Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак легкого (РЛ) занимает лидирующие позиции в структуре онкологической заболеваемости мужчин, которые болеют почти в 7 раз чаще, чем женщины. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака легкого, в России ежегодно от этого заболевания погибает свыше 60000 человек (Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000, Имянитов Е.Н., 2006). Ведущими факторами риска формирования РЛ являются избыточная экспозиция к повреждающим факторам внешней среды и нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома. Общим атрибутом и пусковым моментом канцерогенеза является дисбаланс процессов пролиферации, дифференцировки клеток, апоптоза и репарации, детерминированный не только генетическими (наличие мутаций в генетическом материале) и эпигенетическими нарушениями, изменяющими функции онкогенов и генов-супрессоров, но и вариабельностью функционирования патогенетически значимых генов, обусловленной генетическим полиморфизмом (Malik, Brown, 2000; Singletary, 2003; Yokota, Kohno, 2004; Hunter, Crawford, 2006).
Особое место в картине нарушений при злокачественных новообразованиях (ЗНО) различных локализаций, в том числе и при РЛ, занимают повреждения гена онкосупрессора p53, локализованного на 17 хромосоме. р53 регулирует экспрессию генов клеточного цикла и апоптоза, инициирует репарацию поврежденной ДНК, тем самым контролируя геномную стабильность клетки (Копнин Б.П., 2000; Fan et al., 2000; Rom et al., 2000). Для гена р53 установлено 19 полиморфизмов, при этом полиморфизмы 3, 6 интронов и 4 экзона считаются вовлеченными в канцерогенез (Wu et al., 2002; Avigad et al., 1997; van Heemst, 2005). Наиболее широко изучен полиморфизм в кодирующем участке гена р53 (4 экзон, Arg72Pro полиморфизм), есть сведения о его ассоциации со злокачественными новообразованиями различных локализаций (Sjalander et al., 1996; Biros et al., 2001; Wu et al., 1995; Jain et al., 2005). Исследования роли полиморфизма интронов гена р53 в риске РЛ немногочисленны. Интронные полиморфизмы, благодаря своему участию в регуляции сплайсинга мРНК, экспрессии генов и ДНК-белковых взаимодействий, при определенных условиях также могут оказывать влияние на функциональную активность белков. Полиморфизм 6 интрона гена р53, представленный заменой гуанина на аденин в сайте рестрикции MspI эндонуклеазы, влияет на уровень экспрессии белка р53 (Barel et al., 1994). Дупликация 16 п.н. в 3 интроне может приводить к ингибиции перехода р53 из стрессовой конформации в латентную, в которой р53 стимулирует репарацию ДНК (Liang, 2005).
Высокая частота индивидуальных полиморфизмов в низкопенетрантных генах может обеспечивать достаточно солидный вклад этих генов в комбинации с экспозицией к патогенетически значимым внешним факторам в популяционный атрибутивный риск (Jong et al., 2002; Пальцев М.А. и др., 2004; Newman et al., 2005). При этом анализ генетических эффектов комбинаций функционально связанных полиморфизмов может существенно повысить эффективность исследований, поскольку затрагивает сразу несколько сигнальных путей, вовлекаемых в патогенез рака (Onay et al., 2006; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2003). В работе Wu et al. (2002) выявлена ассоциация комбинаций, содержащих минорные аллели генотипов гена р53 по 3 локусам (3 и 6 интрон, 4 экзон) с РЛ для лиц европеоидной расы, которую авторы связывают со снижением апоптотической и репарационной активности в клетках с такими генотипами. Аналогичные данные получены для РМЖ и других локализаций ЗНО (Sjlander et al., 1996; Mitra et al., 2006; Schabath et al., 2006; Onay et al., 2006). Изменения в генах, модулирующих активность р53, также могут быть сопряжены с нарушением его функции. Так, в наследственных высоко агрессивных формах РМЖ при нарушении в генах репарации BRCA1 и BRCА2 часто встречаются мутации р53. Функциональная неполноценность р53 отмечена в случае изменений в генах ATM, PTEN и CHEK2, которые вовлекаются в регуляцию активации р53 (Lacroix, Leclercg, 2005) .
Manes et al. в 2003 году было показано, что для осуществления эффективного апоптоза модифицированных клеток необходимо согласованное взаимодействие онкосупрессора р53 с белком-рецептором хемокинов CCR5. Авторы выявили, что носительство вариантного аллеля ССR5del32 ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы у пациенток при отсутствии соматических мутаций в гене p53 в клетках опухоли, что объясняется нарушением передачи апоптоз-индуцирующего сигнала трансформированным клеткам. CCR5 является одним из важных поливалентных хемокиновых рецепторов, определяющих инфильтрацию иммуноцитов в очаги воспаления и опухоль, и тесно связан с развитием Тh1 клеточно-опосредованного иммунного ответа, а также вовлечен в регуляцию подвижности и пролиферации опухолевых клеток (Azenstein et al., 1999; Mira et al., 2001; Luboshits et al., 2002). Мы не встретили в доступной нам литературе сведений об исследовании связи сочетаний полиморфизмов генов р53 и ССR5 с РЛ.
Белок р53 инициирует сборку комплекса эксцизионной репарации ДНК посредством активации транскрипции гена XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group 1) (Marintchev et al., 2003). XRCC1 является связующим белком, который формирует комплекс эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER) путем индивидуального взаимодействия с каждым компонентом, соединяя ДНК-полимеразу , ДНК-лигазу IIIa и ПАРП на поврежденном сайте ДНК (Caldecott et al., 1994). Arg399Gln полиморфизм 10 экзона гена XRCC1 затрагивает его центральный домен, необходимый для активации BER. Есть указания, что данный полиморфизм связан с повышенным риском возникновения рака молочной железы (Duell et al., 2001), рака поджелудочной железы (Duell et al., 2006), рака легкого (Park et al., 2002; Casse et al., 2003; Залесский В.Н. и соавт., 2005). Можно полагать, что полиморфизм обоих генов вносит сочетанный вклад в нарушение процессов репарации ДНК, однако таких данных в литературе не найдено.
Комплексное изучение полиморфизмов р53 и взаимосвязанных с ним генов может выявить биологические взаимодействия их полиморфных вариантов, вносящие существенный вклад в раннее возникновение злокачественных опухолей в условиях экспозиции к экзогенным и эндогенным генотоксическим факторам.
В настоящее время полемизируется вопрос об антагонистическом плейотропизме эффектов генов, которые осуществляют защиту от злокачественной трансформации. Накоплены доказательства, что гены опухолевых супрессоров, защищая организм от рака в раннем периоде онтогенеза, могут промотировать фенотип старения, включая поздний рак (Campisi et al., 2005). Сведения о взаимосвязи полиморфизма данных генов с формированием РЛ в зависимости от возраста немногочисленны и неоднозначны (Szymanowska et al., 2006; Taioli, Bonassi, 2004). Отсутствуют данные о вкладе комбинаций вариантных генотипов гена р53 по интронным и экзонным полиморфизмам в сочетании с генотипами других функционально связанных с ним генов, в частности, CCR5 и XRCC1, в риск РЛ. Все сказанное определяет актуальность изучения сочетанного вклада полиморфизма генов р53, CCR5 и XRCC1 в риск возникновения и прогрессию РЛ в европеоидной популяции Сибири с учетом основных патогенетически значимых факторов риска.
Цель исследования: Изучить ассоциации аллельных вариантов гена-онкосупрессора p53, гена хемокинового рецептора CCR5, гена репарации ДНК XRCC1 с раком легкого и с клинико-морфологическими особенностями течения заболевания.
Задачи исследования:
-
Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов р53, CCR5, XRCC1 с различными гистологическими формами РЛ.
-
Оценить взаимосвязь интронного (3 и 6 интрон) и экзонного (4 экзон) полиморфизмов гена р53 и различных их комбинаций с РЛ в зависимости от возраста и курения.
-
Оценить распределение сочетаний генотипов гена хемокинового рецептора CCR5 с комбинацией генотипов гена р53 (3 интрон-4 экзон-6 интрон) у больных РЛ.
-
Оценить частоту встречаемости аллельных вариантов гена репарации ДНК XRCC1 в сочетании с комбинацией генотипов (3 интрон-4 экзон-6 интрон) гена р53 у больных РЛ
-
Провести анализ ассоциаций исследуемых полиморфизмов генов р53, CCR5, XRCC1 с клинико-морфологическими особенностями злокачественного процесса.
Научная новизна. Впервые в России изучена ассоциация комбинаций вариабельных генотипов взаимосвязанных генов р53, CCR5, XRCC1 с раком легкого.
Получены новые данные о взаимосвязи комбинаций генотипов гена р53 (3 интрон-4 экзон-6 интрон) с НМРЛ в зависимости от возраста. Показано, что риск НМРЛ повышается при носительстве w/dup16-Arg/Pro-w/m комбинации гена р53 для лиц зрелого возраста, w/w-Arg/Arg-w/w комбинации гена р53 - для лиц пожилого возраста, при этом модифицирующее влияние фактора курения установлено только для индивидуумов зрелого возраста.
Не выявлено ассоциации минорных аллелей генов гена хемокинового рецептора CCR5 и гена репарации XRCC1 с риском формирования НМРЛ.
Показано, что вариантные генотипы гена рецептора хемокинов CCR5 не модифицируют выявленную взаимосвязь комбинации гетерозиготных генотипов гена 53 w/dup16-Arg/Pro-w/m с НМРЛ для лиц зрелого возраста. Показан сочетанный вклад гетерозиготных генотипов генов р53 и XRCC1 w/dup16-Arg/Pro-w/m(Arg/Gln) в риск формирования НМРЛ для лиц зрелого возраста. Мажорный генотип Arg/Arg гена XRCC1 нивелирует рисковую значимость комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 для лиц зрелого возраста.
Комбинация гетерозиготных генотипов w/dup16-Arg/Pro-w/m гена р53 ассоциирована с более высокими показателями общей выживаемости больных НМРЛ, чем комбинация гомозиготных генотипов по мажорных аллелям гена р53.
Установлена ассоциация w/del32 генотипа гена CCR5 на уровне тенденции и комбинации гетерозигот w/dup16-Arg/Pro-w/m гена р53 с мелкоклеточной формой РЛ.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные ассоциации комбинаций мажорных генотипов и гетерозиготных генотипов гена р53 с НМРЛ для лиц пожилого возраста (60-74 лет) и зрелого возраста (40-59 лет), соответственно, указывают на различие механизмов вовлечения р53 в формирование НМРЛ в разные периоды онтогенеза человека.
Установленная ассоциация w/dup16-Arg/Pro-w/m комбинации гена р53 и ее сочетания с гетерозиготным генотипом гена репарации XRCC1 с НМРЛ для курящих лиц зрелого возраста свидетельствует о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев формирования групп повышенного риска НМРЛ.
Данные о связи комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 w/dup16-Arg/Pro-w/m с более высокими показателями общей выживаемости больных НМРЛ указывают на возможность использования этих параметров в качестве дополнительных критериев прогноза. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости изучения полиморфизма гена р53 по указанным локусам на более представительной выборке, для обоснования возможности генотипирования р53 в качестве дополнительного прогностического критерия НМРЛ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В условиях патогенетически значимых экзогенных влияний (курение) сочетанное носительство функционально измененных генотипов, содержащих минорные аллели по интронным и экзонному полиморфизмам гена р53 и G399A полиморфизму гена репарации XRCC1, способствует формированию немелкоклеточной формы РЛ у лиц зрелого возраста.
-
Носительство комбинации функционально полноценных генотипов w/w-Arg/Arg-w/w (мажорные аллели) по интронным и экзонному полиморфизмам гена р53 повышает риск возникновения НМРЛ в пожилом возрасте.
-
Комбинация гетерозиготных генотипов гена р53 по 3, 6 интрону и 4 экзону w/dup16-Arg/Pro-w/m ассоциирована с более высокими показателями общей выживаемости больных НМРЛ, чем комбинация гомозиготных генотипов w/w-Arg/Arg-w/w.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири, г.Красноярск (2005); научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Иммунология на рубеже веков: к 75-летию со дня рождения академика РАМН Н.В. Васильева», г. Томск (2005); четвертой Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине г. Новосибирск (2006); 16 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Мюнхен (2006); региональной конференции молодых ученых имени академика РАМН Н.В. Васильева, г. Томск (2007); 12 ежегодном конгрессе Международного сообщества по изучению рака легкого, г. Сеул (2007).
