Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Эпидемиология ракамолочной железы 10
1.2. Факторы риска РМЖ 11
1.2.1. Возраст 11
1.2.2. Экзогенные факторы риска 11
1.2.3. Воздействие эстрогенов 13
1.2.4. Генетические факторы 14
1.3. Внутриклеточные факторы геномной стабильности 17
1.3.1. Система репарации ДНК 17
1.3.2. Репарация двунитевых разрывов ДНК в клетке 19
1.3.3. Механизмы DSB-рєпарации 23
1.3.4. Нарушения DSB-репарации при РМЖ 25
1.3.5. Полиморфные варианты в генах комплекса RAD50/MRE11A/NBS1. 26
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Группы пациентов и контролей 31
2.2. Источники ДНК для молекулярно-генетического анализа 31
2.3. Выделение ДНК 32
2.3.1. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови 32
2.3.2. Выделение ДНК из патоморфологических парафиновых образцов... 33
2.4. Выбор потенциально значимых генетических вариантов 33
2.5. Стратегия поиска онко-ассоциированных генетических вариантов с привлечением групп экстремального онкологического риска и онкологической толерантности 34
2.6. Генотипирование 36
2.6.1. Аллель-специфическая ПЦР 36
2.6.2. Полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов 37
2.6.3. Анализ потерь гетерозиготности 38
2.6.4. Анализ и документация результатов ПЦР-амплификации 38
2.6.5. Статистический анализ данных 39
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
3.1. Изучение частот полиморфизмов генов MRE11, NBS1 и RAD50 в ограниченных (пилотных) группах высокого онкологического риска и толерантности 43
3.2. Изучение встречаемости мутации NBS1 657del5 в популяции 45
3.3. Анализ потерь гетерозиготности NBS1 в опухолях у носителей мутации NBS1 657del5 45
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 47
Выводы 61
Список литературы 62
- Эпидемиология ракамолочной железы
- Внутриклеточные факторы геномной стабильности
- Источники ДНК для молекулярно-генетического анализа
- Изучение частот полиморфизмов генов MRE11, NBS1 и RAD50 в ограниченных (пилотных) группах высокого онкологического риска и толерантности
Введение к работе
Рак молочной железы (РМЖ) занимает ведущее место в структуре онкологической заболеваемости у женщин, составляя 1/5 от всех новых случаев злокачественных новообразований. Число пациенток с диагнозом РМЖ, как абсолютное, так и относительное, сохраняет устойчивую тенденцию к возрастанию в России и странах Запада [Imyanitov E.N., Hanson К.Р., 2004]. Несмотря на некоторые позитивные сдвиги в вопросах ранней диагностики РМЖ, благодаря более широкому применению скрининговых обследований, в частности, рутинной маммографии, весьма пессимистическим остается прогноз для жизни при установленном диагнозе РМЖ. По данным НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, 76% больных РМЖ, прослеженных свыше 20 лет, умерли от «основного» заболевания [Моисеенко В.М. и соавт., 1997].
Однако высокая социальная значимость РМЖ является не единственной причиной актуальности его изучения. Вопросы этиологии и патогенеза РМЖ во многом остаются неясными. Злокачественные опухоли молочной железы обладают высокой степенью клинической, морфологической и биологической гетерогенности. При генеалогическом анализе, в семьях пациентов нередко прослеживается тенденция наследования предрасположенности к РМЖ, иногда заболевание встречается в виде так называемых «семейных форм» [Lynch Н.Т. et al., 1978]. Меры, направленные на повышение эффективности профилактики РМЖ и выявлении заболевания на ранних стадиях требуют дальнейшего усовершенствования.
Демографические изменения в человеческой популяции, характеризующиеся увеличением пропорции пожилых людей в большинстве развитых и развивающихся стран мира, еще более обостряют проблему. Риск развития РМЖ, как и многих других злокачественных новообразований, напрямую зависит от возраста индивида. Так, среди женщин старше 65 лет этот риск в 6,5 раз больше, чем на всем протяжении жизни до 65 лет, и в 150 раз выше, чем у женщин до 30 лет [Imyanitov E.N., Hanson К.Р., 2004]. Помимо возрастания риска развития РМЖ, связанного с общим увеличением продолжительности жизни, в последние десятилетия были более четко обозначены и другие факторы предрасположенности к развитию данного новообразования.
Несмотря на многообразие выявленных факторов риска РМЖ, все они в настоящее время могут быть выделены в две основных категории: избыточная экспозиция к эстрогенам и нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома [Singletary S.E., 2003].
Пролиферативный эффект эстрогенов на клетки молочной железы известен несколько десятилетий. Кроме того, как было показано относительно недавно, в основе действия эстрогенов играет роль не только механизм промоции на клетки опухоли: некоторые метаболиты эстрогенов способны оказывать прямое повреждающее действие на ДНК, то есть выступать в роли инициаторов развития злокачественной трансформации [ZhuB.T., Conney А.Н., 1998].
Биологические механизмы, направленные на поддержание стабильности генома клетки и их связь с развитием злокачественных опухолей молочной железы в последнее время изучаются наиболее активно. Подобный интерес обусловлен следующими основными причинами: во-первых, все изученные к настоящему времени гены предрасположенности к РМЖ (BRCA1, BRCA2, ATM, СНЕК2) участвуют в механизмах распознавания или репарации повреждений ДЬЖ; во-вторых, в многочисленных исследованиях достоверно показана связь между риском РМЖ и конституциональной хромосомной нестабильностью [Iau Р.Т. et al., 2001; Natarajan А.Т., 2002; Colleu-Durel S. et al., 2004; Imyanitov E.N. et al., 2004].
В этой связи представляется обоснованным изучение генетических вариантов среди генов, отвечающих за процессы распознавания и репарации двунитевых разрывов в молекулах ДНК. Процесс повреждения молекулы ДНК, в результате которого образуются двунитевые разрывы, по современным представлениям, лежит в основе возникновения хромосомных аберраций. Восстановление двунитевых разрывов ДНК в клетке происходит благодаря системе белков репарации, осуществляющих гомологичную и негомологичную рекомбинацию [Hoeijmakers J.H.J., 2001; Elliott В., Jasin М., 2002]. Генетически детерминированная гетерогенность данных белков, предположительно, может влиять на эффективность их работы, что приводит к более быстрому накоплению случайных мутаций по типу делеций или перестроек участков хромосом. Вероятно, некоторое увеличение груза аберраций привносят также ошибки ДНК-полимераз в процессе репликации ДНК [Islas A.L., 1998; Mahajan K.N., 2002].
Выводы об онкологической значимости какого-либо генетического варианта делаются, как правило, на основании сравнения его частоты встречаемости в группах пациентов и здоровых доноров. При этом контрольные группы чаще всего формируются из числа посетителей пунктов переливания крови, т.е. из лиц среднего возраста. Хотя подобный подход является наиболее простым с организационной точки зрения, его корректность в отношении онкологической патологии вызывает определенные возражения. Как упоминалось выше, рак является заболеванием преимущественно людей пожилого возраста, вероятность его возникновения в течение жизни составляет около 40% [Chu K.C. et al., 1996]. Таким образом, средневозрастные контрольные группы почти наполовину состоят из потенциальных онкологических пациентов, что может серьезно осложнять поиск онко-ассоциированных полиморфизмов. В то же время, лица, достигшие преклонного возраста без какой-либо злокачественной патологии, могут быть уже отнесены не к стандартной, а к онкологически-толерантной категории [Того А.В. и соавт., 1999]. С другой стороны, справедливо ожидать, что пациенты с необычно ранним началом заболевания или с первично-множественными опухолями представляют собой «крайний» случай повышенного онкологического риска, что нередко сочетается с отягощенным семейным анамнезом [Narod S.A., 1994]. В связи с этим представляется перспективным подход к исследованию вероятных онко-ассоциированных генетических вариантов, основанный на сравнении частот их встречаемости как в «стандартных» группах (пациенты - доноры), так и в «крайних» группах высокого и низкого риска развития злокачественной патологии (пациенты с первично-множественными, либо ранними РМЖ и пожилые онкологически здоровые доноры). Подобный подход к поиску онко-ассоциированных генетических маркеров привлекателен еще и тем, что позволяет повысить статистическую достоверность результатов без значительного увеличения размеров тестируемых групп.
В настоящей работе представлены результаты поиска вероятных кандидатов на роль генетических маркеров высокого риска развития РМЖ среди генов, отвечающих за репарацию двунитевых разрывов ДНК.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы является изучение структурных вариантов генов, осуществляющих рекомбинационную репарацию, и оценка их влияния на формирование риска рака молочной железы у человека.
В связи с этим поставлены следующие задачи:
1) Идентифицировать потенциально-значимые полиморфные варианты генов, осуществляющих рекомбинационную репарацию, пользуясь доступными в сети Internet базами данных (NCBI, GeneCard, CancerGenes, HGMD), а также с привлечением сведений, опубликованных в специализированных периодических изданиях;
2) Сравнить частоту выбранных полиморфизмов в «крайних» группах онкологического риска (группа пациенток с билатеральным РМЖ и группа пожилых онкологически здоровых женщин);
3) Выявить в группах крайнего онкологического риска и толерантности генетические варианты с наиболее различающейся в указанных группах частотой и провести их анализ посредством «классического» молекулярно-эпидемиологического исследования с привлечением групп здоровых доноров среднего возраста и неселективных случаев РМЖ;
4) Изучить потерю интактных аллелей в клетках опухоли, как одного из механизмов злокачественной прогрессии, используя ДНК, выделенную из карцином молочной железы носителей мутации.
Научная новизна полученных результатов.
Впервые изучена на группе пациенток с диагнозом «рак молочной железы» и здоровых донорах, проживающих преимущественно в Северо-Западном регионе России, встречаемость полиморфных вариантов в генах репарации двунитевых повреждений ДНК (RAD50, MREllA, NBS1). Показано, что 0,6% здоровых женщин среднего возраста (18-45 лет) Северо-Запада России являются носителями наследственной мутации NBS1 657del5. Гетерозиготное носительство NBSl 657del5 ассоциировано с повышенным риском развития РМЖ, причем среди больных, носителей указанной мутации, отмечается тенденция к более раннему, по сравнению с «не-носителями», началу заболевания. Не обнаружено ассоциации между носительством мутации NBSl 657del5 и какими-либо другими клинико-морфологическими особенностями РМЖ. Установлено, что в опухолях молочной железы у носителей данной мутации наблюдаются потери гетерозиготности в области мутации, при этом делеции может подвергаться как интактный, так и мутантный аллель. Не выявлено связи между распространенным полиморфизмом reHaNBSl E185Q (популяционная частота - 37%) и предрасположенностью к РМЖ. Поскольку большинство протестированных в ходе работы генетических вариантов представленны в изученной группе как мономорфные (частота менее 0,005), это не позволяет в настоящее время определенно ответить на вопрос о взаимосвязи таких полиморфизмов с предрасположенностью к РМЖ.
Практическая значимость.
Диссертация имеет научно-теоретический характер.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на Конференции по фундаментальной онкологии (15 апреля 2005 г., Санкт-Петербург, Россия), Российско-Американской конференции по биотехнологии (26-28 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия) и на научной конференции лаборатории молекулярной онкологии, лаборатории онкоэкологии, лаборатории канцерогенеза и старения ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Росздрава (20 апреля 2006 г., Санкт-Петербург, Россия).
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 77 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель включает 172 публикации на русском и английском языках.
Эпидемиология ракамолочной железы
Распространенное мнение о том, что «рак - болезнь пожилых людей» в полной мере, с точки зрения статистики, относится и к новообразованиям молочной железы. Изменение возрастного состава популяции, характеризующееся ее «постарением», которое наблюдается в большинстве индустриальных стран мира, отражается в общем увеличении заболеваемости. Так, среди женщин старше 65 лет риск РМЖ в 6,5 раз больше, чем на всем протяжении жизни до 65 лет, и в 150 раз выше, чем у женщин до 30 лет [Imyanitov E.N., Hanson К.Р., 2004]. Можно предположить, что чем больше продолжительность жизни, тем в большей степени организм женщины подвергается воздействию разнообразных «неблагоприятных факторов», что, в свою очередь, увеличивает риск возникновения злокачественных новообразований, в частности, РМЖ. Эта точка зрения поддерживается мнением, связывающим увеличивающийся возрастной риск злокачественных новообразований со «старением» организма и накоплением за продолжительное время жизни критического груза случайных мутаций, которые при неблагоприятном сочетании могут детерминировать развитие клона злокачественных клеток [Knudson A.G., 2002].
Существенные различия в заболеваемости РМЖ, наблюдающиеся среди жителей Америки и Европы, - с одной стороны, и Азии - с другой, позволяют предположить, что неблагоприятные факторы кроются в различиях образа жизни представителей этих популяционных групп. Исследования, проведенные среди японских женщин, мигрировавших в США, подтвердили это предположение. Среди женщин, живущих в
США 10 и более лет, либо родившихся в США, риск развития РМЖ на 70-80% больше по сравнению с контрольной группой женщин, постоянно проживающих в Восточной Азии. Примечательно также, что среди мигрантов, переехавших в США из больших городов Восточной Азии, риск РМЖ также был на 30% выше по сравнению с мигрантами из сельской местности [Ziegler R.G. et al., 1993].
Тем не менее, предположения о том, какие именно факторы, определяющие «западный» образ жизни ведут к повышению заболеваемости, во многом носят спекулятивный характер.
Показаны достаточно противоречивые ассоциации между риском РМЖ и «наибольшим злом» - курением [Spangler J.G., 1999]. С одной стороны, курение ведет к большой канцерогенной нагрузке на организм и, таким образом, повышает риск развития злокачественных новообразований, в том числе и РМЖ. [Reynolds P. et al., 2004]. Однако компоненты табачного дыма обладают выраженным антиэстрогенным эффектом, что позволяет рассматривать курение, как фактор, снижающий риск РМЖ. [Baron J.A. et al., 1990; Baron J.A., 1996; Baron J.A., Haile R.W., 1998]. Таким образом, вопрос о связи курения с заболеваемостью РМЖ остается в рамках дискуссии [Coyle Y.M., 2004; Tanko L.B., Christiansen С, 2004].
Регулярный прием алкоголя в незначительной степени увеличивает риск РМЖ. Канцерогенное воздействие алкоголя в отношении клеток эпителия молочной железы обусловлено, прежде всего, его способностью усиливать синтез эндогенных эстрогенов и индуцировать образование свободных радикалов кислорода. Продукты метаболизма алкоголя способны также непосредственно повреждать ДНК путем образования аддуктов [Palmer J.R., Rosenberg L., 1993; Reichman M.E. et al., 1993; Ambrosone СВ., Shields P.G., 1999; Ginsburg E.S.,1999; Kuper H. et al., 2000; Singletary K.W., Gapstur S.M., 2001; Dumitrescu R.G. et al., 2005].
Потребление большого количества мяса и жиров повышает риск РМЖ, и напротив, значительное содержание в рационе свежих овощей и фруктов снижает этот риск. Считается, что основным источником канцерогенов в жирах являются гетероциклические амины и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), образующиеся из полиненасыщенных жирных кислот в процессе термической обработки пищи (особенно при жарке). Эти соединения способны накапливаться в клетках и вызывать генотоксический эффект как посредством образования активных радикалов кислорода (АКР), так и за счет формирования аддуктов с ДНК. Свежие овощи и фрукты содержат клетчатку, витамины, природные антиоксиданты и ненасыщенные жирные кислоты, нейтрализующие указанные эффекты [Hunter D.J., Willett W.C.,1996; Lee I.M., 1999; Horn-Ross P.L. et al., 2002; Gerber B. et al., 2003; Zhang S.M., 2004; Ferguson L.R. et al, 2004].
Но, несмотря на большой объем накопленных эпидемиологических данных, к настоящему времени не удалось установить четкой связи между развитием РМЖ и каким-либо определенным канцерогеном во внешней среде.
В течение жизни организм женщины подвержен воздействию как эндогенных, так и экзогенных эстрогенов. В настоящее время эстрогенам отводится ключевая роль в развитии РМЖ. Если ранее эстрогены рассматривались лишь как «промоторы» канцерогенеза, стимулирующие развитие злокачественного клона мутантных клеток [Darbre P.D., 1990], то в последнее десятилетие их роль рассматривается несколько иначе. Было показано, что эстрогены, а также их метаболиты (например, катехолэстрогены) оказывают прямой генотоксический эффект путем образования ДНК-аддуктов [Zhu В.Т., СоппеуА.Н., 1998].
Среди факторов, влияющих на эндогенный уровень эстрогенов, многие ассоциированы с «западным» образом жизни. Эти факторы включают в себя низкую рождаемость, относительно поздний возраст материнства, сокращение периода грудного вскармливания. Среди прочих причин, способствующих гиперэстрогенемии, исследователи отмечают переедание и низкую физическую активность [Yang D. et al., 2003]. Примечательно, что ожирение коррелирует с повышенным уровнем эстрогенов и риском РМЖ в постменопаузе. В пременопаузе ожирение ассоциировано с ановуляторными циклами и снижает вероятность развития РМЖ. В эпидемиологических исследованиях были показаны противоречивые эффекты от приема пероральных контрацептивов и гормонозамещающей терапии [McPherson К. et al., 2000; Clemons М., Goss P., 2001; Gerber В., 2003; Singletary S.E. 2003]. Но, несмотря на противоречивость эпидемиологических данных, экспериментально и клинически показанная связь между гормональным статусом и риском РМЖ, его течением и прогнозом позволяет надеяться, что гормонально-активные препараты могут применяться не только при лечении, но и для профилактики этого заболевания [Clamp A. et al., 2002; Clamp A. et al., 2003].
Рак молочной железы стал одной из первых локализаций, для которого была замечена существенная роль наследственности в развитии этого заболевания. В ряде случаев РМЖ представляется как классическое наследственное заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования. Описаны семьи, в которых до 53% родственниц больных РМЖ заболевали этой же формой рака [Lynch Н.Т. et al., 1978].
Наиболее полно изучены в настоящее время высокопенетрантные «раковые» гены BRCA1 и BRCA2, определяющие развитие 20% случаев семейных форм РМЖ. [Nathanson K.L. et al., 2001]. Однако, вопреки выводам, сделанным на основании ранних исследований, показавших экстремально высокий риск развития РМЖ, ассоциированный с генами BRCA1 и BRCA2 [Ponder В., 1997], последующие результаты заставили пересмотреть это положение. Позже было показано, что пенетрантность этих генов значительно ниже предполагавшейся ранее, и вероятность развития РМЖ на протяжении жизни (до 70 лет) составляет 65% и 45% для носителей BRCA1 и BRCA2, соответственно [Antoniou A. et al, 2003].
Рак молочной железы может быть одной из форм рака, составляющих синдромы, ассоциированные с наследственными мутациями, например, синдромов Ataxiaeleangiectasia, обусловленный наличием мутации в гене ATM, и Li-Fraumeni, связанного с мутацией гена р53. У гетерозиготных носителей эти мутации повышают риск развития РМЖ [Swift М., 1990; Tonin P.N., 2000].
На популяционном уровне случаи РМЖ, ассоциированные с известными наследственными мутациями, составляют относительно небольшое число случаев (менее 5%). Генетические факторы, влияющие на развитие подавляющего большинства случаев РМЖ, в том числе относимые к спорадическим формам, находятся в стадии изучения.
Механизмы, отвечающие за развитие злокачественного новообразования, в зависимости от наличия того или иного низкопенетрантного генетического полиморфизма, не всегда понятны. Ассоциированные с заболеванием генетические полиморфизмы, обнаруженные в некодирующих, не регуляторных областях генома, либо не вызывающие изменения в структуре кодируемого полипептида (кодирующие синонимные варианты) зачастую оставляют биологический смысл такой ассоциации в рамках предположений и требуют многопланового изучения и перепроверки [Kuschel В. et al., 2002]. Существует мнение, что в этой связи следует обратить внимание, прежде всего, на те генетические варианты, которые изменяют аминокислотную последовательность кодируемого белка.
Внутриклеточные факторы геномной стабильности
Одним из типовых изменений в клетке, наблюдаемых при злокачественной трансформации, является нарушение стабильности генома. Характерные признаки геномной нестабильности в опухоли - точковые мутации, короткие делеции и инсерции, дупликации, изменения числа и строения хромосом, потери гетерозиготности -значительно превышают естественный уровень спонтанных аберраций [Knudson A.G., 2002; Natarajan А.Т., 2002]. Нестабильность клеточного генома, проявляющаяся в потери гетерозиготности множественных участков хромосом, положительно коррелирует со степенью прогрессии новообразования [Shen C.-Y. et al., 2000]. Одна из древнейших биологических систем, обеспечивающих поддержание постоянства клеточного генома, выполняет функцию распознавания и исправления (репарации) изменений, возникающих в первичной структуре ДНК [Hoeijmakers J.H.J, et al., 2001; Thompson L.H., Schild D., 2001].
Повреждения ДНК, возникающие в клетке спонтанно, либо под воздействием внешних факторов (физических, химических, биологических) достаточно разнообразны. В эукариотической клетке существует комплексная система распознавания и репарации дефектов ДНК, включающая в себя множество функционально различных видов репарации. Основные виды повреждений ДНК и способы их репарации представлены в таблице 1.
По современным представлениям, нарушения именно в звене репарации двунитевых разрывов ДНК (double strand break repair, DSB-repair, DSBR) создают основу для возникновения хромосомной нестабильности, характерной для РМЖ [Bishop A.J.R., Schiestl R.H., 2000; van Gent D.C. et al., 2001; Duker N.J., 2002; Obe G. et al., 2002; Iliakis G. etal.,2004].
Система DSB-репарации представляет собой сложный комплекс биохимических процессов, с множеством участников, выполняющих функции распознавания разрывов ДНК и их исправления, интегрированный в систему контроля клеточного цикла и апоптоза. Роль интеграторов в этой системе выполняют белки р53, ATM, BRCA1, BRCA2, СНЕК1, СНЕК2 и другие [Dasika G.K. et al.,1999; Копнин Б.П., 2000]. Репарация двунитевых разрывов может осуществляться альтернативными путями: гомологичной рекомбинацией (homologous recombination repair, HRR) и негомологичным сопоставлением разорванных двойных цепей ДНК (non-homologous end-joining, NHEJ). В первом случае генетическая информация восстанавливается за счет рекомбинации с гомологичной хромосомой, которая служит матрицей для создания новой копии поврежденного участка цепи ДНК (Рис. 1). В процессе негомологичного сопоставления цепей ДНК, фрагменты разорванной ДНК «стягиваются» друг к другу, при этом значительный участок исходной цепи, как правило, элиминируется в процессе репарации (Рис. 2). Существует также механизм репарации однонитевых разрывов ДНК (single strand break repair, SSBR), который содержит в себе элементы как HRR, так и NHEJ.
В любом случае, при репарации двунитевых разрывов ДНК частичная потеря исходной генетической информации неизбежна. Но конечной целью DSB-репарации является сохранение структурной целостности хромосом, необходимой для продолжения жизненного цикла клетки [Rothkamm К. et al., 2001; Rothkamm К. et al., 2003]. В случае невозможности осуществить репарацию клетка, в норме, подвергается апоптозу (Рис. 3) [Jackson S.P., 2001; Berstein С. et al., 2002; Kaina В., 2003].
При неэффективности, либо некорректности, процесса DSB-репарации в геноме клетки возникают нарушения по типу потерь гетерозиготности (ЦТ), делеций и инсерций участков хромосом [Difilippantonio M.J. et al, 2002]. Если возникающие нарушения не детальны, они закрепляются в геноме клетки и передаются следующим поколениям при митозе. Вопрос накопления в клетке «критической массы» мутаций, затрагивающих основные системы регуляции клеточного цикла, становится функцией от времени, частоты повреждений ДНК (канцерогенной нагрузки), зависящей от внешних
воздействий, и корректности самого процесса репарации [Schar Р., 2001]. При этом сами гены репарации также нередко подвергаются элиминации в процессе опухолевой трансформации [Sarasin А., 2003]. Так, в исследовании 127 опухолей РМЖ, потери гетерозиготносте составили 49% для гена BRCA1, 44% для BRCA2 и 32% для Rad51 [Gonzalez R. etal., 1999].
Также есть данные, свидетельствующие о функциональной недостаточности интактной копии гена у носителей наследованной мутации [Staff S. et al., 2003; Speit G., Trenz K., 2004].
Относительный вклад каждого из альтернативных путей репарации (HRR и NHEJ) в поддержании стабильности генома в клетках человека до конца не определен [Kanaar R. et al., 1998; Haber J.E., 2000; Johnson R.D., Jasin M., 2000; Johnson R.D., Jasin M., 2001]. Существует точка зрения, что NHEJ играет первостепенную роль в клетках, делящихся митозом [Jackson S.P., Jeggo Р.А., 1995]. Репарация же путем гомологичной рекомбинации осуществляется главным образом в мейотических клетках, когда возможен процесс сестринского обмена хроматид в поздней S и G2 стадиях клеточного цикла, в то время как в G1 и ранней S стадии репарация осуществляется путем NHEJ [Lee S.E. et al., 1997; Takata M. et al., 1998; Haber J.E., 2000; Morrison C, Takeda S., 2000; Jackson S.P., 2002]. Исследования с использованием технологии получения «нокаутных» генетических мутантов, проведенные на клеточных культурах и организмах животных позволили
Роль повреждений ДНК, процессов репарации ДНК и апоптоза в канцерогенезе (по Berstein С. et al., 2002).
выявить фенотипические различия, характеризующие нарушения в звене гомологичной и негомологичной репарации (Таблица 2.) Из полученных в результате таких экспериментов данных, очевидно, что оба процесса DSB-репарации значимы для митотически делящихся клеток [Valerie К., Povirk L.F., 2003], хотя вопрос об активности этих путей в разных фазах клеточного цикла остается нерешенным. А характерный паттерн функциональных нарушений позволяет глубже понимать патогенез развития злокачественных новообразований, характеризующихся геномной нестабильностью, в том числе РМЖ.
Источники ДНК для молекулярно-генетического анализа
В качестве источника для выделения ДНК в большинстве случаев были взяты клетки периферической крови. Исключение составили 164 случая БРМЖ, ДНК которых была извлечена из архивных патоморфологических образцов.
Забор периферической крови у доноров и пациентов осуществлялся при наличии добровольного информированного согласия на включение их в проводимое исследование.
Выделение ДНК из периферических лейкоцитов проводилось посредством модифицированного соль-хлороформного метода [Mullenbach R. et al., 1989]. Эритроциты подвергались гипоосмотическому лизису посредством 3-кратного разведения 5 мл крови бидистиллированной водой, охлажденной до +4 С. Затем лейкоциты осаждали посредством центрифугирования в течение 15 минут при 150 g. Полученный осадок лейкоцитов ресуспендировали в 1 мл раствора Трис-HCl (рН=8,3). Для разрушения цитоплазматической мембраны клеток к суспензии добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1%. Ядра осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 2000 g, после чего вновь ресуспендировали в 1 мл Трис-HCl (рН=8,3) и лизировали посредством добавления лаурилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Для протеолиза белков и деградации комплексов «белок-ДНК» лизаты инкубировали в присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60 С в течение 12 часов. Затем к образцу добавляли раствор NaCl до конечной концентрации 0,5 М и равный объем хлороформа. Экстракция органическим растворителем проводилась в течение 30 минут при медленном покачивании с целью удаления из раствора ДНК гидрофобных компонентов клеточного лизата - белков и липидов.
Последующее центрифугирование в течение 15 минут при 15000 g приводило к разделению раствора на 3 фазы: верхнюю, водную, содержащую растворенную ДНК и неорганические соли, нижнюю, хлороформную, содержащую гидрофобные компоненты, и промежуточную. К осторожно отобранной верхней фазе добавляли равный объем изопропанола, оставляли на 20 минут при температуре -20 С и затем снова центрифугировали в течение 15 минут при 15000 g. Осадок ДНК промывали в 1 мл 70% этанола и растворяли в 0,5 мл 200 мМ раствора Трис-ЭДТА (рН = 7,6). Полученный раствор ДНК хранился при температуре -20 С до использования в эксперименте.
Выделение ДНК из патоморфологических парафиновых образцов производилось посредством протокола, направленного на получение пригодного для использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР) лизата клеток [Imyanitov E.N. et al., 2000; Imyanitov E.N. et al., 2001]. С архивных патоморфологических образцов, представляющих собой блоки пропитанных парафином тканей, были сделаны с помощью микротома срезы толщиной 20 мкм. Полученные срезы депарафинизировались посредством инкубации в трех сменах ксилола по 500 мл при температуре 37 С. Длительность инкубации в каждой смене ксилола составляла 20 минут. Частичную регидратацию тканей осуществляли инкубацией по 10 минут в 3 сменах этанола: 96%, затем 80% и 70% - по 500 мкл, при комнатной температуре. После удаления этанола к образцам, слегка подсушенным на воздухе, добавляли 200 мкл лизирующего раствора (ЮтМ Трис-HCl, рН=8,3; 1 mM EDTA; 2% Тритон Х-100, протеиназы К - до 500 мкг/мл). Лизис проводился при +60 С, в течение 12-24 часов, после чего образцы инкубировались 10 минут при +95 С с целью полной инактивации протеиназы К. Полученный лизат десятикратно разводили бидистиллированной водой и использовали в ПЦР. До эксперимента лизаты хранились при температуре -20 С.
Список генетических вариантов (мутации, полиморфизмы) был составлен на основе изучения специализированных банков данных и публикаций, доступных в сети Internet (Таблица 4). Сбор информации производился в период с 01 ноября 2002 по 30 ноября 2004 года.
Выбор генетических вариантов, потенциально значимых для последующего экспериментального популяционного молекулярно-генетического изучения, производился с учетом следующих критериев: полиморфизм находится в кодирующей области гена; вариабельность на уровне ДНК приводит к изменению первичной структуры кодируемого им полипептида; данные о полиморфизме получены при изучении последовательности ДНК/кДНК, выделенной из здоровых клеток индивидов, но не из клеток опухоли или клеточных линий;
Изучение частот полиморфизмов генов MRE11, NBS1 и RAD50 в ограниченных (пилотных) группах высокого онкологического риска и толерантности
В представленной работе показаны результаты анализа частоты мутаций и полиморфизмов в генах комплекса RAD50/MRE11A/NBS1, который является центральным в осуществлении процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках человека. Одной из основных задач исследования было выявление генетических вариантов, ассоциированных с предрасположенностью к развитию рака молочной железы.
В процессе работы было протестировано 32 полиморфных варианта в генах комплекса RAD50/MRE11A/NBS1, б из которых представляют собой терминирующие (транкирующие) мутации и 26 - миссенс-мутации, приводящие к замене аминокислотной последовательности кодируемого белка.
Идентификация генетических вариантов производилась методом аллель-специфической ПНР для всех вариантов, кроме NBS1 657del5, делеция 5 нуклеотидов в котором позволяет дискриминировать интактный и мутантный аллели по размеру ампликона. Выбор метода аллель-специфической ПЦР представлялся более предпочтительным, по сравнению со ставшим классическим рестрикционным анализом, поскольку в первом случае спектр анализируемых нуклеотидных замен не лимитирован наличием в данной области последовательности сайта рестрикции.
Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция (АС-ПЦР) является одним из методов прямой детекции известных точковых мутаций, коротких инсерций, делеций и единичных нуклеотидных полиморфизмов. В основе метода лежит неспособность Taq ДНК-полимеразы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия (mismatch) между вариабельным нуклеотидом на матричной ДНК и З -концом одного из олигопраймеров [Newton C.R. et al., 1989; Sarkar G. et al., 1990]. Но в практике, зачастую, происходит амплификация ПЦР фрагмента, при субоптимальных условиях, даже в случае подобного несоответствия. В процессе оптимизации АС-ПЦР требуется эмпирически найти довольно узкий диапазон условий, когда, с одной стороны, их жесткость не позволяет амплифицировать неспецифичный фрагмент, а, с другой стороны, не происходит полного подавления реакции. Выполнение этой задачи сопряжено с серьезными, подчас неразрешимыми трудностями. Это обстоятельство весьма существенно ограничивает применение АС-ПЦР [Malcolm Е.К. et al, 2000].
Для увеличения достоверности результатов аллель-специфической ПЦР, в случаях, когда не удавалось найти оптимальные условия для дискриминации специфической и ложно-положительной амплификации, был использован оригинальный способ проведения ПЦР-реакции, основанный на применении «депозиторных» праймеров [Imyanitov E.N. et al. 2003].
Депозиторный праймер представляет собой олигонуклеотид, полностью комплементарный аллель-специфическому праймеру. В каждую из проводимых ПЦР-реакций добавляются депозиторные олигонуклеотидные последовательности, комплиментарные аллель-специфическим праймерам. Это позволяет обратимо депонировать часть находящихся в реакции праймеров. В данной системе происходит конкуренция за аллель-специфический праймер между депозиторным олигонуклеотидом и ДНК-матрицей. В случае полной комплементарности между аллель-специфическим праймером и матрицей, сразу после отжига праймера происходит его элонгация, что увеличивает сродство праймера к матрице и является началом синтеза амплифицируемого фрагмента (Рис. 6, правый верхний фрагмент). В случае неполной комплиментарности между аллель-специфическим праймером и матрицей, когда имеется 3 -концевой неспареный нуклеотид и элонгация существенно затруднена, праймер успевает диссоциировать с матрицей, а депозиторный олигонуклеотид, связывая его, препятствует реассоциации с матрицей (Рис. 6, правый нижний фрагмент). Таким образом, неспецифическая амплификация предотвращается (Рис. 6, левая колонка). Существенным преимуществом данного подхода является то, что депонирование праймеров происходит обратимо, т.к. процесс отжига-плавления праймеров и депозиторных олигонуклеотидов повторяется с каждым циклом ПЦР. Благодаря этому добавление депозиторных олигонуклеотидов в концентрациях, сопоставимых с концентрацией праймеров (соотношение депозиторных олигонуклеотидов к праймерам может варьировать в диапазоне 0,5:1 - 5:1), не отражается критически на кинетике реакции и позволяет использовать обычное число ПЦР-циклов для получения достаточного количества продукта. Использование депозиторных праймеров в аллель-специфической ПЦР позволяет повысить специфичность реакции, при этом её чувствительность практически не изменяется, а расширение диапазона приемлемых условий реакции позволяет значительно сократить число оптимизационных подходов для каждого отдельного полиморфизма (Рис.7). Это делает возможным нахождение оптимального диапазона условий ПЦР значительно более быстро, чем при использовании общепринятого метода. Применение данного подхода значительно особенно упрощает работу методом аллель-специфической ПЦР в тех случаях, когда для анализа используется архивный патоморфологический материал, ДНК в котором претерпевает значительную деградацию.
Похожие диссертации на Роль полиморфизмов генов репарации ДНК в формировании предрасположенности к раку молочной железы
