Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 . Основные современные методы исследования генетической составляющей ишемического инсульта 11
1.1.1. Ассоциативные исследования генетических факторов риска развития ишемического инсульта 14
1.1.2. Ассоциативные исследования индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению 16
1.1.2.1. Роль генов липидного обмена в формировании индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению 17
1.1.2.2. Роль генов митохондриального и рецепторного путей апоптоза в формировании индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению 18
1.1.3. Полногеномное сканирование 21
1.2. Индуцибельная NO-синтаза и оксид азота в реализации биохимических механизмов ишемии мозга 22
1.2.1. Изоформы NO-синтазы: eNOS, nNOS, iNOS 23
1.2.2. Функционирование изоформ NO-синтазы на разных этапах ишемического повреждения мозга 24
1.2.3. Роль оксида азота в развитии ишемического повреждения мозга 29
1.2.4. Взаимодействие iNOS с белками ПАРП-1 и ЦОГ-2 на этапах ишемического повреждения мозга 33
1.2.5. Применение ингибиторов iNOS в моделях экспериментальной ишемии 34
1.3. Ассоциативный анализ полиморфных вариантов генов NOS1, NOS2HNOS3 35
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
2.1. Клиническая характеристика больных 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Клинические методы 44
2.2.2. Лабораторные и инструментальные методы 45
2.2.3. Генетические методы исследования 48
2.2.4. Статистическая обработка данных 54
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ 55
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ 68
4.1. Распределение основных факторов риска ишемического инсульта в зависимости от генотипов полиморфных вариантов NOS2 70
4.2. Анализ связи полиморфных вариантов reHaNOS2 с динамикой объема очага инфаркта мозга 74
4.3. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена NOS2 в зависимости от динамики тяжести состояния 83
4.4. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена NOS2 в зависимости от степени функционального восстановления 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90
ВЫВОДЫ 101
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104
- Основные современные методы исследования генетической составляющей ишемического инсульта
- Клиническая характеристика больных
- РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ
Введение к работе
Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, ишемический инсульт - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение ишемического инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития заболевания.
Многочисленные эпидемиологические исследования доказали
важность роли генетической составляющей в частоте развития сосудистых заболеваний головного мозга.
В большинстве случаев ишемический инсульт - это мультифакторное заболевание, в формировании которого принимают участие как внешние факторы, так и индивидуальные генетические особенности индивидуума.
В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии.
В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций
используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности
мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию
течения и исхода заболевания. В рамках исследований, проведенных на
кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ
ВПО РГМУ совместно с Отделом Молекулярных Основ Генетики Человека
ИМГ РАН, была определена связь Rsa-I полиморфизма гена ПАРП-1 и
ВатШ полиморфизма гена р53, основных индукторов митохондриального
звена апоптоза с объемами очага инфаркта мозга на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки
и тяжестью заболевания [12]. Выявлена связь rs3740720 полиморфизма гена
FADD и полиморфизма -1677 G/A гена Fas с формированием обширного б
очага инфаркта мозга и тяжестью течения заболевания [7]. Полученные данные косвенно подтверждают участие механизмов программированной клеточной гибели в ишемическом повреждении ткани головного мозга.
Избыточная продукция оксида азота (NO) при обязательном участии фермента индуцибельная NO-синтаза (iNOS) с последующим образованием токсического соединения пероксинитританиона в настоящее время рассматривается как один из важнейших пусковых механизмов тканевого повреждения на разных этапах ишемии мозга. Участие гена NOS2, кодирующего синтез iNOS в формировании очага инфаркта мозга было многократно продемонстрировано на различных моделях экспериментальной ишемии. Особое внимание привлекает факт относительно поздней экспрессии iNOS, что в дальнейшем возможно определит избирательное применение селективных ингибиторов фермента в условиях стационаров, куда пациенты с ишемическим инсультом не всегда госпитализируются в первые сутки от развития заболевания.
В связи с изложенным выше, представляет интерес проведение анализа структурных особенностей гена NOS2, кодирующего синтез фермента iNOS у больных с ишемическим инсультом в остром периоде.
Цель работы: Изучение роли полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы (NOS2) в формировании инфаркта мозга, течении и исходе заболевания у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.
Задачи исследования
1. Изучить клинические особенности развития каротидного ишемического атеротромботического инсульта и закономерности динамики формирования инфаркта мозга в остром периоде заболевания.
Проанализировать полиморфные варианты -2447C/G, -1659С/Т, -0,7 (TAAA)n I/D и Ser608Leu(150C/T) гена NOS2 и их влияние на динамику формирования инфаркта мозга.
Оценить связь анализируемых полиморфных вариантов гена NOS2 с течением и исходом ишемического инсульта.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое и молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфных вариантов -2447C/G, -1659С/Т, -0,7 (TAAA)n I/D и Ser608Leu(150C/T) гена NOS2 в динамике формирования инфаркта мозга, течении и исходе заболевания.
Обнаружены статистически значимые ассоциации полиморфизмов Ser608Leu(C/T) и -1659С/Т гена NOS2 с динамикой формирования очага инфаркта мозга, что косвенно может свидетельствовать о функциональной значимости вышеуказанных полиморфных вариантов.
Выявлено достоверное преобладание носителей гомозиготного С/С генотипа по полиморфизму Ser608Leu(C/T) гена NOS2 среди больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе в период с 1-х по 3-й сутки и в группах больных с умеренной и тяжелой инвалидизацией, по сравнению с носительством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга.
Практическая значимость работы
Полученная взаимосвязь полиморфизма Ser608Leu(C/T) гена NOS2 с динамикой формирования очагов инфаркта мозга, течением и исходом ишемического инсульта позволит применять анализ генотипов Ser608Leu(C/T) в качестве критерия прогнозирования течения и исхода заболевания.
Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии расширяет возможности индивидуализированной профилактики ишемического инсульта и позволяет разработать новые подходы к диспансеризации здоровых лиц из группы риска.
3. Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии
позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Ассоциация
полиморфного варианта Ser608Leu(C/T) гена NOS2 с динамикой
формирования инфаркта мозга показывает перспективность использования
нейропротекторов, реализующих свое действие через высокоселективное
ингибирование фермента iNOS.
Положения, выносимые на защиту
Формирование объема инфаркта мозга, динамика неврологического статуса и степень функционального восстановления при ишемическом инсульте статистически значимо ассоциированы с полиморфным вариантом Ser608Leu(C/T) 16-го экзона гена NOS2, что косвенно свидетельствует о функциональной значимости данного участка, определяющего замену аминокислоты серина на лейцин в последовательности первичной структуры белка фермента iNOS.
Высокодостоверное различие в относительной динамике объема исходно малых очагов инфаркта мозга у носителей С/С генотипа в сравнении с носителями аллеля Т по Ser608Leu(C/T) гена NOS2, позволяет
предположить различную степень значимости избыточного синтеза NO для формирования очагов разного объема.
3. Обнаруженная связь полиморфизма гена NOS2, кодирующего синтез iNOS, с динамикой формирования инфаркта мозга, подтверждает участие важнейших медиаторов нейроиммунного ответа NO и ONOO" в ишемическом повреждении головного мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом и обосновывает изучение и необходимость разработки нейропротекторов, реализующих свое действие путем высокоселективного ингибирования фермента iNOS.
Основные современные методы исследования генетической составляющей ишемического инсульта
В настоящее время сосудистые заболевания мозга, и особенно инсульты, остаются актуальной медицинской и социальной проблемой. Несмотря на внедрение новых технологий в лечении, реабилитации и профилактике, по данным ВОЗ, инсульт занимает третье место в структуре причин смертности населения экономически развитых стран. Ежегодная смертность от инсульта в России - одна из самых высоких в мире (175 человек на 100 тысяч населения). Ранняя тридцатидневная летальность после инсульта составляет 34,6%, а в течение первого года умирает каждый второй заболевший. Около 80% больных, перенесших инсульт, становятся инвалидами, из них 10% нуждаются в постоянной посторонней помощи. Более половины больных не удовлетворены качеством жизни и лишь менее 15% выживших могут вернуться к своей работе [9].
Среди видов инсульта преобладают ишемические повреждения мозга. По данным международных мультицентровых исследований соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет 80-85 и 15-20% соответственно [3]. Около половины всех острых нарушений мозгового кровообращения по ишемическому типу являются тромботическим или эмболическим осложнением атеросклеротического процесса в артериях крупного и среднего калибра (атеротромботический инсульт или артерио артериальная эмболия); около 25% связано с патологией мелких сосудов (лакунарный патогенетический вариант инсульта); около 20% - с патологией сердца (кардиоэмболический патогенетический вариант); 5% - с редкими или необычными причинами (гемодинамический инсульт, связанный с резким подъемом артериального давления или, напротив, падением системной гемодинамики; сосудистые нарушения воспалительного генеза; и травматическая диссекция артерий; гематологические нарушения и т.д.) [2]. Однако независимо от патогенетического варианта инсульта воздействие патогенного фактора на ткань мозга реализуется развитием острой фокальной ишемии. Выделяют две группы факторов риска развития инсульта: модифицируемые и немодифицируемые. К основным модифицируемым факторам риска развития ишемического инсульта относят наличие таких фоновых заболеваний как атеросклероз, артериальная гипертензия и их сочетание, а также мерцательная аритмия и сахарный диабет. Огромное значение в формировании риска развития артериальной гипертензии и атеросклероза играют избыточная масса тела и несбалансированное питание, гиперлипидемия, недостаточная физическая активность и хронические стрессы, а также злоупотребление алкоголем. Необходимо отметить, что курение является независимым фактором риска развития ишемического инсульта. Экономические потери, связанные с высокой частотой инсульта, требуют поиска стратегий, направленных на снижение уровней смертности и инвалидизации, то есть разработки эффективных профилактических мероприятий. Основной проблемой на этом пути является низкая медицинская активность населения, а также его недостаточное финансовое обеспечение. В основе первичной профилактики ишемических инсультов должна лежать популяционная социальная стратегия, связанная с разработкой государственной программы, направленной на достижение позитивных изменений у каждого человека в популяции посредством воздействия средств массовой информации, а также индивидуализированная первичная профилактика лиц из групп высокого риска по развитию инсульта.
Клиническая характеристика больных
Диагноз каротидного ишемического атеротромботического инсульта основывался на тщательном сборе анамнеза развития заболевания, исследовании соматического и неврологического статусов, данных клинико-инструментальных методов исследования.
Ишемический характер инсульта подтверждался клиническими критериями и МРТ головного мозга.
Атеротромботический вариант развития инсульта устанавливался на основании особенностей клиники развития заболевания, результатов ультразвуковой допплерографии и дуплексного сканирования магистральных артерий головы, исследований системы свертываемости и реологии крови, липидного спектра крови. При необходимости пациенты наблюдались терапевтом, эндокринологом, окулистом.
Все больные с момента поступления в клинику получали максимально унифицированную терапию. Базисная терапия включала в себя: гемодилюцию низкомолекулярными декстранами в объемах, зависящих от массы тела и тяжести состояния больных; противоотечные средства — MgS04 25% в зависимости от уровня артериальной гипертензии и выраженности общемозговых расстройств, осмотические диуретики по показаниям (маннитол 15% под контролем осмолярности плазмы крови); применение гипотензивных препаратов по показаниям (ингибиторы АПФ или блокаторы Са-каналов). С целью реперфузии всем пациентам назначались истинные антиагреганты (аспирин в дозе 125 мг/сут) и препараты с антиагрегантными свойствами (трентал 2% - 5 мл/сутки), прямые антикоагулянты при наличии показаний (гепарин в дозе 20000ЕД/сут при прогредиентном течении инсульта). В качестве нейропротективной терапии все пациенты получали препарат глицин (первые 10 дней 1000 мг/сут, в дальнейшем — 600 мг).
В качестве контроля использовалась группа славян из Московской популяции в количестве 50 человек, сравнимых по полу и возрасту с основной группой, без инсультов в анамнезе и согласно данным нейровизуализации (КТ или МРТ головного мозга). Все данные о группе контроля, включая образцы ДНК, были предоставлены Отделом Молекулярных Основ Генетики Человека ИМГРАН.
Результаты клинико-инструментального исследования пациентов
Все 80 пациентов (54 женщины, 26 мужчин) поступили в клинику в течение первых 12 часов с момента развития острого нарушения мозгового кровообращения.
Основным критерием включения больных в группу явился острый впервые развившийся ишемический атеротромботический инсульт в каротидной системе. Патогенетический вариант инсульта устанавливали на основании постепенного нарастания симптомов, отсутствия нарушений сердечного ритма, пороков клапанов сердца, атеросклеротического изменения спектра или стенозов при ультразвуковой допплерографии, степени атеросклеротического поражения магистральных артерий головы по данным дуплексного сканирования сосудов.
Анализ анамнестических данных выявил наличие
атеросклеротического поражения сосудов у 80 (100%) пациентов, подтвержденного дополнительными методами исследования. У 61 (76,3%) пациента наблюдалась ишемическая болезнь сердца, подтвержденная на основании жалоб, данных электрокардиографии и заключения кардиолога. 29 (36,3%) пациентов имели инфаркт миокарда в анамнезе.
У 12 (15%) пациентов были зарегистрированы нормальные цифры артериального давления. Остальные 68 (85%) пациентов страдали артериальной гипертензией не менее 5 лет, причем более половины из них не получали адекватной гипотензивной терапии. У 14 (17,5%) пациентов диагностирована злокачественная артериальная гипертензия выше 200/100 мм. рт. ст., не контролируемая гипотензивными препаратами. 12 (15%) пациентов страдали сахарным диабетом II типа в стадии компенсации и субкомпенсации и получали пероральные гипогликемические препараты. (37,5%) пациентов страдали ожирением разной степени тяжести.
У 10(12,5%о) пациентов развитию инсульта предшествовали транзиторные ишемические атаки в том же сосудистом бассейне.
![Ранняя двигательная реабилитация и структурно-перфузионные характеристики мозга при ишемическом инсульте [Электронный ресурс]](/i/i/4312/207173.png "Ранняя двигательная реабилитация и структурно-перфузионные характеристики мозга при ишемическом инсульте [Электронный ресурс] Умарова Роза Муратовна")