Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Этиология и патогенез рака легкого 12
1.1.1. Молекулярный патогенез рака легкого 17
1.2. Генетический полиморфизм и его роль в детерминации онкологического риска 22
1.2.1. Роль ДНК-полиморфизмов в риске развития и прогрессии рака легкого 23
1.3. Роль полиморфизма генов рецепторов, клеточного цикла и репарации ДНК в патогенезе рака легкого 25
1.3.1. Хемокиновый рецептор CCR5 27
1.3.2. Ген—онкосупрессор р53 33
1.3.3. XRCC1 - ген эксцизионной репарации ДНК 41
Глава 2. Материал и методы исследования 48
2.1. Характеристика клинического материала 48
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Метод выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови 50
2.2.2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 51
2.2.3. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 52
2.2.4. Метод гель-электрофореза 53
2.3. Математический анализ результатов 57
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 58
3.1. Характеристика полиморфных вариантов генов в группах больных раком легкого и онкологически здоровых доноров 58
3.2. Клинико-морфологические параметры больных НМРЛ 59
3.3. Полиморфизм гена р53 у больных раком легкого 61
3.3.1. Полиморфизм 3 интрона гена р5 3 у больных раком легкого 62
3.3.2. Полиморфизм 4 экзона гена р53 у больных раком легкого 65
3.3.3. Полиморфизм 6 интрона гена р53 у больных раком легкого 72
3.3.4. Сочетание полиморфных генотипов (3 интрона-4 экзона-6 интрона) генар53 у больных раком легкого 79
3.4. Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком легкого 93
3.5. Полиморфизм гена репарации XRCC1 у больных раком легкого 105
Заключение 117
Выводы 127
Список литературы 128
- Хемокиновый рецептор CCR5
- Характеристика клинического материала
- Полиморфизм 4 экзона гена р53 у больных раком легкого
- Сочетание полиморфных генотипов (3 интрона-4 экзона-6 интрона) генар53 у больных раком легкого
Хемокиновый рецептор CCR5
Цитокины - биологически активные вещества пептидной природы, регулируют широкий спектр процессов, протекающих в организме. С помощью «цитокиновой сети» иммунная система осуществляет иммунный надзор при различных формах патологического воспаления, а также различных инфекционных воздействиях, включая вирусы (Носик Н.Н., 2000). С определенной условностью все известные цитокины сгруппированы следующим образом: гемопоэтические ростовые факторы, лимфокины, монокины и хемокины (Liles et al., 1995).
Хемокины - это низкомолекулярные белки молекулярной массой 8-12 кДа, насыщенные основными аминокислотами и остатками цистеина. По положению в молекулах консервативных остатков цистеина все хемокины разделены на 4 основных группы: СХС (а-хемокины), С-С ((3-хемокины), С (у-хемокины) и СХЗС (5-хемокины) (Симбирцев А.С., 1999; Хаитов P.M. и соавт., 2000). Существует специфичность связывания в системе лиганд-рецептор в рамках семейств хемокинов: СХС-хемокины связываются только с СХС-рецепторами, а СС-хемокины - только с СС- рецепторами. Рецепторы для хемокинов экспрессируются на различных клетках, включая все зрелые гемопоэтические клетки. Экспрессия тех или иных рецепторов зависит от степени дифференцировки и активации клеток (Тотолян А.А., 2001; Murphy et al., 2001).
Хемокины выступают в роли регуляторов, контролирующих движение лейкоцитов, гомеостаз, и воспаление. Лейкоцитарная экстравазация из крови в ткани - это регуляторный многоступенчатый процесс, включающий взаимодействия между лейкоцитами и эндотелиальными клетками. Несколько семейств молекулярных регуляторов, таких как селектины, интегрины и хемокины, контролируют этот - процесс. Селектины отвечают за движение лейкоцитов по поверхности эндотелиальных клеток. Хемокины передают сигналы, превращающие селектин-связанные взаимодействия в интегрин-связанные взаимодействия, которые ведут к экстравазации лейкоцитов. Хемокины контролируют гомеостатическую циркуляцию лейкоцитов через ткани. Непрерывная рециркуляция лимфоцитов через кровь, ткани и лимфатические сосуды приносит инактивированные лимфоциты в лимфоузлы, где они встречаются с антигенами и затем мигрируют в воспалительную ткань, тем самым, обеспечивая иммунитет (Luster et al., 2003).
Наиболее хорошо изученным и универсальным среди хемокиновых рецепторов является CCR5, принадлежащий к семейству родопсинов и включающий семь трансмембранных доменов, передающих сигнал через G-связанные молекулы (Blanpain et al., 1999; Onuffer et al., 2002; Thelen, 2001). Первый доклад о секвенировании человеческого CCR5 и обнаружении его лигандов был опубликован 19 марта 1996 года (Samson et al., 1996). Ген, кодирующий этот белок, картирован на коротком плече хромосомы 3 (Зр21), изначально был обозначен как Chem R13, кодирует белок длиной в 352 аминокислоты, молекулярной массой приблизительно 40600 Да. Mummidi et al. в 1997 году установили, что CCR5 состоит из 4 экзонов длиной около 6 т.п.н и 2 нитронов между 1 и 2, 2 и 3 экзонами. Samson et al. в 1996 году показали, что в трансфекционных клетках воспалительный белок (МІР-la) является главным потенциальным агонистом для CCR5. CCR5 экспрессируется в периферических дендритных клетках, гематопоэтических CD34+ клетках-предшественниках, и в активированных CD26hishCD45RAlowCD45R0+Thl лимфоцитах памяти CD4+ и CD8+ тимоцитах и клетках Лангерганса. В ЦНС CCR5 экспрессируется в нейронах, астроцитах и в клетках микроглии. В других тканях CCR5 экспрессируется в эпителии, эндотелии, гладких мышцах сосудов, и на фибробластах. CCR5-позитивные клетки более часто встречаются в ободочной кишке, чем в прямой и чаще в шейке матки, что позволяет предположить, что уровни экспрессии корецепторов различно регулируются в различных компарртментах организма. Основными лигандами для CCR5 являются хемокины RANTES (Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted), МІР 1-а и p (Monocyte Inflammatory Protein la, p), МСР-2 и MCP-4. CCR5-oпocpeдoвaнный сигнал ведет к активации иммунокомпетентных клеток и их миграции в очаг воспаления, то есть CCR5 функционально вовлечен в процессы естественного и специфического иммунитета (Murphy et al., 2000).
Установлено, что данный рецептор имеет решающее значение для проникновения в лимфоидные клетки вируса иммунодефицита человека HIV (Human Immunodeficiency Virus) (Samson et al., 1996; Zimmerman et al., 1997). Однако делеция 32 нуклеотидов в одном из кодирующих экзонов гена хемокинового рецептора CCR5, приводящая к сдвигу рамки считывания и преждевременному появлению стоп-кодона, ведет к снижению уровня экспрессии рецептора на поверхности клетки и препятствует проникновению вируса HIV-1 в CD4+ лимфоциты. Установлено, что гомозиготы по этой делеции (de!32/del32), которые среди европеоидов составляют около 1%, обнаруживают выраженную резистентность к ВИЧ-инфекции. У носителей del32/del32 генотипа снижается вероятность заболеть СПИДом и возможна при массированном, многократном инфицировании. Интересно отметить, что CCR5 также служит ко-рецептором для вируса миксомы, поксвируса кроликов, являясь, тем самым, результатом межвидовой борьбы между человеком как биологическим видом и популяциями патогенных микроорганизмов (Murphy et al., 2000).
Делеционный полиморфизм CCR5 обнаруживает выраженную этническую, популяционную и географическую специфичность. Наибольшая частота мутантного аллеля (13-14%) зарегистрирована в Великобритании, Польше и северо-западе России. Он встречается много реже в более южных и восточных популяциях. А именно, у татар частота ёе132аллеля такая же, как у русских (13%), тогда как у грузин, в отличие от азербайджанцев, ни одного мутантного аллеля пока не зарегистрировано. В среднем 10-15% всех европеоидов - гетерозиготы по этой мутации и около 1% обнаруживают гомозиготное носительство CCR5del32/CCR5del32 генотипа. В остальной части Европы, а также на Северном Востоке и Индии частота носительства CCR5del32 снижается примерно до 2-8%. Делеционный вариант гена CCR5 не обнаружен в популяциях Северной и Южной Америки, Африки и некоторых районах Азии (Samson et al., 1996; Martinson et al., 1997). В популяциях русских Западной и Восточной Сибири генотипическая частота del32 аллеля составляет 10,4%. Среди различных этнических меньшинств установлен высокий уровень носительства мутантного генотипа CCR5, так в популяциях ханты -12,3%, манси -5,2%, а также в финской этнической группе коми, мордовы, мари-17,9%. Не найдено ни одного случая носительства генотипа с CCR5del32 среди монгол (Уланбатор), якутов (Якутск) и нанайцев (Yudin et al., 1998).
По мнению ряда авторов, мутация гена CCR5 напоминает сбалансированные генные полиморфизмы, когда наличие мутантного аллеля вместе с нарушением функции обуславливает резистентность в отношении какого-либо заболевания. Найдены ассоциации гена CCR5, несущего делецию 32 нуклеотидов, с прогнозом ряда инфекционных (ВИЧ-инфекция, туберкулез, грипп) (Dean et al., 1996) и соматических (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, ревматоидный артрит) заболеваниий (Cooke et al., 1998; Gonzalez et al., 2001; Kalev et al., 2003;). Hall et al. (1999) сообщили, что для носителей del32 в гене CCR5 характерен пониженный риск развития астмы. Barcellos et al. (2000) предоставили доказательства, свидетельствующие о том, что del32 гена CCR5 может способствовать более медленному прогрессированию рассеянного склероза.
Роль цитокинов и хемокинов, в частности, в процессах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии далеко неоднозначна. Имеется множество сведений как о противоопухолевой активности различных цитокинов, так и об их функционировании в качестве промоторов опухолевого роста (Кадагидзе З.Г., 2003). Подтверждением вовлечения цитокинов в патогенез ЗНО являются данные о том, что отдельные аллельные варианты их полиморфных генов ассоциированы с особенностями клинического течения, исходом онкологического процесса (Zafiropoulos et al, 2004).
Вовлечение хемокинового рецептора CCR5 в формирование опухоли (т.е. на этапах инициации и промоции) может быть опосредовано его влиянием на становление специфического противоопухолевого ответа по ТЫ механизму (Luboshits et al., 1999; Azenshtein et al., 2002) и способностью регулировать апоптоз модифицированных клеток р53- зависимым путем (Manes et al., 2003). В этой связи у индивидуумов, несущих вариантный аллель del32, вероятна ингибиция иммунного ответа в связи со сниженной экспрессией CCR5 на иммунокомпетентных клетках. Косвенно это подтверждается данными Бабышкиной Н.Н. (2005), о том, что функциональная активность лимфоцитов повышается у больных с предопухолевой патологией молочной железы, имеющих только нормальные аллели CCR5, при этом у пациентов с наличием делеционного аллеля такой активации не наблюдается.
Характеристика клинического материала
В исследование были включены 170 больных с патологией легких, из них 136 больных НМРЛ, 34 больных МРЛ (таблица 1). Больные РЛ T1.4N0.3M0-1 находились па стационарном лечении в торако-абдоминальном отделении ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением - д.м.н., профессор С.А. Тузиков). Подавляющее число больных РЛ было мужского пола: обследовано 158 мужчин (93%) и 12 женщин (7%), возрастной интервал составил от 42 до 80 лет (средний возраст составил 60,2±8,6 лет).
Гистологическое исследование проводилось в отделении патологической морфологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (руководитель отделения - д.м.н., профессор В.М. Перельмутер). Стадия онкологического процесса определялась в соответствии с четвертым пересмотром Международной классификации опухолей по системе TNM (Женева, 1987), а также вторым пересмотром (UICC, 1992) и дополнением к классификации TNM (UICC, 1993), одобренным Американским комитетом по раку (AJCC). Формирование групп осуществлялось после постановки диагноза на основании клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследования (таблица 2).
В качестве популяциоиного контроля использовали выборку здоровых лиц европеоидного происхождения, проживающих в г. Новосибирске (188 практически здоровых мужчин, средний возраст - 58,6±6,8 лет). Контрольная выборка была сформирована из здоровых мужчин, с учетом соответствия возрастного и полового состава, данные любезно предоставлены М. И. Воеводой (г. Новосибирск). В группы больных и в группу здоровых были включены индивидуумы только европеоидного происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей (Галеева А.Р. и соавт., 1998;Yudinetal., 1998;).
Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). На проведение исследований получено разрешение этического комитета НИИ онкологии.
Полиморфизм 4 экзона гена р53 у больных раком легкого
Полиморфизм 72 кодона 4 экзона является наиболее функционально значимым, так как затрагивает ДНК-связывающий домен, и представлен тремя генотипами (Arg/Arg, Arg/Pro, Pro/Pro) в результате однонуклеотидной замены гуанина (G) на цитозин (С) (CGC - аргинин, ССС - пролин). При изучении биохимической, биологической, структурной сходности белка р53 при разных генотипах 4 экзона выявлено, что аргининовый и пролиновый варианты обладают разной способностью к взаимодействию и активации транскрипции генов-мишеней, что может иметь значение при задержке клеточного деления (Thomas et al.,1999; Bonafe et al., 2003). Несмотря на то, что полиморфизм 4 экзона гена р53 широко изучается при раке яичников, молочной железы, желудка, щитовидной железы, мочевого пузыря и легкого (Peller et al., 1995; Runnebaum et al., 1995; Sjalander et al., 1995; Birgander et al, 1996; Hillebrandt et al., 1997; Mavridou et al., 1998; Wang-Gohrke et al., 1998), данные о его взаимосвязи с риском ЗНО неоднозначны, что делает актуальным дальнейшее изучение этого вопроса. Распределение частот генотипов гена р53 у больных раком легкого в зависимости от гистотипа опухоли представленно в таблице 11.
Частота Arg/Pro генотипа в группах наблюдения была максимально приближена к показателям группы контроля. Наименьшая частота Pro/Pro генотипа была выявлена в группе больных НМРЛ и составила 6% против 11% группы контроля, без статистически значимых различий, р=0,11. С учетом отсутствия ассоциации генотипов 4 экзона с риском развития рака легкого, мы сочли целесообразным оценить полиморфизм 72 кодона при сочетанном влиянии фактора курения, одним из основных этиологических факторов риска развития НМРЛ. Распределение частот генотипов гена р53 в зависимости от причастности к курению представлено в таблице 12.
Нами выявлено незначимое преобладание частот Arg/Arg генотипа в группах курящих и некурящих больных НМРЛ (54% и 61%, соответственно) над частотой данного генотипа группы контроля (45%). В группе некурящих больных НМРЛ выявлено статистически незначимое снижение частоты Arg/Pro генотипа (28%) в сравнении с группой контроля (42%) и группой курящих больных НМРЛ (42%). Частота Pro/Pro генотипа группы курящих больных НМРЛ статистически значимо ниже показателей группы контроля и составляет, 4% против 13%, соответственно (р 0,02), что свидетельствует о снижении риска развития НМРЛ для курящих носителей данного генотипа гена р53.
Продолжением вышеописанных наблюдений явилась попытка изучения роли полиморфизма 4 экзона гена р53 в риске развития НМРЛ в зависимости от возраста. Распределение частот генотипов гена р53 у больных раком легкого в зависимости от возраста представлено в таблице 13. Частота генотипа Arg/Arg в группе больных НМРЛ пожилого возраста составила 66%, что значимо выше группы популяционного контроля - 45% (Х2=10,91, р 0,000; OR=2,55, С195%=1,40-4,66). В тоже время частота генотипа Arg/Arg группы больных НМРЛ пожилого возраста, составившая 66%, статистически значимо выше, чем в группе больных НМРЛ зрелого возраста - 42% (Х2=8,04;р 0,004). Частота Arg/Pro генотипа группы больных НМРЛ пожилого возраста составила 31%, что незначительно ниже 42% группы контроля и в тоже время умеренно (р 0,06, Х2=3,52) ниже 47% группы НМРЛ зрелого возраста.
Наименьшая частота встречаемости генотипа Pro/Pro выявлена в группе больных НМРЛ пожилого возраста по сравнению с группой контроля, 3% и 13%, соответственно, р 0,01. А так же нами выявлена тенденция (р=0,07) к снижению частоты генотипа Pro/Pro группы НМРЛ пожилого возраста по отношению к показателям группы НМРЛ зрелого возраста. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что Arg/Arg генотип повышает, a Pro/Pro генотип снижает риск развития НМРЛ для лиц пожилого возраста.
Необходимо отметить, что в литературе встречаются работы по оценке рисковой значимости данного генотипа в зависимости от возраста (Ляхович В.В. и соавт., 2003, Szymanowska et al., 2006), однако результаты носят противоречивый характер.
Таким образом, нами выявлена ассоциация Arg/Arg генотипа гена р53 с риском развития НМРЛ для лиц пожилого возраста, и установлена взаимосвязь Pro/Pro генотипа со сниженным риском развития НМРЛ для курящих или лиц пожилого возраста. Наши результаты находятся в согласии с представленными ранее данными Ляховичем В.В. и соавт. (2000) для Западно-Сибирской популяции о повышении частоты Arg аллеля в группах больных РЛ, а также данными ряда зарубежных авторов (Wang et al., 1999; Papadakis et al., 2002; Neeraj et al., 2005; Siddique et al., 2005).
Выявленная нами рисковая значимость мажорного аллеля 4 экзона может быть объяснена данными, приведенными в работах Zollner et al. (2004), Infante -Rivard (2003) которые свидетельствуют о том, что не только редкие (минорные) варианты генов, но и часто встречающиеся (мажорные) могут быть вовлечены в патогенез различных заболеваний. Возможно, что в результате действия стабилизационного отбора на эволюционном уровне происходит элиминация целого ряда неудачных генетических конструкций, но, в тоже время, могут сохраниться такие аллельные варианты, которые являются нейтральными или даже благоприятными на ранних этапах онтогенеза, но они оказываются «вредными» в периоде позднего онтогенеза человека.
Установлено, что аргининовый аллель в гомозиготном состоянии в отличие от пролинового аллеля обладает способностью ингибировать белок р73 (Bergamaschi et al., 2003), что может иметь большую роль при инактивации гена и/или белка р53 в диспластических клетках бронхо-альвеолярного эпителия. р73 имеет достаточно высокую степень гомологии с белком р53 в участках транс-активационного, ДНК-связывающего и олигомеризационного доменов, за счет чего р73 может в случае утраты р53- опосредованного пути апоптоза активировать р53-отвечающие гены и вызывать апоптоз (Копнин Б.П., 2003).
Далее мы сочли немаловажным оценить рисковую значимость сочетанного влияния возраста и курения в формировании НМРЛ, данные представлены в таблице 14. Частота Arg/Pro генотипа гена р53 составила 54% в группе курящих больных НМРЛ зрелого возраста, что статистически значимо выше 42% группы популяционного контроля (Х2=11,29, р 0,000; OR=2,84, С195% -1,45-5,55). А так же нами выявлена взаимосвязь Arg/Arg генотипа с риском НМРЛ для курящих лиц пожилого возраста, частота встречаемости данного генотипа составила 73% против 45% группы контроля (Х2=8,09, р 0,004; OR=3,19, С195% =1,38-7,50).
Таким образом, можно полагать, что белок р53, несущий Arg аллель в гомо- или гетерозиготном состоянии белее чувствителен к стрессовому влиянию фактора курения, нежели Pro/Pro генотип.
Белок р53 — регулятор апоптоза, можно также отнести и к белкам, контролирующим процессы дифференцировки клеток, поскольку некоторые из транс-активируемых им генов кодируют белки дифференцировки клеток (Копнин Б.П., 2003). В литературе имеются единичные данные об ассоциации полиморфизма 4 экзона гена р53 с риском развития опухолей различной степени дифференцировки. Так, Sjalander et.al. (2007) установлена ассоциация пролинового аллеля с высокодифференцированными опухолями молочной железы, что позволило авторам отнести носительство данного генотипа к факторам благоприятного прогноза. Наши данные по распределению частот генотипов гена р53 у больных раком легкого в зависимости от степени дифференцировки клеток опухоли представлены в таблице 15.
Частота встречаемости генотипов по 4 экзону гена р53 в группах больных НМРЛ в зависимости от степени дифференцировки клеток опухоли не имела статистически значимых различий с контролем. Так, частота Arg/Arg генотипа в группах НМРЛ составила для больных, имевших умеренную и низкую степень дифференцировки клеток опухоли, 53% и 55%, соответственно, что незначительно выше группы контроля (45%). Частота Arg/Pro генотипа в группах больных НМРЛ была приближена к показателям контроля.
Таким образом, нами не выявлена ассоциация полиморфизма 4 экзона гена р53 с риском развития НМРЛ определенной степени дифференцировки клеток опухоли.
Учитывая решающую роль метастазирования в исходе рака легкого, важным представляется оценка ассоциаций полиморфизма 4 экзона гена р53 с формированием метастазов. Вовлечение р53 в этот процесс подтверждается тем, что он репрессирует транскрипцию как гена VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), так и гена HIF-1 (Hypoxia Inducing Factor 1) - транскрипционного фактора, обеспечивающего повышение экспрессии VEGF и его рецепторов в ответ на уменьшение содержания кислорода. Кроме этого HIF-1 изменяет экспрессию генов, контролирующих транспорт глюкозы и гликолиз, что обеспечивает адаптацию клеток к условиям гипоксии. То есть р53 способствует ингибиции неоангиогенеза. Таким образом, клетки с активированным р53 хуже переносят недостаток кислорода, перестают секретировать VEGF и начинают секретировать ингибиторы ангиогенеза, что препятствует образованию новых сосудов (Тюляндин С.А., 2000). В литературе отсутствуют данные об ассоциации данного полиморфизма с риском развития метастазов. Распределение частот генотипов гена р53 у больных раком легкого в зависимости от лимфогенного или гематогенного метастазирования представлено в таблице 16.
Сочетание полиморфных генотипов (3 интрона-4 экзона-6 интрона) генар53 у больных раком легкого
На основании анализа полученных нами данных было показано, что из различных сочетаний генотипов трех локусов наиболее распространенными комбинациями у больных РЛ являются: w/w-Arg/Arg-w/w (наличие гомозиготного генотипа по мажорному аллелю по всем исследуемым сайтам), w/w-Arg/Pro-w/w (наличие гетерозиготного генотипа по 4 экзону ) и w/dupl6-Arg/Pro-w/m (наличие гетерозиготного генотипа по всем исследуемым сайтам), данные представлены в таблице 23.
Таким образом, в дальнейшем мы изучили распределение наиболее часто встречающихся комбинаций генотипов (3 интрон-4 экзон-6 интрон) гена р53 у больных РЛ в зависимости от гистологического строения опухоли, данные представлены в таблице 24.
Сочетание мажорных генотипов гена р53 (w/w-Arg/Arg-w/w) является наиболее частой комбинацией в группах больных и здоровых. Выявлено статистически значимое превышение частоты данной комбинации у больных РЛ по сравнению с контролем (49% и 38%) соответственно, Х2=5,11, р 0,02; OR=l,61, С195%=1,04-2,49). Преобладание данной комбинации генотипов характерно для больных НМРЛ по сравнению с показателями группы контроля, 51% против 38% (Х2=5,81, р 0,015; OR=l,72, СГ95%=1,08-2,76). Полученные данные свидетельствуют об ассоциации данной комбинации генотипов с НМРЛ.
Частота распределения комбинации диких генотипов по 6 и 3 интрону с гетерозиготой по 4 экзону (w/w-Arg/Pro-w/w) не различалась значимо в группах наблюдения, и составила 29% для группы контроля, 22% для группы больных НМРЛ и 22% для группы больных МРЛ. Это подтверждает предположение о том, что определенные сочетания гомо- и гетерозигот могут играть решающую роль в функциональной активности белка, в данном случае гомозиготы по 3 и по 6 интрону нивелирует функциональную неполноценность гетерозиготы по 4 экзону.
Изучение вариантных комбинаций гена р53 выявило статистически значимое повышение частоты комбинации (w/dupl6- Arg/Pro-w/m) в общей группе больных РЛ по сравнению с контролем (4% и 13%, соответственно, Х2=8,87, р 0,002; OR=3,58, С195%=1,47-8,98). При этом выявлено преобладание данной комбинации генотипов в группах больных РЛ обеих гистологических форм опухоли по сравнению с показателями группы контроля, частота данной комбинации в группе больных НМРЛ составила 13%, (Х2=7Д2, р 0,007; OR=3,39, С195% -1,33-8,86) и в группе больных МРЛ 16% (р 0,02; OR=4,35, СГ95% =1,14-16,18).
Полученные данные по изучению генотипических комбинаций свидетельствуют об ассоциации w/w-Arg/Arg-w/w и w/dupl6- Arg/Pro-w/m комбинаций генотипов с риском развития НМРЛ. Данные о ассоциации комбинации герозиготных генотипов по 3, 6 интрону и 4 экзону с МРЛ можно расценивать как предварительные в связи с малочисленной выборкой больных.
В дальнейшем мы сочли целесообразным оценить вклад комбинаций гена р53 в риск развития НМРЛ в зависимости от таких факторов, как возраст и курение. Распределение комбинаций генотипов (3 интрон-4 экзон-6 интрон) гена р53 у больных НМРЛ легкого в зависимости от возраста представлено в таблице 25. При разделении группы больных НМРЛ по возрасту частота комбинации мажорных генотипов в группе больных пожилого возраста составила 62%, что статистически значимо выше, чем в группе больных зрелого возраста (Х2=8,00, р 0,00) и здоровых (38%, Х2=12,96, р 0,000; OR-2,71, С195%=1,51-4,88).
Частота распределения комбинации диких генотипов по 6 и 3 интрону и гетерозиготой по 4 экзону (w/w-Arg/Pro-w/w) не различалась значимо в группах наблюдения, и составила 29% для группы контроля, 23% для группы больных РЛ зрелого возраста и 20% пожилого возраста.
У больных зрелого возраста частота w/dupl6-Arg/Pro-w/m комбинации генотипов статистически значимо выше уровня группы контроля (18% и 4%, Х2=11,27, р 0,000; OR=5,17, С195%=1,81-15,01), а так же выявлена тенденция к увеличению частоты данной комбинации по сравнению с группой больных НМРЛ пожилого возраста (р=0,08).
Таким образом, для лиц зрелого возраста сочетание w/dupl6- Arg/Pro-w/m генотипов гена р53 ассоциировано с риском возникновения НМРЛ. В то время как для лиц пожилого возраста рисковую значимость по этому заболеванию имеет комбинация мажорных генотипов гена р53.
Дальнейший анализ полученных данных выявил ассоциацию комбинации мажорных генотипов с риском развития НМРЛ независимо от фактора курения. Распределение комбинаций генотипов (3 интрон-4 экзон-6 интрон) гена р53 у больных НМРЛ в зависимости от причастности к курению представлено в таблице 26. Частота встречаемости w/w-Arg/Arg-w/w комбинации генотипов по мажорным аллелям в группах больных НМРЛ как курящих (49%, р 0,08) так и некурящих (61%, Х2=3,76, р 0,05; OR=2,59; С195%=0,88-7,79) превышала значение группы контроля (38%). В тоже время нами было обнаружено статистически значимое преобладание встречаемости w/dupl6-Arg/Pro-w/m комбинации генотипов в группе курящих больных НМРЛ по сравнению с группой контроля (16% и 4%, соответственно, Х2=12,8; р 0,000; OR=4,70, С195%= 1,75-12,87).
Носительство комбинации гетерозигот по минорному аллелю ассоциировано с риском НМРЛ при наличии фактора курения. При этом в группе некурящих больных НМРЛ комбинация гетерозигот отсутствует.
Далее мы оценили роль курения в риске НМРЛ для лиц зрелого и пожилого возраста, данные представлены в таблице 27. Частота комбинации w/dupl6-Arg/Pro-w/m в группе курящих больных НМРЛ зрелого возраста составила 21%, что статистически значимо выше 4% группы контроля (Х2=13,93, р 0,000; OR=6,35, СГ95%=2,13-19,15), при этом среди некурящих носителей такого генотипа не встречалось. То есть можно говорить об ассоциации комбинации гетерозигот с НМРЛ для курящих больных НМРЛ зрелого возраста.
Частота w/w-Arg/Arg-w/w комбинации в группе курящих больных НМРЛ пожилого возраста составила 68%, что статистически значимо выше 38% группы контроля (Х2=11,32, р 0,000; OR=3,43, С195%=1,54-7,76). Частота этой комбинации выше и в группе некурящих, однако, статистическая значимость не достигается в связи с малым числом наблюдений. В тоже время не выявлено различий в частоте комбинации мажорных генотипов между курящими и некурящими больными НМРЛ пожилого возраста, что указывает на незначительную роль фактора курения. А также нами установлена на уровне тенденции рисковая значимость данной комбинации для некурящих больных НМРЛ зрелого возраста (р=0,075), однако, ввиду малой выборки эти данные могут быть рассмотрены лишь как предварительные.
Таким образом, мы показали, что носительство комбинации мажорных генотипов по исследованным полиморфизмам гена р53 повышает риск формирования РЛ у лиц пожилого возраста, при этом фактор курения не оказывает существенного влияния. Комбинация гетерозигот ассоциированна с риском развития НМРЛ для курящих лиц зрелого возраста. В действительности, в литературе представлено достаточно много фактов для того, чтобы объяснить выявленные нами закономерности, что и будет рассмотрено далее. Необходимо сказать, что, на наш взгляд, рисковая значимость комбинации гомозигот по мажорным аллелям определена наличием гомозиготы по аргинину (Jain et al., 2005). По данным Siddique et al. (2005), азиаты чаще экспрессируют р53 белок, несущий пролиновый аллель, европейцы аргининовый, что свидетельствует об этнических особенностях данного полиморфизма. Однако им установлено, что 75% больных РМЖ, проживающих в Китае, экспрессируют р53, несущий аргининовый аллель в 72 кодоне, который содержит соматические мутации, что свидетельствует о том, что роль полиморфизма генов в формировании патологии имеет свои особенности, отличные от этнических. В тоже время аргининовый аллель 4 экзона имел рисковую значимость только при рассмотрении его частоты встречаемости в зависимости от возраста. Таким образом, описанные выше вариации в функционировании белка р53, связанные с носительством w/w-Arg/Arg-w/w комбинации гена р53, могут повышать риск формирования НМРЛ в пожилом возрасте. В действительности, с возрастом риск ЗНО многократно возрастает по причине не только длительной экспозиции организма к канцерогенным воздействиям внешней среды, снижения противоопухолевой резистентности организма, но и в связи с накоплением мутаций и хромосомных аберраций в генах онкосупрессорах, что может быть обусловлено носительством Arg/Arg генотипа в комбинации гомозигот по мажорным аллелям, при этом решающим фактором может служить замедление с возрастом скорости репарации ДНК (Свердлов Е.ДД999). По данным Jain et al. (2005), носительство аргининового аллеля ассоциируется с IV стадией рака легкого (ТлюбоеКлюбоеМі), что свидетельствует о вовлечении данного полиморфизма в прогрессию заболевания.
