Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НЕКОТОРЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТАХ ПАТОГЕНЕЗА ПСОРИАЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 12
1.1. Эпидемиологические данные 12
1.2. Генетические аспекты псориаза 13
1.3. Псориаз и программируемая клеточная гибель 17
1.4. р53 как кандидатный ген псориаза 21
1.5. Роль гена р53 в реализации лечебного эффекта ультрафиолетовой фототерапии псориаза 27
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 7". . 36
2.1 Объекты исследования 36
2.2 Выделение ДНК 42
2.3 Анализ генотипа 42
2.4 Статистический анализ результатов 43
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 46
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 60
ВЫВОДЫ 65
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68
Введение к работе
Псориаз - хроническое заболевание с преимущественным поражением кожи, которое характеризуется гиперпролиферацией эпидермиса, нарушением кератинизации и наличием воспалительного инфильтрата в дерме [64]. История существования псориаза как самостоятельной болезни насчитывает более 200 лет [223]. Пристальный интерес к этому заболеванию объясняется не только высоким удельным весом псориаза среди других болезней кожи (среди дерматологических больных доля пациентов с псориазом составляет- 12-15%), но и ростом встречаемости этого дерматоза [18, 51, 219]. Псориатический артрит, псориатическая эритродермия, пустулезный псориаз, распространенный бляшечный псориаз с выраженной резистентностью_к терапии нередко являются причиной инвалидизации больного [27, 33, 39].
Псориаз редко приводит к фатальному исходу, но он значительно снижает качество жизни больных, что в первую очередь связано с отсутствием эффективной терапии заболевания [18, 23, 96, 170, 221, 214]. Лечение псориаза остается одной из наиболее актуальных проблем в современной дерматологии [60, ПО, 118, 129]. Только в США расходы, связанные с терапией псориаза, составляют $1600 -$3000 млн. в год [170]. Статистические исследования показывают, что всего 46% больных, имеющих заболевание легкой степени и 33% пациентов с псориазом средней и тяжелой степени, удовлетворены результатами лечения [170]. Существует острая необходимость в поиске более эффективных методов терапии, что возможно только при глубоком понимании механизмов болезни [40, 58, 93, 97, 159].
Важную роль в патогенезе псориаза играет генетическая предрасположенность [27, 141, 102]. Изучение генетических детерминант псориаза позволит прояснить причины разнообразия тяжести данного дерматоза, уточнить вызывающие его биохимические механизмы, что приведет к разработке принципиально новых, эффективных и индивидуальных подходов к профилактике и лечению страдающих им больных [3, 29.].
Псориаз традиционно рассматривают как заболевание характеризующееся гиперпролиферацией и нарушением дифференцировки эпидермиса, считая этот процесс основным в патогенезе болезни [17, 51, 78]. Тканевой гомеостаз по своей сути является равновесием между процессами деления клеток и их гибели. Очевидно, что регуляция клеточной смерти не менее важна для нормального развития и функционирования организма, чем пролиферация. Увеличение массы клеток может происходить вследствие нарушения каждого из этих процессов. Таким образом, развитие патологических изменений, свойственных псориазу, возможно, обусловлено усилением деления и/или снижением программируемой гибели клеток [52]. При этом нарушение регуляции клеточной гибели может иметь место не только в кератиноцитах, но и в иммунокомпетентных клетках воспалительного инфильтрата. Если принять эту гипотезу, то удлинение жизни активированного клона Т-лимфоцитов приведет к возрастанию численности их популяции и к увеличению продукции цитокинов, поддерживающих воспаление и вызывающих усиление пролиферации кератиноцитов [25, 36, 78, 114, 148, 157, 158].
Ультрафиолетовая фототерапия (фотохимиотерапия (ПУВА), селективная фототерапия (СФТ), монохромный эксимерный лазер (МЭЛ) и др.) занимает одно из лидирующих мест во всем мире в лечении псориаза [6, 12, 20, 24, 40, 166]. В настоящее время считается, что биологическое действие электромагнитных волн этой длины заключается в индукции апоптоза Т-лимфоцитов и снижении пролиферации кератиноцитов в области псориатических папул и бляшек [70, 94, 134, 164, 210]. Исследования на клеточных линиях и животных моделях показали, что основной цитотоксический эффект УФО реализуется посредством стимуляции программируемой клеточной гибели через белок р53 [174, 182]. Ген р53 характеризуется биаллельным полиморфизмом Arg/Pro, находящимся в кодирующей области и претендующим на возможную функциональную значимость [100, 201].
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить распределение аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у больных псориазом.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить встречаемость аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у больных псориазом и здоровых доноров. Выявить полиморфные варианты, ассоциированные с риском развития псориаза в целом и различными клиническими формами заболевания в частности.
2. Проанализировать распределение аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у больных псориазом с различной степенью тяжести болезни.
3. Установить, наблюдается ли ассоциация между полиморфизмом кодона 72 гена р53 и характером течения псориаза.
4. Оценить распределение аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у пациентов с различной чувствительностью к лечебному действию УФО.
5. Установить, коррелирует ли р53 генотип больных псориазом с сезонностью заболевания.
Научная новизна полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования получены следующие новые данные:
1. Не обнаружено различий в распределении аллелей кодона 72 гена р53 при сравнении группы больных псориазом и здоровых доноров. Это свидетельствует, что данный полиморфизм не оказывает влияния на предрасположенность к развитию псориаза и позволяет исключить его из списка генов-кандидатов.
2. Аллель Pro у больных псориазом, имеющих псориатический артрит, встречается чаще (56%), чем в группе пациентов, не имеющих данной патологии (26%), что свидетельствует об ассоциации вышеупомянутого варианта с риском развития псориатического артрита у лиц, страдающих псориазом.
3. Распределение аллелей Arg/Pro полиморфизма гена р53 у пациентов с различной степенью тяжести болезни показал увеличение частоты аллеля Pro при тяжелом течении (47%), по сравнению с группой больных,- имеющих легкую степень тяжести заболевания (20%).
4. При сравнении больных с интермиттирующим течением псориаза встречаемость аллеля Pro была ниже (17%), чем у пациентов с часторецидивирующим (непрерывным) течением (44%).
5. Встречаемость пролинового аллеля при летней форме псориаза - (66%) наблюдалась значительно чаще, чем при зимней форме (8%). Частота генотипа Pro/Pro у больных с летней формой псориаза была достоверно выше (31%), чем у больных с зимней формой заболевания (1%).
6. Среди пациентов, имеющих выраженный терапевтический эффект от УФО, отмечалась пониженная частота аллеля Pro (11%) по сравнению с больными, у которых положительного действия ультрафиолетовой радиации не наблюдалось (54%). У пациентов, резистентных к УФО гомозиготное состояние по Рго72 гена р53 встречалось чаще (24%), чем у пациентов с выраженной чувствительностью к ультрафиолету (0%).
Практическое значение: При выборе терапии псориаза у больных, имеющих торпидное течение заболевания и наследственную отягощенность по онкологическим заболеваниям, целесообразно предварительно проводить генотипирование Arg/Pro полиморфизма гена р53, направляя пациентов в региональные консультативно-диагностические центры.
Результаты генотипирования позволят персонализировать применение излучения ультрафиолетового спектра в лечении больных псориазом: больным с Arg/Arg генотипом кодона 72 гена р53 рекомендуется применение ультрафиолетовой фототерапии; пациентам, гетерозиготным по Arg/Pro полиморфизму гена р53, при назначении УФО необходимо тщательно взвешивать ожидаемое терапевтическое действие и вероятность развития отдаленных побочных эффектов (в первую очередь, злокачественных новообразований кожи); у лиц гомозиготных по аллелю Pro гена р53 применение УФ-лучей широкого спектра (280-315 нм) не окажет терапевтического действия.
Генотип Arg/Pro полиморфизма гена р53 больных псориазом в комплексной оценке с другими критериями (наследственная отягощенность, характер и клинические формы болезни у страдающих родственников, возраст начала заболевания и др.) можно учитывать при прогнозировании течения заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Arg/Pro полиморфизм гена р53 не оказывает влияния на формирование риска развития псориаза, что позволяет исключить его из списка генов-кандидатов.
2. Наличие аллеля Pro кодона 72 гена р53 у больного псориазом повышает у него риск развития псориатического артрита.
3. Arg/Pro полиморфизм гена р53 оказывает модифицирующее действие на псориаз. Присутствие у пациента пролинового аллеля генар53:
• способствует значительному повышению резистентности псориаза к лечебному действию ультрафиолетового света;
• предрасполагает к постояннорецидивирующему (непрерывному) течению заболевания без периодов ремиссии в летнее время;
• предрасполагает к более тяжелому характеру болезни.
4. Гомозиготное состояние по пролиновому варианту кодона 72 гена р53, детерминирует обострение псориаза в весенне-летний период и определяет развитие летней формы заболевания.
Реализация и внедрение полученных результатов работы. Полученные результаты и рекомендации успешно используются в лечебно-диагностической и учебной работе кафедры кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона, посвященной 60-летию Российской академии медицинских наук, (Санкт-Петербург, 2004); Итоговой конференции воєнно научного общества слушателей и ординаторов I факультета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов», (Н. Новгород, 2004); Конференции, посвященной 135-летию кафедры кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, (Санкт-Петербург,2004); Всероссийской юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.И. Смирнова и 75-летию кафедры ОТМС Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Актуальные проблемы организации медицинского обеспечения войск в XXI веке», (Санкт-Петербург, 2004); 12 Euroconference on Apoptosis (Genie, Greece, 2004). Результаты исследования опубликованы в журналах: «Журнал дерматовенерологии и косметологии» (2004г.), «Медицинский академический журнал» (2004г.), «Journal of Dermatological Science» (2005г.), «Вестник дерматологии и венерологии» (2005г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Из них 3 статьи в центральной печати, включая 1 статью в иностранной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах и включает введение, обзор литературы, 3 главы собственных наблюдений с обсуждением полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками, содержит 10 таблиц, 3 приложения. Библиографический указатель включает 228 источников, из которых 54 опубликовано в отечественных и 174 в зарубежных изданиях.
Эпидемиологические данные
Псориаз - повсеместно распространенная болезнь, встречаемость которой зависит от расы и географического местоположения [122]. Согласно статистическим данным, наиболее часто этот дерматоз регистрируется в Скандинавии и странах северной Европы, поражая до 3% населения. Средний уровень заболевания выявляется в США и Великобритании (1-2%), а у - коренных североамериканских индейцев,—монголоидов и западных африканцев псориаз встречается крайне редко (0-0,3%) [27, 79, 80, 102, 141, 197]. По-видимому, генетические различия между расами и национальностями в большей степени влияют на заболеваемость псориазом, так как попытки объяснить этот феномен различиями в климате, диете и т. д. потерпели неудачу [27, 29, 133].
Данные эпидемиологических и клинических исследований псориаза показывают, что средний возраст начала болезни имеет бимодальное распределение. Приблизительно у двух третей больных пик заболеваемости приходится на 22 года у мужчин и 16 лет у женщин (I тип псориаза); у оставшейся трети - находится в возрастном пределе 57 лет для женщин и 60 лет для мужчин (II тип псориаза) [122, 149, 198].
В классических работах по изучению эпидемиологии псориаза приводятся следующие данные: популяционная частота болезни составляет 1,97-2,8%, распространенность псориаза среди родителей больных — 12-23%, среди детей —5-25%, среди сибсов — 9-23% среди родственников второй степени родства - 2,99-5,5% [55, 121, 123, 178, 189, 218]. Фенотипическая конкордантность по псориазу у гомозиготных близнецов достигает 60-70%, что в несколько раз выше, чем у гетерозиготных (12-23%) [65, 73, 81,123].
Генетические аспекты псориаза
Активно изучение роли наследственных факторов в патогенезе псориаза начали проводить в 60-70-х годах 20 века [55, 65, 218]. В настоящее время это заболевание рассматривается как хронический дерматоз мультифакторной природы с доминирующим значением в его развитии генетического компонента [38, 102, 141]. Подобное заключение основывается на многочисленных эпидемиологических данных и популяционных исследованиях, в которых выявлено статистически достоверное увеличение встречаемости псориаза среди родственников [28, 65, 73, 81, 84, 123]. Изучение генетических аспектов заболевания обычно подразумевает выявление характера его наследования. Выполнение подобной задачи оказалось затруднительным в случае с псориазом. Эта болезнь характеризуется множеством фенокопий, что свидетельствует об ассоциации не с одним геном, а несколькими альтернативными генетическими дефектами, имеющими сходное фенотипическое проявление [32, 83, 85, 102]. Гетерогенность генетических механизмов чрезвычайно затрудняет поиск молекулярных детерминант заболевания. Тип наследования, в зависимости от вовлеченного хромосомного локуса, может носить как доминантный, так и рецессивный характер. В случае доминантного наследования, фенотипические проявления псориаза характеризуются необычно низкой пенетрантностью (частотой проявления доминантного признака) [3, 32, 65, 83, 123]. Более высокая конкордантность у монозиготных близнецов (МЗБ), чем у дизиготных (ДЗБ), указывает на важную роль генетических факторов при псориазе [3, 65, 73, 81, 123]. В исследовании, проведенном в 1982 г. Brandrup F. и соавт. [81], используя датский регистр близнецов, обнаружили следующие показатели конкордантности при псориазе: парная конкордантность у МЗБ составила 64%, у ДЗБ - 14%. В ретроспективных исследованиях, проведенных Farber Е. с соавт. [107], получили частоту конкордантности у МЗБ - 72%, у ДЗБ - 14%. Хотя проведенное в 1993 г. Duffy D. с соавт. в Австралии изучение показало более низкую конкордантность - 35% у монозиготных и 12% у дизиготных близнецов [99]. Было отмечено, что в тех случаях, когда близнецы конкордантны по псориазу, начало заболевания, распространенность и тяжесть заболевания очень похожи. Это предполагает, что генетические факторы играют роль в передаче этих параметров, контролируют возникновение и течение болезни [81, 99, 107]. Интересно, что конкордантность никогда не достигала 100% (даже когда производили обследование пожилых близнецов). Это свидетельствует в пользу факторов внешней среды, которые играют ключевую роль в проявлении заболевания.
Многие работы, направленные на исследование родословных семейного псориаза, установили причастность к псориазу генов, расположенных в непосредственной близости от комплекса HLA (хромосома 6р21) [5, 156, 179]. Изучение главного комплекса гистосовместимости (HLA) было связано с поиском маркеров, наличие которых в организме обусловливает восприимчивость или резистентность индивидуума к определенному заболеванию [3, 179]. Значительные количественные и качественные расхождения опубликованных результатов многочисленных исследований ассоциаций комплекса HLA, вероятно, определяются этнической спецификой изучаемых групп и особенностями подбора пациентов. Аллельный полиморфизм генов HLA несколько отличается у больных псориатическим артритом и бляшечным псориазом, у пациентов с I и II типами болезни, у лиц с УФ-чувствительным и УФ-резистентным заболеванием [161, 184, 228]. В последние годы стало ясно, что антигены HLA играют важную роль при ряде мультифакторных заболеваний, при которых обнаруживаются определенные иммунопатологические сдвиги. В то же время, указанные гены, не будучи напрямую вовлеченными в патогенез, могут служить своеобразными генетическими маркерами, находясь в непосредственной близости от HLA, определять предрасположенность к развитию заболевания [3, 32]. С псориазом ассоциируются определенные антигены I класса HLA - HLA-A2, -А24, -A3О, -ВІЗ, -В27, -В37, -В57, -В39, -Cw2, -Cw6, -Cw7, -Cw8 и -Cwll. Из них наиболее часто встречаются аллели CW6,_B57_H ВІЗ [122]. Приблизительно от 55% до 80% белого населения, страдающего псориазом, являются носителями HLA-Cw6 антигена, по сравнению с 20% в общей популяции. Этот антиген, видимо, ассоциируется с псориазом в большей части этнических групп [117, 122, 204].
Среди антигенов II класса HLA у больных псориазом чаще встречаются аллели DR1, DR2, DR7, DQ9 и др. [123]. Наиболее воспроизводимые данные получены лишь для HLA-DR7 [32, 161]. Также, была отмечена более частая комбинация DR7 с Cw6, из чего было предположено, что комбинация этих аллелей может повышать предрасположенность к псориазу [146].
Объекты исследования
Группа больных псориазом была отобрана из числа пациентов клиники кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии. Критерием включения являлось наличие заболевания в течение 12 месяцев и более, подтвержденное медицинской документацией. Продолжительность болезни составила от 1 до 47 (в среднем 13,9±1,04) лет. В качестве источника ДНК использовались лейкоциты периферической крови 173 больных псориазом: мужчин - 138 (80%), женщин - 35 (20%). Возраст пациентов составлял от 15 до 73 (в среднем - 41,9±1,08) лет. У 142 (82%) больных заболевание началось до 40 лет (I тип псориаза), у 31 (18%) - в 40 лет или позже (II тип псориаза) (табл. 1).
Бляшечную форму псориаза имели 153 (88%) больных, экссудативный псориаз - 14 (8%), эритродермию - 6 (3%). Псориатический артрит (ПсА) наблюдался у 18 (10%) пациентов. Тяжесть болезни оценивалась по индексу площади и тяжести псориатических поражений PASI (Psoriasis Area and Severity Index) [109, 112, 209] (легкая степень - 12 баллов, средняя - 12 -20 баллов, тяжелая - 20 баллов). Тяжелое течение заболевания отмечалось у 48 (28%) пациентов, средней степени тяжести - у 63 (36%) пациентов и легкое - у 62 (36%) пациентов. «Семейный» анамнез заболевания имели 45 (26%) больных.
Сезонность псориаза оценивалась по данным медицинской документации и путем сбора анамнеза. Обострение заболевания преимущественно в осенне-зимний период (зимняя форма) отмечалось у 80 (46%) пациентов, в весенне-летний период (летняя форма) - у 29 (17%) больных, без четкой связи со временем года (смешанная форма) - у 64 (37%) пациентов. Интермиттирующий характер течения псориаза (1-2 рецидива в год, с отсутствием высыпаний в периоды ремиссии или наличием только «дежурных» бляшек) имели 95 (55%) пациента, часторецидивирующий (непрерывный) - 78 (45%о) (табл. 2).
Для оценки эффективности применения УФО в виде монотерапии псориаза использовался опросник оценки симптомов псориаза PSA (Psoriasis Symptom Assessment) [2, 90, 91], который заполнялся больными до и после периода инсоляции (см. прилож. 1). В качестве источника УФО пациенты (табл. 3) использовали солнечные лучи на широте Ленинградской области в период с 15 мая по 15 сентября (время инсоляции - 09.00-11.00 или 15.00-17.00 час.) или/и облучатели ультрафиолетовые, спектра, близкого к солнечному, типа «УФО-В Электроника» (длина излучаемых волн 230-400 нм) (рис. 8).
Перед началом фототерапии все больные находились в стационарном периоде заболевания. Курс лечения составил 4 недели с частотой сеансов 3-5 раз в неделю. Начальное время облучения составляло 15 минут для солнечных лучей и 1 минуту для искусственного источника УФО. В дальнейшем пациенты самостоятельно увеличивали продолжительность сеансов (в среднем - на 5 мин. за процедуру при естественном и на 0,5 мин. при искусственном облучении), не доводя эффект до развития эритемы.
