Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Ген р53 и его связь с развитием опухолей 9
1.1.1. р53: история изучения 9
1.1.2. Молекулярная организация гена и белка р53 10
1.1.3. Мутации гена р53 при канцерогенезе и в опухолях 14
1.1.4. Функции белка р53 и последствия их нарушения при канцерогенезе 18
1.2. Характеристика «гуманизированной» линии генетически модифицированных мышей Hupki, содержащих экзоны (с 4-го по 9-й) гена 53 человека 23
1.3. Аристолохиевая кислота - генотоксическии и канцерогенный эффект 26
1.4. Заключение 30
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Получение гомозиготной HupkiPro/Pro и гетерозиготной HupkiArg/Pro линий мышей 32
2.2. Генотипирование мышей Hupki 34
2.2.1. Получение геномной ДНК 34
2.2.2. Генотипирование мышей Hupki и мышей дикого типа 129Sv посредством ПЦР с двумя наборами праймеров 34
2.2.3. Генотипирование и определение полиморфизма 72-го кодона аллелей гена р53 мышей Hupki с помощью рестрикционных энзимов 36
2.2.4. Генотипирование мышей Hupki по аллелям гена р53 человека с помощью ПЦР и секвенирования 38
2.3. Получение первичных фибробластов эмбрионов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro, а также иммортализованных клеточных линий 39
2.4. Инкубация первичных культур фибробластов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro с аристолохиевой кислотой 40
2.5. Схема эксперимента 42
2.6. Определение аддуктов ДНК 43
2.7. Анализ мутаций гена р53 45
2.8. Определение делеции экзонов гена р19- ARF в иммортализованных клеточных линиях мышей Hupki 46
2.9. Определение присутствия белков р53 и р19-ARF в фибробластах гуманизированных мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro 47
2.9.1. Электрофорез белков 47
2.9.2. Иммуноблоттинг 48
2.10. Статистический анализ 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Характеристика полученных линий мышей Hupki, эмбрионов мышей и первичных культур эмбриональных фибробластов 49
3.2. Рост эмбриональных фибробластов мышей Hupki в культуре и влияние на него аристолохиевой кислоты 52
3.3. Характеристика аддуктов ДНК, образующихся после инкубации первичных культур эмбриональных фибробластов с аристолохиевой кислотой 56
3.4. Характеристика спонтанных мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9) в контрольных клеточных линиях мышей Hupki 58
3.5. Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в мбриональных фибробластах мышей HupkiArg/Pro " 62
3.6. Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в эмбриональных фибробластах мышей HupkiPro/Pro 66
3.7. Сравнение мутагенного эффекта аристолохиевой кислоты в гомозиготных и гетерозиготных фибробластах мышей Hupki ' 71
3.8. Делеции гена p19-ARF в контрольных и экспериментальных клеточных линиях эмбриональных фибробластов мышей Hupki 72
3.9. Исследование присутствия белков р53 и p19-ARF в полученных клеточных линиях фибробластов мышей Hupki 75
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 81
Выводы 90
Список литературы 92
- Функции белка р53 и последствия их нарушения при канцерогенезе
- Инкубация первичных культур фибробластов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro с аристолохиевой кислотой
- Характеристика полученных линий мышей Hupki, эмбрионов мышей и первичных культур эмбриональных фибробластов
- Делеции гена p19-ARF в контрольных и экспериментальных клеточных линиях эмбриональных фибробластов мышей Hupki
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вот уже более 25 лет ген р53 и кодируемый им ядерный белок р53 являются предметом исследования многих лабораторий во всем мире. Белок р53 играет важную роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза (Сейц И.Ф., Князев П.Г., 1986; Анисимов В.Н., 1997, Чумаков П.М., 2000; Копнин Б.П., 2000). Ген р53 представляет собой одну из основных мишеней действия канцерогенов окружающей среды. Изучение эффекта канцерогенов на структуру гена и соответствующего белка важно как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для оценки индивидуального канцерогенного риска при молекулярно-эпидемиологических исследованиях и разработки соответствующих профилактических мероприятий (Напалков Н.П., 1989; Забежинский М.А. и др., 2004).
Исследования гена р53 на лабораторных животных in vivo и in vitro не раскрывают полностью роль р53 и его белка в развитии заболеваний человека, включая рак, поскольку известно, что даже незначительные различия в их первичной последовательности нуклеотидов генов и, соответственно, белков приводят к существенным расхождениям на функциональном уровне (Bargmann C.I., et al., 1986). В этой связи актуальной задачей является создание моделей трансгенных животных (например, мышей) с гуманизированными формами белков.
Возможности генной инженерии позволили получить линию гуманизированных мышей Hupki (Human-p53-knock-in), в геном которой был встроен участок гена р53 человека, представленный центральным доменом (экзоны 5-8), а также рядом расположенными экзонами 4 и 9 (Luo J.-L, et al., 2001). Этот участок вызывает особый интерес исследователей в связи с тем, что наибольшее количество мутаций (более 80%), обнаруженных в гене р53 опухолей человека, сосредоточено именно в указанном домене (Hollstein М., etal., 1991; Levine A.J., et al., 1991; Harris C.C., and Hollstein M., 1993). Более того, в 4-м экзоне выявлен уникальный полиморфизм 72-го кодона, который определяет, вследствие нуклеотидной замены гуанина на цитозин, наличие аминокислоты аргинина или пролина в молекуле белка (Murphy М.Е., 2006). Взгляды ученых на данный полиморфизм не однозначны и сводятся к следующему предположению: если 72-м кодоном кодируется аргинин, это может способствовать ускорению развития апоптоза в клетке, а наличие пролина будет сопровождаться задержкой клеточного цикла (Pirn D., and Banks L, 2004; Murphy M.E., 2006). Для изучения этой проблемы необходимо получение соответствующих линий гуманизированных мышей Hupki.
В лаборатории Немецкого Центра Раковых Исследований (DKFZ, Heidelberg) была получена линия гомозиготных мышей Нирк'Л97^ (Luo J.-L., et al., 2001). Актуальной задачей остаётся получение гомозиготных линий HupkiPra/Pro и гетерозиготных HupkiAr9yPro.
позволит изучать механизмы влияния канцерогенов окружающей среды на ген р53 и исследовать последующую цепь событий, ведущих к развитию рака у человека.
Одним из недавно выявленных канцерогенов для человека является аристолохиевая кислота (АК), содержащаяся в травянистом растении Аристолохии (или Кирказоне) и вызывающая опухоли у лабораторных грызунов (Mengs U., ег а/., 1982). У людей, лечившихся китайскими травами, содержащими АК, возникали карциномы из уротелия (Notrier J., et а/., 2000), в связи с чем подобные медицинские средства, содержащие АК, отнесены экспертами Международного агентства по изучению рака (МАИР) к группе 1 -безусловно доказанных канцерогенов для человека (IARC Monographs, 2002). Следует отметить, что АК, её аддукты ДНК и вызванные АК мутации р53, в том числе, трансверсии А:Т —> Т:А обнаруживали у лиц с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия, наблюдаемыми на территории Балканского полуострова и, предположительно, вызванными употреблением в пищу аристолохии, произрастающей в виде сорняка среди злаков (Grollman А.Р., et а/., 2007). На мышах HupkiArg/Arg уже были проведены исследования мутагенеза при действии АК (Feldmeyer N., et а/., 2006), однако, актуальным является продолжение этих работ с изучением мутагенного эффекта АК в клетках мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro.
При изучении мутагенеза гена р53 целесообразно параллельно проанализировать изменения гена p19-ARF, который связан с р53 и Mdm2 сигнальным путем и является маркером функциональной активности р53, в случаях мутаций р53 (Haupt Y., et а/, 1997; Kubbutat М.Н., et а/., 1997). Известно, что канцерогены могут вызывать делеции p19-ARF (Shapless N.E., and de Pinho R.A., 2005). Поскольку генные мутации ведут к изменению свойств белков - актуально также изучение белков р53 и p19-ARF при действии канцерогенов, включая АК.
Изучению описанных выше проблем и посвящена настоящая работа.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационной работы являлось изучение мутагенеза химерного гена р53 гуманизированных мышей Hupki, индуцированного канцерогеном окружающей среды аристолохиевой кислотой, и оценка влияния полиморфизма 72-го кодона на частоту возникновения и спектр мутаций р53. Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
1) создать гомозиготную HupkiPro/Pro и гетерозиготную HupkiArg/Pro линии мышей, различающиеся по полиморфизму 72-го кодона;
получить первичные культуры фибробластов (ПКФ) эмбрионов мышей Hupki и HupkiArg/Pr и на их основе - иммортализованные клеточные линии (КЛ), пригодные для изучения мутагенеза химерного гена р53;
после воздействия АК на ПКФ, исследовать образование специфических аддуктов ДНК;
в контрольных КЛ (ККЛ) и экспериментальных КЛ (ЭКЛ), полученных из ПКФ, обработанных АК, провести сравнительный анализ мутаций химерного гена р53 с 4-го по 9-й экзон включительно;
оценить влияние полиморфизма 72-го кодона химерного гена р53 на частоту и спектр мутаций в ЭКЛ и ККЛ;
установить наличие или отсутствие делеций гена p19-ARF в ЭКЛ и ККЛ;
исследовать присутствие белков р53 и p19-ARF в ККЛ и ЭКЛ мышей Hupki.
Научная новизна работы
В ходе выполнения диссертационного исследования впервые были созданы гомозиготная (HupkiPro/Pro) и гетерозиготная (HupkiArg/Pro) линии мышей по аллелям химерного гена р53. Получены первичные культуры фибробластов эмбрионов мышей Hupki и иммортализованные клеточные линии, пригодные для изучения мутагенеза при действии канцерогенов, в частности, аристолохиевои кислоты. В этих экспериментах установлено, что АК индуцирует мутации, близкие по спектру (трансверсии А:Т —> Т:А) к ранее обнаруженные у людей с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия.
Практическая значимость полученных результатов
Создана гуманизированная по гену р53 модель мышей Hupki, пригодная для выявления особенностей мутагенеза при действии канцерогенов окружающей среды и использования полученных результатов в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, связанных с выявлением групп повышенного онкологического риска. Модель гуманизированных мышей Hupki позволяет проводить тестирование различных факторов на мутагенную и канцерогенную активность, результаты которого с большей степенью надежности можно будет экстраполировать на человека.
Положения, выносимые на защиту
Впервые получены гомозиготная HupkiPro/Pro и гетерозиготная HupkiAr9/Pro линии мышей, первичные культуры эмбриональных фибробластов Hupki двух разных генотипов и иммортализованные клеточные линии.
При воздействии аристолохиевои кислоты на культуры эмбриональных фибробластов, в их геноме были обнаружены специфические ДНК-аддукты, соответствующие выявленным ранее у людей, употреблявших АК. Количество аддуктов ДНК возрастало с увеличением времени инкубации культур с АК.
После инкубации культур клеток Hupki с АК, в клеточных линиях были выявлены мутации гена р53, в значительной степени соответствующие типам мутаций, обнаруженных у больных «балканской» нефропатией и опухолями из уротелия, связанными со случайным употреблением в пищу АК. Частота мутаций возрастала с увеличением времени экспозиции к АК.
Полиморфизм 72-го кодона гена р53 не оказывал существенного влияния на мутагенный эффект АК.
Функции белка р53 и последствия их нарушения при канцерогенезе
Молекулы белка р53 могут принимать несколько конформационных состояний, в которых они обладают разными биохимическими свойствами и выполняют, соответственно, отличные физиологические функции. В обычных условиях р53 находится в так называемой латентной форме, в которой он обладает слабой транскрипционной активностью. Такой р53, однако, связывает белки репарационной системы, стимулирует рекомбинацию и репарацию ДНК. При различных стрессах и внутриклеточных повреждениях происходят пост-трансляционные модификации, в частности фосфорилирование, дефосфорилирование, ацетилирование и гликозирование определённых аминокислот молекулы р53, а также образование ковалентных и нековалентных комплексов с другими белками, определяющие её переход в так называемую стрессовую (активную) конформацию (Prives С, and Hall P.А., 1999; Woods D.B., and Vousden K.H., 2001; Lavin M.F., and Gueven N., 2006). Такой p53 значительно более стабилен (что приводит к резкому увеличению его количества в клетке) и эффективно трансактивирует и/или трансрепрессирует специфические гены-мишени, следствием чего является индукция в аномальных клетках либо остановки клеточного цикла в одной из его "сверочных точек" (для устранения повреждения), либо апоптоза. Выбор между этими возможностями отчасти зависит от типа клеток и характера стресс-сигнала. Например, если тимоциты в результате повреждения ДНК гибнут от быстрого апоптоза (Clarke A.R., et а/., 1993, Lowe S.W., et а/., 1993), то фибробласты оказываются необратимо "арестованными" (Kastan М.В., et а/., 1991).
Стрессовые воздействия также приводят к модификациям в С-концевой части молекулы р53, сопровождающимся общим усилением функциональной активности. В результате ацетилирования определённых аминокислотных остатков на С-концевой части происходит изменение конформации молекулы р53, способствующее трансактивации генов-мишеней. При повреждениях ДНК и экспрессии онкогена RAS эти события инициируются связыванием освобождающегося от mdm2 N-концевого участка р53 с основным фактором транскрипции рЗОО/СВР, ацетилирующим сначала ингибиторный домен р53 по лизинам 373 и 382, а затем (после связывания с респонсивными элементами) - и белки хроматина в области генов-мишеней (Cheah P.L, and Looi L.M., 2001). Таким образом, последовательные пост-трансляционные модификации концевых участков р53 вызывают увеличение количества белка р53 в клетке и приобретение ими способности связывать р53 регулируемые элементы, привлекая к генам-мишеням определенные факторы транскрипции. Это сопровождается стимуляцией транскрипции их мРНК (Копнин Б.П., 2000). Активация р53 преимущественно регулируется на пост-трансляционном уровне. В ответ на стресс происходит стабилизация белка р53, что, в частности, происходит за счет фосфорилирования р53 несколькими клеточными протеинкиназами (Ко L.J., and Prives С, 1996, Morgan S.E., and Kastan M.B., 1997, Woo R.A., et al., 1998; Lavin M.F., and Gueven N., 2006).
Индукция p53 в ответ на стимуляцию доминантными онкогенами происходит по иному механизму, включающему взаимодействие р53 с рядом регуляторных белков. Например, экспрессия в первичных фибробластах активированного RAS, MYC и Е1А приводит к выключению р53 и необратимой остановке клеточной пролиферации, напоминающей преждевременное старение (Serrano М., et а/., 1997, Lin A.W., et al., 1998; Lowe S.W., 1999).
Стабилизация p53 ведёт к его накоплению в ядре, где он связывается со специфическими последовательностями ДНК, регулируя транскрипцию (усиливая или ослабевая) ряда р53-зависимых генов. Активность этих генов объясняет, по крайней мере частично, клеточный ответ на стресс. Например, р53-зависимая индукция ингибитора циклинзависимых киназ p21/Waf-1 ведёт к остановке клеточного цикла в G1 (El-Deiry W.S., et al., 1993). Другой р53-регулируемый ген ВАХ принимает участие в инициации р53-зависимого апоптоза (Miyashita Т., and Reed J.С, 1995).
Ключевую роль в стабилизации белка р53 и повышении его транскрипционной активности играют изменения взаимодействия р53 с белком-ингибитором mdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Белок mdm2 связывается с N-концом молекулы р53 и, обладая активностями ЕЗ убиквитин-лигазы, стимулирует протеосомную деградацию р53 (Piette J., et al., 1997; Freedman D.A., et al., 1999; Guimaraes D.P., and Hainaut P., 2002). Поэтому в норме уровень экспрессии белка р53 очень невелик, а время его жизни составляет около 30 минут. Кроме того, связываясь с p19-ARF в районе домена, взаимодействующего с основными факторами транскрипции, mdm2 подавляет способность р53 трансактивировать гены-мишени. В то же самое время, ген MDM2 сам является транскрипционной мишенью активированного р53. В результате устанавливается регуляторная петля: активированный р53 запускает синтез mdm2, а затем уже mdm2, соединяясь с р53, стимулирует его экспорт из ядра и протеосомное разрушение (Haupt Y., et al, 1997, Kubbutat M.H., et al., 1997).
При внутриклеточных нарушениях, в частности, повреждениях ДНК, происходит фосфорилирование аминокислотных остатков (Ser15, Ser20, Ser33) р53, расположенных в районе связывания с белком mdm2 (Lavin M.F., and Gueven N., 2006). Такое фосфорилирование осуществляют специфические киназы (ATM, ATR, и их мишени -«чекпойнткиназы» СНК1, СНК2), которые активируются в ответ на разнообразные нарушения структуры ДНК (Ashcroft М., and Vousden К.Н., 1999; Woods D.B., and Vousden K.H., 2001). Кроме того, ATM фосфорилирует и белок mdm2. В результате блокируется Следующая группа р53-регулируемых генов кодирует белки, индуцирующие апоптоз. При этом р53 контролирует синтез компонентов основных путей индукции апоптоза: митохондриального и стимулируемого "рецепторами смерти". Так, он регулирует работу белков семейства Вс12, репрессируя ген антиапоптотического белка Вс12 и активируя гены про-апоптотических белков Вах, Puma и Noxa (Schuler М., and Green D.R., 2001; Tobiume К., 2005).
Третьей большой группой генов-мишеней р53 являются гены, продукты которых регулируют морфологию и/или миграцию клеток. Так, р53 регулирует транскрипцию генов обоих представителей семейства «рассеивающих» (Scatter) ростовых факторов гепатоцитов - HGF/SF и HGF1/MSP, а также ген одного из членов семейства эпидермальных факторов роста HB-EGF (гепарин-связывающий EGF). Продукты всех указанных генов являются одновременно как митогенами, так и мотогенами. При этом, р53 трансактивирует также и гены рецепторов указанных факторов роста - МЕТ и EGFR, соответственно (Metcalfe A.M., et а/., 1997).
В особую группу мишеней р53 можно выделить гены, контролирующие ангиогенез. Ключевую роль в неоангиогенезе играет фактор роста эпителия сосудов VEGF (стимулирует размножение и миграцию эндотелицитов), экспрессия которого повышается при гипоксии или активации некоторых онкогенов (Bellamy W.T., 2002). р53 ингибирует транскрипцию как гена VEGF, так и гена HIF-1, фактора, обеспечивающего повышение экспрессии VEGF и его рецепторов в ответ на уменьшение содержания кислорода.
Клетки с диким типом р53 хуже переносят недостаток кислорода, перестают секретировать VEGF и начинают выделять ингибиторы ангиогенеза, что препятствует образованию новых сосудов. Указанные события являются, по-видимому, еще одной составляющей опухоль-супрессирующего действия р53, так как они предотвращают адаптацию клеток к гипоксии и прорастание сосудов в центр опухоли (Nam D.H., et а/., 2004).
Инкубация первичных культур фибробластов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro с аристолохиевой кислотой
Первичные фибробласты получали из 13,5-дневных эмбрионов мыши. Срок беременности отсчитывался от первого дня обнаружения вагинальной пробки (положительный Vaginal plague тест).
Все инструменты, ростовая среда, PBS, 1 х Трипсин-ЭДТА, культуральный пластик были стерилизованы. Имелось 2 набора стерильных инструментов, один для препарирования мыши, другой для изоляции фибробластов. Эмбрионы, находящиеся в матке, помещали в 10-сантиметровую чашку Петри с раствором PBS (137 мМ NaCI, 2,68 мМ KCI, 4,29 мМ Na2HP04, 1,47 мМ КН2Р04) и промывали несколько раз. Затем эмбрионы извлекали из матки и помещали в чашку Петри со свежим стерильным раствором PBS.
В процессе препарирования эмбриона удаляли голову, сердце и печень. Эти органы использовали для получения геномной ДНК и последующего генотипирования. Оставшуюся часть эмбриона переносили в 60-сантиметровую чашку Петри, измельчали ножницами и добавляли 1 мл однократного раствора трипсин-ЭДТА (РАА Laboratories GmbH, Австрия), помещали в инкубатор с температурой 37С, 5% С02 на 10 мин. В течение инкубирования смесь осторожно перемешивали несколько раз. Далее добавляли 8-9 мл ростовой среды DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы; 10 % сыворотки новорожденных телят (FBS); 1% антибиотика (пенициллин и стрептомицин); 1% L-глютамина и 1% пирувата Na (РАА Laboratories GmbH, Австрия). Клеточную взвесь перемешивали и переносили в 10 см-чашку Петри. Полученные первичные фибробласты обозначались клетками нулевого пассажа. На следующий день ростовая среда заменялась, а еще через день клетки подсчитывались и подвергались первому пассажу. В процессе пассирования первичных культур фибробластов (ПКФ) вели ежедневное наблюдение за ростом клеток и анализировали морфологические изменения с помощью световой микроскопии, отмечая наступление фазы остановки пролиферации (ОП) и её продолжительность по характерным фенотипическим изменениям клеток. По окончанию «критической фазы» ОП из ПКФ образовывались иммортализованные КЛ, которые поддерживали на той же питательной среде и регулярно пересевали. На стадии иммортализации (на 20-м пассаже) фибробасты клеточных линий замораживали для длительного хранения и возможного дальнейшего использования. С этой целью после удаления ростовой среды и промывания клеток раствором PBS, проводили их дезинтеграцию раствором смеси трипсин-ЭДТА. Затем клетки тщательно ресуспендировали в ростовой среде и переносили в пробирки. Осаждали при 1100 оборотов в течение 6 мин, удаляли DMEM и добавляли 1 мл замораживающей среды №1. Через 3-4 минуты добавляли 1 мл замораживающей среды №2, перемешивали и немедленно переносили в крио-пробирки для замораживания, которые помещали в предварительно охлажденный до 2-3С пластиковый крио-бокс, содержащий изопропанол в качестве изолирующего материала. Крио-бокс с пробирками устанавливали в холодильник с температурой -80С на 3-4 часа. Бокс с изопропанолом обеспечивает постепенное и равномерное охлаждение суспензии клеток на 1С в минуту. Это предотвращает разрывы клеточной мембраны кристалами воды, которые обычно происходят при резком снижении температуры. Замораживающая среда №1: 40% сыворотки (FBS) и 60% ростовой среды DMEM. Замораживающая среда №2: 20% DMSO и 80% ростовой среды DMEM. Использованная в работе аристолохиевая кислота (смесь аристолохиевой кислоты 1 и 2, в равных соотношениях), растворённая в воде в концентрации ЮмМ, была получена в отделе Молекулярной Токсикологии Немецкого центра раковых исследований (DKFZ, Heidelberg).
С целью выбора оптимальной концентрации АК, пригодной для изучения мутагенеза р53, на первом этапе ПКФ мышей HupkiArg/Pro первого пассажа обрабатывали АК в трех различных концентрациях: 20мкМ, 50мкМ и ЮОмкМ в течение 48 часов. С начала экспозиции с канцерогеном, каждые 24 часа (вплоть до 120 часов) производился подсчет живых клеток в камере Горяева. Результаты этого токсикологического эксперимента представлены на рис. 9. через определенные интервалы времени (каждые 24 часа), при инкубации с АК.
Как видно из данных, представленных на рис. 9, с увеличением концентрации АК скорость пролиферации клеток уменьшалась. В качестве подходящей для дальнейшего опыта была выбрана концентрация аристолохиевой кислоты 50мкМ, когда способность клеток к делению сохранялась, но скорость пролиферации снижалась примерно в 2 раза по сравнению с контрольными клетками. Такой выбор был основан на предположении, что данная концентрация будет достаточно высокой для проявления мутагенного эффекта, и в то же время, не ограничит значительно жизнеспособность экспонированных к АК культур.
Как видно из рис.10, ПКФ, выделенные из эмбрионов каждой линии мышей, были разделены на 3 группы: контрольную и 2 экспериментальные, инкубированные с АК в концентрации 50мкМ. ПКФ первой экспериментальной группы инкубировали с АК 48 часов однократно на 1-м пассаже (п.1), а ПКФ второй экспериментальной группы - два раза по 48 часов на 1-м и 3-м пассаже. Аддукты ДНК определяли в ПКФ 1-й группы на 2-м пассаже, в ПКФ второй группы и в контроле - на 4-м пассаже. Анализ генома с целью выявления мутаций проводили уже в образовавшихся из ПКФ иммортализованных КЛ, на 15-м пассаже во всех группах. На 17-м пассаже из иммортализованных КЛ выделяли и анализировали белки р53 и p19-ARF Опыт заканчивали на 20-м пассаже, когда все культуры замораживали.
Характеристика полученных линий мышей Hupki, эмбрионов мышей и первичных культур эмбриональных фибробластов
В нашей работе, с помощью метода трансгенных технологий, были получены первые 5 гетерозиготных мышей HupkiPro/wt (2 самки и 3 самца). При скрещивании HupkiPro/wt между собой в первом поколении было получено 11 мышей, результаты генотипирования которых представлены на рис. 12.
Как видно на рис. 12, из 11 мышей только 2 были гомозиготными по аллелю Hupki (HupkiPro/Pro - образцы на дорожках номер 3 и 11, имеющие одну полоску с размером в 368 пн) Среди остальных мышей выявлены 4 особи дикого типа, несущих в своем генотипе только ген р53 мыши 129Sv (номера дорожек - 2, 4, 7 и 12). Амплификация 6-го и 7-го экзона гена р53 у мышей дикого типа 129Sv дает ПЦР продукт размером 450 пн. При генотипировании 5 мышей образцы на дорожках 5, 6, 8, 10 и 13 имели двойные полоски, характерные для гетерозигот Hupki/Wt.
Позже от скрещивания гомозиготных мышей HupkiArg/Ar9 и HupkiPro/Pro нам впервые удалось получить гетерозиготную линию HupkiAr9/Pro. Общий вид гомо- и гетерозиготных мышей Hupki представлен на рис. 13. Как видно на рис. 13, мыши Hupki двух разных генотипов не отличаются друг от друга по размеру, окраске и остальным морфологическим признакам. В связи с отсутствием какой-либо очевидной патологии и после проведения тестирования полученных линий мышей Hupki в центральной лаборатории по работе с животными (Zentral TierLabor DKFZ, Heidelberg), было выдано разрешение на их дальнейшее применение в научно-исследовательской работе. Мыши Hupki не имели никаких заметных отклонений в развитии, давали здоровое плодовитое потомство и в период наблюдения не обнаруживали повышенной частоты развития патологии или злокачественных новообразований. Обе линии мышей HupkiPro/Pro и HupkiAr9/Pro использовались впервые для проведения молекулярно-генетических исследований и оказались пригодными для изучения направленного мутагенеза химерного гена р53 in vitro. Из эмбрионов мышей Hupki были получены первичные культуры фибробластов (рис. 14). - эмбрион мыши HupkiArg/Pro на 13,5 день внутриутробного развития. Рис. 14Б -первичные фибробласты HupkiPro/Pro. Рис. 14В - первичные фибробласты HupkiArg/Pro. Ув. х 100. Как видно на рис. 14А, эмбрион мыши на 13,5 день внутриутробного развития практически полностью сформирован. Конечности достаточно развиты, из внутренних органов хорошо различимы печень и сердце, которые осторожно удаляются во время препарирования эмбриона. На рис. 14Б и 14В представлены микрофотографии фибробластов первого пассажа на 2-й день после изоляции и посева. Клетки имеют выраженный полиморфизм размеров и формы с развитыми филоподиям. Ядро большинства клеток обычно округлое или овальное. Фибробласты двух разных генотипов практически не отличаются друг от друга по морфологии.
Геномную ДНК, выделенную из органов эмбрионов мышей HupkiArg/Pro и HupkiPro/Pra, использовали для генотипирования. Фрагмент ДНК, соответствующий 4-му экзону, амплифицировали с помощью специфичных праймеров и секвенированили. Последовательность нуклеотидов отображалась графически на электрохроматограмме. На рис. 15 представлены фрагменты электрохроматограмм с последовательностями нуклеотидов гена р53 в районе 72-го кодона (к.72). В качестве контроля использовали геномную ДНК мышей HupkiArg/Ar9.
Как видно на рис. 15, последовательность нуклеотидов в 72-м кодоне не одинакова. Триплет CGC кодирует аминокислоту аргинин (рис. 15А). Три одинаковых пика синего цвета в районе 72-го кодона на рис. 15Б обозначают последовательность ССС, которая кодирует аминокислоту пролин. Присутствие одновременно двух пиков синего и черного цвета в одной позиции на рис. 15В обозначает гетерозиготный вариант HupkiArg/Pro.
Таким образом, данный анализ показал наличие различных полиморфных вариантов гена р53 в геноме мышей Hupki в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов, характерных для человека.
Рост первичных фибробластов мыши в культуре не является однородным и постоянным. Существует механизм, ограничивающий число делений нормальных клеток (за исключением стволовых клеток, сохраняющих эту способность в течение всей жизни). Установлено, что при культивировании in vitro клетки после 50-60 делений (число Хейфлика) перестают размножаться и останавливаются преимущественно в G1 фазе клеточного цикла (Hayflick L, 1965).
Мы наблюдали, что на начальных пассажах первичные фибробласты, которые имеют звездчатую форму с отростками, размножаются и растут довольно интенсивно. Однако, по достижении ими определенного числа делений, рост их становился менее выраженным и клетки постепенно теряли эту способность. Этот особый период называется «кризисом» или репликативным (клеточным) старением, сопровождавшимся остановкой пролиферации (ОП). Для данной стадии характерен особый фенотип клеток в культуре. При этом размеры клеток значительно увеличиваются, а их форма округляется (рис. 16).
Делеции гена p19-ARF в контрольных и экспериментальных клеточных линиях эмбриональных фибробластов мышей Hupki
На различных моделях канцерогенеза и в исследованиях у человека была выявлена важная роль изменений гена р53 в развитии рака. Большинство опухолей человека содержит мутации этого гена. Мутации р53 возникают при действии канцерогенов на клетки человека и лабораторных животных. Основной целью данной работы было экспериментальное изучение мутагенеза химерного гена р53, содержащего экзоны (с 4-го по 9-й) гена р53 человека. Этот участок гена р53 вызывает интерес, поскольку он наиболее часто поражается при действии различных канцерогенов окружающей среды.
Для решения данной проблемы необходимо было, прежде всего, методами генетической инженерии получить соответствующие «гуманизированные» линии животных. Подобные работы были начаты в Немецком центре раковых исследований, где была создана гуманизированная модель мышей Ниркі Л3, несущая в своем геноме химерный ген р53 (Luo J.-L, ef а/., 2001). Данная линия мышей использовалась в различных экспериментах in vivo и in vitro (Clarke A.R., and Hollstein M., 2003; Hergenhahn M., et a/., 2004; Liu Z., ef a/., 2004; Feldmeyer N., et al., 2006; vom Brocke J., et a/., 2006; Reinbold M., ef a/., 2008) для изучения механизмов канцерогенеза и мутагенеза. В параллельно проводившихся исследованиях роли р53 в норме и при развитии патологических процессов была выявлена возможная роль полиморфизма 72-го кодона гена р53 в регуляции клеточного цикла и апоптоза (Pirn D.T Banks L, 2004; Murphy M.T., 2006). В связи с этим стало актуально получение линий мышей Hupki с другими вариантами полиморфизма 72-го кодона гена р53.
С помощью трансгенных технологий в Немецком центре раковых исследований нами были впервые получены и охарактеризованы гомозиготные мыши HupkiPro/Pro, впоследствии скрещенные с гомозиготной линией Hupki 9 для создания гетерозиготного варианта HupkiAr9/Pro. Мыши Hupki 3-х генотипов давали здоровое плодовитое потомство и в течение всей жизни не обнаруживали повышенной частоты развития патологии или злокачественных новообразований, как в случаях нокаутных по гену р53 мышей.
Обе линии мышей HupkiPra/Pro и HupkiAr9/Pra использовались впервые при исследовании мутагенеза химерного гена р53 in vitro. Для проведения этих исследований нами были получены первичные культуры эмбриональных фибробластов и на их основе -иммортализованные клеточные линии. Полученные от эмбрионов гуманизированных мышей Hupkipra/Pro и HupkiArs/Pra, первичные фибробласты не отличались друг от друга морфологически. Кроме того, генотипирование и анализ полиморфизма 72-го кодона химерного гена р53, расположенного в 4-м экзоне, посредством секвенирования продуктов амплификации, показали наличие различных полиморфных вариантов в геноме исследованных клеток в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов, характерных для человека.
Получение экспериментальных моделей мышей Hupki создало возможность для изучения механизмов мутагенного действия различных канцерогенов на участки гена р53 человека, инкорпорированные в организм лабораторных животных. Из канцерогенных агентов, вызывающих рак у человека, для проведения исследования была выбрана аристолохиевая кислота (АК) - недавно выявленный канцерогенный агент, включенный в 2008 году в Российский национальный перечень канцерогенных факторов. Первоначально, канцерогенность аристолохиевой кислоты была показана в опытах на крысах и мышах (Mengs U. et а/., 1982; Mengs U, 1983, 1987; Mengs U., Stotzem CD., 1993). Как оказалось в дальнейшем, этот агент является причиной известного феномена нефропатии и опухолей из уротелия у человека, вызванных употреблением китайских травяных препаратов для снижения веса, а также эндемической нефропатии и опухолей уротелия у жителей Балканского полуострова, обусловленных тем, что растение кирказон, содержавшее АК, могло случайно попасть в состав муки для приготовления хлеба (Arlt VM. era/., 2003, 2007; Notrier J.L., 2003; Grollman A.P., et a/., 2007).
Необходимым условием проведения данного исследования был подбор оптимальных доз АК для экспозиции эмбриональных фибробластов. В проведенных нами пилотных экспериментах было показано, что наиболее оптимальной является концентрация аристолохиевой кислоты в культуральной среде 50 мкМ, которая и была выбрана для последующих экспериментов. Поскольку известно, что мутагенный эффект зависит от суммарной дозы агента, определяемого временем воздействия (связь доза - время -эффект), было решено использовать два варианта экспозиции к АК - однократную инкубацию с канцерогеном (48 час) и двукратную инкубацию (96 час). Воздействие АК производили на начальных этапах роста первичных культур эмбриональных фибробластов — первом и третьем пассажах, что в большей степени могло соответствовать условиям экспозиции эмбриона к данному канцерогену in vivo.
Затем мы проводили наблюдение за ростом контрольных и экспериментальных (подвергнутых воздействию АК) культур. Как известно, в основе ограничительного механизма делений клеток в культуре лежит прогрессивное укорочение длины теломер во время репликации. Теломера, имеющая длину 10-15 тпн линейной ДНК, синтезируется не полностью при каждом клеточном делении и как результат — укорачивается за счет недостаточной экспрессии теломеразы (Hariey СВ., et а/., 1990; Rubin Н., 1997; Анисимов В.Н., 2003). Согласно теломерной гипотезе, прогрессивное укорочение теломер приводит к тому, что они достигают какой-то критической минимальной длины, когда сенсорные системы начинают распознавать их как аномальные структуры ДНК и индуцировать остановку клеточного цикла (Копнин Б.П., 2000). Тут важно заметить следующее: клетки мыши изначально обладают более длинными теломерами и, в противоположность клеткам человека, их теломераза сохраняет свою активность. Однако клетки мыши в процессе иммортализации также проходят стадию «кризиса» или репликативного (клеточного) старения, сопровождающегося остановкой пролиферации (Itahana К., et al., 2004). Содержание кислорода in vitro составляет 20%, что значительно выше физиологического уровня в тканях (3%). Возникающий оксидативный стресс приводит к поломкам двухцепочечной ДНК и вызывает «кризис» 2 способами: либо за счет активации p19ARF/p53, либо в результате p16INK4a/Rb сигнальных путей (Haber D.A., 1997; Campisi J., 2002; Campisi J., 2003; Itahana K., et al., 2004). Репликативное старение, так же как и апоптоз, защищает клетки от злокачественного перерождения.
В экспериментальных культурах эмбриональных фибробластов, обработанных АК, стадия клеточного старения наступала раньше и длилась больше, чем в контрольных клеточных культурах. Какого-либо влияния полиморфизма 72-го кодона на этот процесс не выявлено. Подобная закономерность (раннее наступление «кризиса» и большая его продолжительность) отмечена и при действии других канцерогенов (Vom Brocke J., et al., 2006: Reinbold M., et al., 2007).
Выявленные в работе изменения роста экспериментальных культур эмбриональных фибробластов по сравнению с контролем могли быть связаны с генотоксическим эффектом аристолохиевой кислоты. Как известно, модификация ДНК, вызываемая генотоксическими агентами за счет химических реакций in vitro, или в результате клеточного метаболизма, приводит к формированию аддуктов, играющих ключевую роль в процессе химического канцерогенеза (Garner R.C., 1998). Как отмечено в главе 1, генотоксический эффект аристолохиевой кислоты in vitro был показан на различных биологических объектах, в том числе, клетках человека и мышей (Mengs U, Klein М. 1988; Keverkordes S., et al., 2001; Kohara A.,ef al., 2002).
