи: большинство исследований проведено на азиатских популяциях, поскольку среди них очень велик процент некурящих женщин с раком легкого; данные необычайно противоречивы, но, по всей видимости, некоторый вклад в увеличение риска все-таки наблюдается; - гормональные факторы: основанием к их изучению стало наличие рецепторов к эстрогенам в опухолях легкого и эксперименты in vivo и in vitro, подтвердившие, что эстрогены способны стимулировать рост и пролиферацию раковых клеток в тканях легкого; однозначного ответа на вопрос о возможной гормональной природе канцерогенеза в легких на сегодняшний день так и не получено, результаты многочисленных работ говорят как в пользу этого предположения, так и опровергают его; - вирусы: сама возможность присутствия ДНК вируса папилломы человека (HPV) в опухолях легкого на сегодняшний день не вызывает сомнений; некоторые исследования показывают, что онкогенные типы HPV 16 и 18 достоверно чаще встречаются в карциномах некурящих пациентов по сравнению с курящими; - генетические факторы: поскольку изучение именно этих аспектов является целью нашей работы, мы остановимся на этом вопросе подробнее в разделе 1.2.4. (Наследственная предрасположенность к раку легкого). Таким образом, хотя слабые ассоциации и были показаны, обнаружение основной причины (или причин), приводящей к развитию рака легкого в отсутствии курения, всё еще остается интересной задачей, требующей скорейшего решения. 1.2.4. Наследственная предрасположенность к раку легкого На Земле более 1,2 млрд. человек остаются потребителями табачных изделий, и только 10 - 20% из них заболевают раком легкого. С другой стороны, ежегодно какое-то количество некурящих людей пополняет ряды заболевших. Поиски объяснения подобной гетерогенности человеческой популяции традиционно приводят нас к заключению, что существенный вклад в её формирование вносит наследственность. Разная степень генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию может быть обусловлена наличием редких высокопенетрантных факторов (мутаций) и/или более часто встречающихся низкопенетрантных факторов (полиморфизмов). Наличие семейных форм заболевания свидетельствует о существовании генетических вариантов, проявляющихся с высокой пенетрантностыо. Первая работа, в которой сообщалось о семейной агрегации рака легкого, появилась более 40 лет назад (Tokuhata G.K., Lilienfeld A.M., 1963), за ней последовали сотни других, но, как это ни странно, вопрос о существовании семейных форм этого заболевания до сегодняшнего дня остается открытым. Систематический анализ, проведенный в 2005 году Matakidou и коллегами (Matakidou A. et al, 2005), включал 52 работы, опубликованные за последние 40 лет и посвященные оценке риска развития рака легкого при отягощенном семейном анамнезе. Полученные данные подтвердили увеличение риска примерно в 2 раза у лиц, имеющих случаи этого заболевания в семье, причем показатели возрастали при учете раннего возраста начала заболевания или увеличении числа больных родственников. Увеличение риска развития заболевания в 1,5 раза наблюдалось при изучении семей некурящих больных, в анализ вошли результаты 11 таких исследований. Еще 7 работ, где применялся близнецовый метод и которые также вошли в описанный анализ, не показали существенного влияния наследственности на предрасположенность к раку легкого у мужчин, хотя оно явно наблюдалось у женщин (Matakidou A. et al, 2005). Многие исследователи считают, что подобное увеличение риска можно объяснить одинаковым влиянием факторов окружающей среды на членов одной семьи (привычка курения, схожая работа, особенности места проживания). Однако этому противоречат работы, где статистические методы учитывали влияние курения, а заметное увеличение риска в 2 — 3 раза при этом все равно сохранялось (Schwartz A.G., Ruckdeschel J.C., 2005).
Другое масштабное исследование по анализу генома членов 52 семей, в каждой из которых было как минимум три человека с раком легкого, гортани или горла, показало, что область предполагаемого сцепления находится на участке 6q23-25 (Bailey-Wilson J.E. et al, 2004). Эта область содержит более 100 генов, и некоторые из них, действительно, могут быть заподозрены в причастности к формированию предрасположенности к РЛ. Обнаружение такого гена (или генов) может значительно продвинуть вперед исследования в этой области. И, наконец, следует упомянуть недавнюю работу, где была описана соматическая мутация Т790М в гене EGFR, ассоциированная с развитием резистентности к тирозинкиназным ингибиторам (Iressa, Tarceva). По мнению авторов, эта мутация может играть определенную роль в наследственной предрасположенности к раку легкого, в данном случае она явилась причиной семейной кластеризации аденокарциномы (Bell D. W. et al, 2005). Правда, другие подобные случаи пока не были описаны.
Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациенток с повышенной предрасположенностью к РМЖ и в группе онкологически здоровых пожилых женщин
На Земле более 1,2 млрд. человек остаются потребителями табачных изделий, и только 10 - 20% из них заболевают раком легкого. С другой стороны, ежегодно какое-то количество некурящих людей пополняет ряды заболевших. Поиски объяснения подобной гетерогенности человеческой популяции традиционно приводят нас к заключению, что существенный вклад в её формирование вносит наследственность. Разная степень генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию может быть обусловлена наличием редких высокопенетрантных факторов (мутаций) и/или более часто встречающихся низкопенетрантных факторов (полиморфизмов). Наличие семейных форм заболевания свидетельствует о существовании генетических вариантов, проявляющихся с высокой пенетрантностыо.
Первая работа, в которой сообщалось о семейной агрегации рака легкого, появилась более 40 лет назад (Tokuhata G.K., Lilienfeld A.M., 1963), за ней последовали сотни других, но, как это ни странно, вопрос о существовании семейных форм этого заболевания до сегодняшнего дня остается открытым. Систематический анализ, проведенный в 2005 году Matakidou и коллегами (Matakidou A. et al, 2005), включал 52 работы, опубликованные за последние 40 лет и посвященные оценке риска развития рака легкого при отягощенном семейном анамнезе. Полученные данные подтвердили увеличение риска примерно в 2 раза у лиц, имеющих случаи этого заболевания в семье, причем показатели возрастали при учете раннего возраста начала заболевания или увеличении числа больных родственников. Увеличение риска развития заболевания в 1,5 раза наблюдалось при изучении семей некурящих больных, в анализ вошли результаты 11 таких исследований. Еще 7 работ, где применялся близнецовый метод и которые также вошли в описанный анализ, не показали существенного влияния наследственности на предрасположенность к раку легкого у мужчин, хотя оно явно наблюдалось у женщин (Matakidou A. et al, 2005). Многие исследователи считают, что подобное увеличение риска можно объяснить одинаковым влиянием факторов окружающей среды на членов одной семьи (привычка курения, схожая работа, особенности места проживания). Однако этому противоречат работы, где статистические методы учитывали влияние курения, а заметное увеличение риска в 2 — 3 раза при этом все равно сохранялось (Schwartz A.G., Ruckdeschel J.C., 2005).
Другое масштабное исследование по анализу генома членов 52 семей, в каждой из которых было как минимум три человека с раком легкого, гортани или горла, показало, что область предполагаемого сцепления находится на участке 6q23-25 (Bailey-Wilson J.E. et al, 2004). Эта область содержит более 100 генов, и некоторые из них, действительно, могут быть заподозрены в причастности к формированию предрасположенности к РЛ. Обнаружение такого гена (или генов) может значительно продвинуть вперед исследования в этой области. И, наконец, следует упомянуть недавнюю работу, где была описана соматическая мутация Т790М в гене EGFR, ассоциированная с развитием резистентности к тирозинкиназным ингибиторам (Iressa, Tarceva). По мнению авторов, эта мутация может играть определенную роль в наследственной предрасположенности к раку легкого, в данном случае она явилась причиной семейной кластеризации аденокарциномы (Bell D. W. et al, 2005). Правда, другие подобные случаи пока не были описаны.
Таким образом, следует признать, что высокопенетрантные генетические признаки, ответственные за развитие рака легкого (за исключением единичного случая), пока не обнаружены. Тем не менее, активный поиск факторов наследственной предрасположенности принес свои плоды, и некоторые генные полиморфизмы (низкопенетрантные генетические признаки), а также их сочетания, оказались связаны с индивидуальным риском РЛ.
Индивидуальные различия в активности систем детоксикации канцерогенов обусловлены полиморфизмом генов ферментов, участвующих в этом процессе. Так, для носителей одного из аллельных вариантов цитохрома Р450 1А1 (CYP1A1) показана воспроизводимая ассоциация с увеличенным риском РЛ, хотя были работы, где такой ассоциации найдено не было. Другой фермент - glutathione Sransferase ц (GSTM1) -почти у 50% европейцев инактивирован гомозиготной делецией - нулевой генотип. Носительство такого варианта генотипа, по некоторым данным, включая данные, полученные в нашей лаборатории, также увеличивает риск развития заболевания. Комбинированный эффект сочетания неблагоприятных вариантов обоих генов оказался наиболее опасным, увеличив риск более чем в два раза (что, кстати, вполне сопоставимо с увеличением риска при отягощенном анамнезе) (Schwartz A.G. et al, 2007; Hung R.J. et al, 2003; Belogubova E.V. et al, 2006). Многочисленные исследования других кандидатных генов, продукты которых выполняют схожие функции, в большинстве своем показали негативные результаты. В тех же случаях, когда слабые ассоциации были получены, как, например, для arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2), эти данные зачастую не подтверждались в последующих работах (Belogubova Е. V. et al, 2005).
Безусловно, не все люди, имеющие сниженную активность систем детоксикации ксенобиотиков, заболевают раком легкого. В тех случаях, когда повреждение ДНК все-таки происходит, в клетке запускаются многоступенчатые системы репарации, исправляющие образовавшиеся «ошибки». Если же в репарационных процессах происходит сбой, то есть повреждения не устраняются или корректировка идет очень медленно, то происходит постепенное накопление мутаций, что в дальнейшем может стать причиной малигнизации.
Полиморфизмы генов репарации долгое время приковывали внимание исследователей, особенно после обнаружения наследственных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке молочной железы (см. раздел 1.3.4.). В отношении увеличения риска развития рака легкого были изучены полиморфизмы генов, продукты которых участвуют в эксцизионной репарации оснований (XRCC1, hOOGl) и нуклеотидов (ERCC1/2, XPD, ХРА), а также в репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (MLH1/2) и двуцепочечных разрывов ДНК (XRCC3). В десятках работ изучались также и их многочисленные комбинации. Большинство исследований продемонстрировали негативные или невоспроизводимые результаты. В рамках этой проблемы были также изучены и полиморфизмы некоторых генов, участвующих в воспалительных процессах и регуляции клеточного цикла. Результаты этих исследований также не выявили значимых ассоциаций (Schwartz A.G. et al, 2007; Imyanitov E.N. et al, 2005).
Похожие диссертации на Роль полиморфизмов генов апоптоза в формировании предрасположенности к раку молочной железы и раку легкого
