Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Роль наследственного фактора в развитии инсульта Методы исследования генетических аспектов ишемического инсульта 11
1.2. Понятие полиморфизма. Вклад полиморфных вариантов генов в развитие заболевания 14
1.3. Молекулярно-генетические основы развития ишемического инсульта и формирования его основных факторов риска 15
1.4. Биохимические механизмы церебральной ишемии 19
1.5. Молекулярные механизмы клеточной гибели в условиях церебральной ишемии 28
1.5.1. Апоптоз, опосредованный действием р53. Роль р53 в норме и при патологии 47
1.5.2. Каспаз-независимый путь апоптоза. Характеристика апоптоз- индуцируюгцего фактора 49
1.5.3. Конечный этап апоптоза. Характеристика поли(АДФ-рибозы) полимер азы-1 49
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
2.1. Клиническая характеристика больных 53
2.2. Методы исследования 57
2.2.1. Клинические методы 57
2.2.2. Генетические методы исследования 61
2.2.3. Статистическая обработка данных 67
ГЛАВА 3 . РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ 68
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО И
БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ 81
4.1. Анализ полиморфных вариантов гена ПАРП-1 81
4.2. Анализ полиморфных вариантов гена АИФ 96
4.3. Полиморфизм гена р53 106
4.4. Результаты многофакторного анализа 119
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 123
ВЫВОДЫ 130
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133
- Роль наследственного фактора в развитии инсульта Методы исследования генетических аспектов ишемического инсульта
- Клиническая характеристика больных
- . РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ
Введение к работе
Сосудистые заболевания мозга — актуальная медицинская и социальная проблема.
Широкое распространение цереброваскулярных заболеваний, нередкое возникновение их в молодом возрасте, высокий процент смертности и инвалидизации определяют медицинскую и социальную значимость исследований, посвященных изучению генетических аспектов ишемического инсульта.
Большинство случаев ишемического инсульта относится к полигенным мультифакториальным синдромам, в развитии которых задействованы как факторы наследственной предрасположенности, так и факторы внешней среды.
В настоящее время исследования в области генетики ишемического инсульта ведутся по нескольким направлениям. Проводится изучение роли кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска цереброваскулярной патологии [7, 12]. В рамках этих исследований изучаются полиморфные варианты генов ренин-ангиотензиновой системы [7, 66, 139], МЭ-синтаз [10, 121], генов атерогенеза и гемостаза [121]. В ходе исследований, проведенных на нашей кафедре совместно ОМГЧ ИМГ РАН, была найдена взаимосвязь между ББ гомозиготным генотипом гена АПФ и стенозом МАГ у пациентов с атеротромботическим инсультом. Было также установлено, что 4а4Ь генотип есЖ)8 ассоциирован с развитием сахарного диабета II типа [10, 11, 16].
В последние годы особую актуальность приобретают исследования, посвященные раскрытию молекулярно-генетических основ ишемического повреждения мозга, возможностям прогнозирования индивидуальной чувствительности мозга к ишемии.
Представление о механизмах повреждающего действия ишемии менялось в течение последних десятилетий. Трансформация гемодинамических, клеточных и молекулярных изменений в стойкий морфологический дефект определяется не только возможностями коллатерального кровообращения и реактивностью сосудов мозга, но и особенностями индивидуальной чувствительности вещества мозга к ишемии, фоновым состоянием метаболизма, особенностями реагирования нейроиммуноэндокринной системы [7, 15].
На современном этапе ведется поиск генов, вовлеченных в комплекс генетических реакций, запускаемых фокальной ишемией, непосредственно определяющих тканевой ответ на ишемическое повреждение и участвующих в формировании морфологического дефекта.
Процессы некроза и апоптоза запускаются практически одновременно. Программированная клеточная смерть индуцируется по 3 основным механизмам, функционирующим параллельно: митохондриальному - изменение транскрипции генов ряда апоптогенных белков ведет к увеличению проницаемости мембран митохондрий с высвобождением цитохрома С и затем активацией каспазного каскада. Однако, митохондриальный путь апоптоза может запускаться и без участия каспаз. Каспаз- независимый путь запускается непосредственно при деструкции митохондрии и высвобождении апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ). АИФ - митохондриальный интермембранный флавопротеин, играющий важную роль в конденсации ядерного хроматина и фрагментации ДНК. через рецепторы FAS и TNF — при связывании .с ними внеклеточных лигандов - маркеров некроза с последующим возбуждением каспазы 8 и запуском каспазного каскада; через прямое повреждение ДНК в процессах активации кальций - зависимых ферментов и оксидантного стресса [7, 44, 117, 134].
Во всех механизмах индукции апоптоза принимает участие транскрипционный фактор р53, синтез которого происходит в ответ на различные повреждающие воздействия, включая оксидантный стресс, эксайтотоксичность, повреждения ДНК. Роль гена р53 была продемонстрирована на модели фокальной ишемии мозга у экспериментальных животных. Размер инфаркта был достоверно меньше у трансгенных мышей со сниженным содержанием р53.
Необходимо отметить, что некроз и апоптоз являются взаимосвязанными звеньями общего механизма ишемического повреждения клетки. Концевую роль в их реализации играет ядерный регулятор - ДНК- разрушающий фермент ПАРП-1; повышенная активация его ведёт к истощению НАД, а затем и АТФ, и как следствие - к высокому энергодефициту клетки и к клеточной гибели. Этот механизм чаще всего, выступает ведущим звеном при сосудистых катастрофах и нейродегенеративных процессах, при которых делеция гена ПАРП-1 и препараты, ингибирующие его обеспечивают защитное действие. Клеточная гибель, ассоциированная с повышенной активацией ПАРП-1, обнаруживается при некрозе, в то время как при апоптозе наблюдается распад ПАРП-1, что может сохранить энергию, необходимую для протекания апоптоза.
В связи с вышесказанным особую значимость приобретают исследования посвященные раскрытию молекулярно-генетических механизмов ишемического повреждения мозга, факторов индивидуальной чувствительности вещества мозга к ишемии, что и определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.
Цель работы: Изучение полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза: ПАРП-1, АИФ и р53 и их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход острого ишемического атеротромботического инсульта.
Задачи исследования:
Изучение клинических особенностей развития ишемического атеротромботического инсульта и МРТ закономерностей формирования инфаркта мозга на протяжении острого периода заболевания.
Анализ структурных особенностей Rsa-I полиморфизма гена ПАРП-1, Bell полиморфизма гена АИФ и Bam HI полиморфизма гена р53 и их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход ишемического инсульта.
Разработка молекулярно-генетических критериев прогнозирования размеров инфаркта мозга и исхода ишемического инсульта.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР- морфометрическое, молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфизмов генов — регуляторов апоптоза в патогенезе ишемического инсульта.
Показано, что обнаруженная ассоциация полиморфизмов генов ПАРП-1 и р53 с тяжестью состояния больных й объемом инфаркта мозга может позволить использование данных генотипов в качестве прогностических критериев для определения варианта течения заболевания и формирования очага инфаркта при остром ишемическом инсульте.
Практическое значение работы.
Полученная взаимосвязь между полиморфными вариантами генов- регуляторов апоптоза: ПАРП-1 и р53 и тяжестью состояния больных, а также объемом инфаркта мозга позволяет применять данные генотипы в качестве критериев раннего прогнозирования течения заболевания и формирования очага ишемического повреждения при остром ишемическом инсульте.
Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии расширяет возможности первичной профилактики ишемического инсульта, позволяет разработать новые подходы к диспансеризации практически здоровых лиц из групп риска с целенаправленным и комплексным их обследованием и превентивным лечением.
Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Выявленная ассоциация между полиморфными вариантами генов ПАРП-1 и р53 и размерами инфаркта доказывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через торможение процессов апоптоза и активацию синтеза нейротрофических факторов.
Роль наследственного фактора в развитии инсульта Методы исследования генетических аспектов ишемического инсульта
Сосудистые заболевания мозга - актуальная медицинская и социальная проблема. Основное место среди сосудистых заболеваний мозга занимают инсульты.
Согласно международным эпидемиологическим исследованиям ежегодно в мире от инсульта умирает 4,7 млн. человек. По данным ВОЗ смертность от цереброваскулярных заболеваний уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей различных локализаций и достигает в экономически развитых странах 11-12%, а в Японии - 25%. Половина всех инсультов приходится на трудоспособный возраст. По частоте инвалидизации инсульт занимает первое место, лишь 20% выживших после инсульта продолжают трудиться на прежней работе. Социальную значимость проблемы усиливает, наблюдающаяся в последние годы тенденция к возникновению инсультов у лиц молодого возраста [6, 7].
Медицинская и социальная значимость проблемы ишемического инсульта определяет значимость изучения наследственной предрасположенности к цереброваскулярным заболеваниям и инсульту.
Большинство случаев ишемического инсульта имеют мультифакториальную этиологию и генетические механизмы, лежащие в основе развития инсульта также полигенны. В таких случаях сложность установления генетической предрасположенности к инсульту связана с несколькими факторами. Во-первых, это высокая степень гетерогенности инсультов по этиологии, во-вторых, трудности при диагностике различных патогенетических вариантов инсульта, и, в-третьих, сложность определения связи между кандидатным геном и факторами внешней среды.
В изучении генетических аспектов сосудистой патологии головного мозга можно выделить следующие этапы:
1. Систематические эпидемиологические исследования цереброваскулярных заболеваний, начатые под эгидой ВОЗ в 1959 году, и создание международной программы по эпидемиологии цереброваскулярных заболеваний (1966г).
2. Генеалогический метод: изучение наследственной предрасположенности к сосудистой патологии мозга, путем анализа родословных у лиц, страдающих сосудистой патологией мозга, а также изучения конкордантности у моно- и дизиготных близнецов.
3. Молекулярно-генетические исследования [9].
Исследования отечественных ученых позволили сделать вывод о том, что семейная предрасположенность является фактором риска развития инсульта.
Было показано, что в семьях больных с атеротромботическими инсультами достоверно чаще, чем в контрольной группе встречаются ишемические инсульты и ТИА, а также такие факторы риска как артериальная гипертензия, гипертрофия миокарда, гиперлипидемия, гипергликемия.
Итоги крупномасштабных исследований, включивших тысячи человек, продемонстрировали, что наследование по обеим родительским линиям намного больше увеличивает риск развития инсульта или транзиторных ишемических атак, чем наследование по одной из них, причем наследование по материнской линии является «независимым» фактором риска развития инсульта и смерти от инсульта [103].
Клиническая характеристика больных
Было обследовано 250 пациентов (славян из Московской популяции) с ишемической болезнью головного мозга.
Из них в исследование были включены 60 пациентов с острым ишемическим атеротромботическим инсультом в каротидной системе, поступивших в неврологические клиники РГМУ (ГКБ № 20 и ГКБ № 31 г. Москвы) за период 2001-2004 гг., соответствовавших критериям включения в исследование.
Возраст больных колебался от 47 до 83 лет (средний возраст 69,6 + 9,98). В исследование вошло 39 женщин и 21 мужчин.
Критериями включения пациентов в исследование явились:
1. Первые 12 часов с момента развития каротидного ишемического
атеротромботического инсульта.
2. Ясное сознание или расстройства сознания до уровня сопора.
3. Отсутствие церебральных инсультов в анамнезе.
5. Отсутствие острых и хронических (в стадии декомпенсации)
заболеваний внутренних органов.
6. Применение унифицированной базисной терапии во время проведения
исследования.
7. Подписание информированного согласия на участие в исследовании.
Критерии исключения больных из исследования:
1. Наличие церебрального инсульта в анамнезе.
2. Острое нарушение мозгового кровообращения в вертебрально- базилярной системе.
3. Более 12 часов с момента развития острого ишемического инсульта в системе внутренней сонной артерии.
4. Выраженные расстройства сознания (кома), признаки дислокационного стволового синдрома на момент госпитализации.
5. Тяжелые сопутствующие заболевания, угрожающие жизни пациента.
10. Другие заболевания нервной системы.
11. Аутоиммунные и инфекционные заболевания.
12. Другие острые заболевания воспалительной и невоспалительной природы.
13. Злокачественные новообразования.
14. Лица, у которых диагноз ишемического инсульта в каротидной системе не подтвердился дополнительно данными магнитно-резонансного томографического (МРТ) исследования головного мозга.
16. Лица, у которых по данным клинико-лабораторных исследований наиболее вероятен неатеротромботический (кардиоэмболический, гемодинамический, лакунарный) патогенетический вариант ишемического инсульта.
17. Из исследования также исключали пациентов, у которых наблюдался полный регресс неврологической симптоматики в течение первых 24 часов от начала развития заболевания.
Диагноз каротидного ишемического атеротромботического инсульта основывался на тщательном сборе анамнеза развития заболевания, исследовании соматического и неврологического статусов, данных клинико- инструментальных методов исследования.
Ишемический характер инсульта подтверждался клиническими критериями, МРТ головного мозга, а также данными клинического анализа спинномозговой жидкости (СМЖ), исследования глазного дна.
Результаты клинико-инструментального исследования пациентов
Поли (АДФ-рибоза) полимераза-1 (ПАРП-1) -ядерный фермент, активирующийся в ответ на разрыв нити ДНК и участвующий в репарации ДНК [63]. Повышение активации ПАРП-1 при ишемии ведет к истощению НАД, а затем и АТФ, что вызывает значительный энергетический дефицит, подавление гликолиза и митохондриального дыхания, и, как следствие, гибель клетки. Активность ПАРП-1 возрастает в сотни раз при связывании с участками разрыва ДНК. Этот механизм является одним из основных при острой сосудистой патологии головного мозга. Смерть клетки, ассоциированная с повышением активации ПАРП-1 ведет, в основном, к клеточной гибели по варианту некроза, тогда как апоптоз ассоциирован с разрушением ПАРП-1 каспазами. Имеются данные, полученные на экспериментальных животных, об участии этого энзима в формировании очага ишемического повреждения при инсульте.
Все эти факты позволили нам рассматривать ген ПАРП-1 как один из потенциальных генов-регуляторов апоптоза, участвующих в формировании инфаркта мозга при ишемическом инсульте.
Исследовали полиморфизм во 2-м интроне гена ПАРП-1, (точковую замену в сайте узнавания рестриктазы) у пациентов с каротидным ишемическим инсультом атеротромботического варианта развития. Присутствие рестрикционного сайта для рестриктазы Яза-Г обозначалось как (+), отсутствие - как (-).
Частота встречаемости (-) аллеля составила 78,3% (94 аллеля); частота встречаемости (+) аллеля составила 21,7% (26 аллелей).
1 -1 -/- ПАРП-1 генотип был установлен у 40 больных с каротидным ишемическим инсультом (66,7%), 1 -1 +/- ПАРП-1 генотип - у 13 больных (21,7%), 1 -1 +/+ ПАРП-1 генотип - у 7 больных (11,6%).
Распределение аллелей и полиморфных вариантов гена ПАРП-1 показано в таблице 7.
При анализе распределения полиморфных вариантов гена ПАРП-1 было выявлено, что в исследуемой группе пациентов достоверно преобладал -/- гомозиготный вариант (р 0,05). Распределение полиморфных вариантов гена ПАРП-1 соответствовало закону Харди-Вайнберга.
Проводился анализ частоты встречаемости основных факторов риска ишемического инсульта у пациентов с разными генотипами ПАРП-1. Распределение факторов риска в зависимости от полиморфных вариантов гена ПАРП-1 представлено на рисунке 5.
В группе больных с размером очага от 40 до 90 см Я8а-1 -/- генотип ПАРП-1 определен у 10 (83,4%), Б аЛ +/- ПАРП-1 - у 2 (8,3%), Б аЛ +/+ ПАРП-1 - у 1 (8,3%) пациентов.
В группе больных с размером очага более 90 см3 Кза-1 -/- ПАРП-1 генотип определен у 22 пациентов (88%), Кза-1 +/- ПАРП-1 - у 2 (8%), И аЛ +/+ ПАРП-1 - у 1 (4%) пациентов.
Пациенты, имевшие (+) аллель (носители Я8а-1 +/- и 1 -1 +/+ генотипов) были объединены в одну группу.
Распределение полиморфных вариантов гена ПАРП-1 в зависимости от объема ишемического очага на 1-е, 3-е, 7-е и 21-е сутки от развития заболевания представлено на рисунках 6, 7, 8 и 9 соответственно
