Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Метаболизм эстрогенов в организме 18
1.2. Современные концепции и механизмы гормонального канцерогенеза.21
1.2.1. Теория «усиленной гормональной стимуляции» 21
1.2.2. Гевотоксический вариант гормонального канцерогенеза 23
1.2.3. Прогестины: молекулярные механизмы контроля пролиферации иапоптоза гормоночувствительных тканей 24
1.2.4. Рак эндометрия в свете современных концепций канцерогенеза 26
1.3 Рецепция эстрогенов вэндометрии: классический и альтернативный пути активации эстроген пых рецепторов 27
1.4. Регуляция апоптоза и неоангиогенеза эстрогенами а эндометрии в норме и при патологии 30
1.5. Гонадный и экстрагонадный синтез эстрогенов у больных с гинерпластическими процессами и раком эндометрия 33
1.5.1. Эстрогенный профиль сыворотки крови у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия 33
1.5.2. Роль ароматазы и стероидсульфатазы в развитии предрака и рака эндометрия 37
1.5.3. Ароматазная активность в опухолях эндометрия: перспективы использования ингибиторов ароматазы в лечении больных раком эндометрин... 42
1.6. Ферменты метаболизма эстрогенов в эндометрии при гиперпластических процессах и раке .эндометрия 45
1.6.1 .Ферменты метаболизма эстрогенов при пшсрп.тсшческнх процессах эндометрия з
1.6.2. Роль ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе рака эндометрия 49
1.7. Особенности метаболизма и рецепции эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия в различные возрастные периоды 52
1.8. Роль ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе гиперпластических процессов и рака эндометрия, сочетающихся с миомой матки 57
1.8.1. Ферменты метаболизма эстрогенов и некоторые патогенетические аспекты гиперплазии эндометрия, сочетающейся с миомой матки 57
1.8.2. Роль ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе рака эндометрия, сочетающегося с миомой матки 62
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 65
2.1. Клиническая характеристика больных 69
2.2. Методы исследования 71
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 80
3.1. Особенности гормонального фона и уровень локальной продукции половых стероидов у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия 80
3.2. Рецепция половых стероидов у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия „85
3.2.1. Уровень рецепторов эстрогенов и прогестерона в гиперплазированном и малигнизированном эндометрии 85
3.2.2. Взаимосвязь уровней половых гормонов в системном и локальном маточном кровотоке с рецепцией половых стероидов в эндометрии 87
3.3. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в гиперплазированном и малигнизированном эндометрии
3.3.1. Взаимосвязь активности ферментов с кдишіко-морфологическими параметрами у больных с гиперпластическими процессами И раком эндометрия 89
3.3.2. Гормональный статус, рецепторы стероидных гормонов и активность ферментов метаболизма эстрогенов при гиперпластических процессах и раке эндометрия 103
3.3.3. Взаимосвязь между активностью ферментов метаболизма эстрогенов. апоптозом и неоангиогенезом в опухолях эндометрия
3.3.4. Прогностическая значимость показателей гормонального статуса. рецепторов стероидных гормонов и ферментов метаболизма эстрогенов у больных раком эндометрия.. 124
3.3.5. Патогенетическое обоснование и результаты комбинированной терапии рака эндометрия с использованием ингибиторов ароматазы 134
3.4. Особенности гормонального статуса и метаболизма эстрогенов у больных процессами и раком эндометрия в различные возрастные периоды 142
3.4.1 Уровень половых гормонов у больных с различной патологией эндометрия в зависимости от возрастного периода 142
3.4.2. Активность ферментов метаболизма эстрогенов а эндометрии у женщин различных возрастных периодов 145
3.4.3. Оценка риска развития рака эндометрия у больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные
3.5 Клиники -морфологические аспекты, метаболизм и рецепция эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрии ft сочетании с миомой матки 163
3.5.1. Юшнико-морфологические аспекты гиперпластических процессов и рака эндометрия в сочетании с миомой матки 163
3.5.2. Особенности рецепции и метаболизма эстрогенов у больных С гиперпластическими процессами и раком эндометрия в сочетании с миомой матки 170
3.5.3. Современная схема метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и раком эндометрия в сочетании с миомой матки 180
Заключение 184
Выводы .213
Практические рекомендации 216
Список литературы
- Рак эндометрия в свете современных концепций канцерогенеза
- Методы исследования
- Уровень рецепторов эстрогенов и прогестерона в гиперплазированном и малигнизированном эндометрии
- Оценка риска развития рака эндометрия у больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные
Введение к работе
доктор медицинских наук, Фролова И.Г.
Актуальность проблемы. Изучение различных аспектов патогенеза предрака и рака эндометрия (РЭ) является одной из актуальных задач онкогинекологии и обусловлено, прежде всего, неуклонным ростом заболеваемости этой патологии. В России за последние 20 лет заболеваемость РЭ увеличилась в 2 раза и составляет 12,6 случая на 100 тыс. населения [Чиссов В.И., 2002]. За последнее десятилетие в России заболеваемость гиперпластическими процессами эндометрия в репродуктивном и постменопаузальном возрасте не имеет тенденции к снижению, а в перименопаузе – значительно увеличилась [Савельева Г.М. с соавт., 1998, Чернуха Г.Е., 1999, Каппушева Л.М. с соавт., 2005,].
Проблема патогенеза гиперпластических процессов и РЭ в течение многих лет ассоциируется с развитием «эстрогенной теории» [Берштейн Л.М., 2000, Gulyaeva L.F. еt al., 2006]. Однако постоянно появляются новые данные, касающиеся вопросов синтеза эстрогенов, их транспорта, метаболизма и рецепции, заставляют считать, что данная проблема еще далека от своего разрешения. Особую актуальность представляют комплексные исследования по изучению роли рецепции и метаболизма эстрогенов в патогенезе гиперпластических процессов и РЭ, а также определению клинического и прогностического значения показателей, связанных с рецепцией и метаболизмом эстрогенов.
Многочисленные исследования показали, что эстрогены в большинстве случаев необходимы для возникновения гиперпластических процессов эндометрия, а также для инициации и поддержания роста злокачественных опухолей эндометрия [Гилязутдинова З.Ш., 1998, Берштейн Л.М., 2000, Вихляева Е.М., 2000, Савицкий Г.А. с соавт., 2000,Бохман Я.В., 2002, Bamberger A.M. et al., 1999]. По отношению к гиперпластическим процессам и РЭ в литературе обсуждается в основном пролиферативный эффект эстрогенов [Вихляева Е.М., 2000, Артымук Н.В. c соавт., 2004, Emos G. et al., 2000]. Вместе с тем доказан прямой генотоксический эффект метаболитов эстрогенов [Jan S.T. et al., 1998, Chakravarti D. et al., 2001, Cavalieri E.L. et al., 2002].
Особенности овариального и экстрагонадного метаболизма и рецепции женских половых гормонов в тканях-мишенях (эндометрий, миометрий) при участии ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, стероидсульфатазы, эстрогенгидроксилаз, катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) и глутатион-S-трансферазы (ГТ)), как предполагается, определяют возможность реализации в эндометрии как промоторного, так и генотоксического вариантов гормонального канцерогенеза. Поэтому, является актуальным изучение эстрогенного профиля сыворотки крови и уровня локальной продукции половых стероидов у больных с гиперпластическим процессами и РЭ, а также их анализ во взаимосвязи с активностью ферментов метаболизма эстрогенов.
В настоящее время канцерогенез рассматривается как многоступечатый процесс накопления различных генетических повреждений, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза, утрате способности к полной дифференцировке, инвазивному росту и метастазированию, тесно связанных с неоангиогенезом [Лихтенштейн А.В., 1998, Фильченков А.А., 1998, Белушкина Н.Н. с соавт., 2001, Лушников Е.Ф., 2001, Копнин Б.П., 2002, Lundenberg A.S. et al., 1999]. Поэтому особую актуальность представляют исследования, посвященные изучению активности ферментов метаболизма эстрогенов во взаимосвязи с экспрессией белков - регуляторов клеточного цикла, апоптоза и неоангиогененеза в малигнизированном эндометрии для понимания их роли в патогенезе РЭ.
Значительный интерес вызывают исследования, в которых оценивается влияние ингибиторов ароматазы на опухолевый рост. В исследованиях in vitro выявлен антипролиферативный эффект ингибиторов ароматазы в отношении злокачественных опухолей эндометрия и яичников [Yamamoto T., 1990, Sasano H. et al., 1999]. Клинические исследования по использованию ингибиторов ароматазы в комплексном лечении больных РЭ единичны, что не позволяет сделать корректные выводы об их эффективности [Rose P.G. et al., 2000, Mo B.Y. et al., 2004, Berstein L. M. et al., 2005]. Однако являются перспективными дальнейшие клинические исследования по изучению эффективности современных ингибиторов ароматазы в лечении РЭ с учетом данных по активности этого фермента в тканях опухолей.
Вторичная профилактика РЭ является актуальным направлением в снижении заболеваемости и смертности от РЭ. Перспективным направлением в решении этой проблемы является объективное формирование групп повышенного онкологического риска, прежде всего, среди больных с различными гиперпластическими процессами эндометрия [Чернуха Г.Е., 1999, Бохман Я.В., 2002, Чернышова А.Л., 2002, Артымук Н.В. с соавт., 2004, Ашрафян Л.А. с соавт., 2004, Берштейн Л.М., 2004, Маликова Л.В., 2005,]. Гиперпластические процессы и РЭ в репродуктивном возрасте традиционно ассоциируются с нарушением овуляции, хронической гиперэстрогенемией, бесплодием, миомой матки, генитальным эндометриозом, часто с гиперандрогенемией в сочетании с ожирением и гиперинсулинемией. [Берштейн Л.М., 2000, 2004, Бахидзе Е.В. с соавт., 2002, Бохман Я.В. 2002, Чулкова О.В., 2003]. Вопросы патогенеза гиперпластических процессов и РЭ в перименопаузе менее изучены. В постменопаузе развитие патологии эндометрия часто связано с усилением экстрагонадного синтеза эстрогенов в периферических тканях и тканях-мишенях [Берштейн Л.М., 2004]. Предполагаемая роль ферментов метаболизма эстрогенов в развитии гиперпластических процессов и РЭ в репродуктивном и перименопаузальном периоде до настоящего времени не определена, хотя в ряде исследований подчеркивается значимость состояния менструальной функции для интерпретации данных по активности этих ферментов, а также данных по образованию основных гидроксилированных эстрогенных метаболитов [Xu X. et al., 1999, Tworoger S. et al., 2004].
Недостаточно изученной остается роль половых гормонов, их рецепторов и ферментов метаболизма эстрогенов в прогнозе РЭ. Традиционно в качестве прогностических факторов при РЭ используют клинические и морфологические критерии [Бокина Л.И., 1998, Баринов В.В., 1999, Захарцева Л.М. c соавт., 2001, Козаченко В.П., 2005, Brit J.M. et al., 2005]. Однако многообразие форм и патогенетических вариантов РЭ заставляет искать новые биохимические и молекулярно-генетические факторы прогноза. Высока прогностическая значимость наличия в опухолях PR [Самсонова Е.А. с соавт., 2004, Fukuda K., 1998]. Среди молекулярно-генетических маркеров обсуждается прогностическая значимость Bax, Bcl-2, p53, Ki67 и маркеров неоангиогенеза [Chieng D.C. et al., 1996, Giatromanolaki A. et al., 2001, Piero G. et al., 2001, Veral A. et al., 2002, Osmanagaoglu M.A. et al., 2005]. Данные о прогностической значимости ферментов метаболизма эстрогенов немногочисленны. Есть сведения о том, что экспрессия ароматазы в стромальных, но не эпителиальных клетках аденокарцином эндометрия позитивно коррелировала с запущенностью и плохим прогнозом [Segawa T.et al., 2005].
Высокая встречаемость гиперпластических процессов и РЭ в сочетании с миомой матки диктует необходимость изучения патогенетических особенностей этой сочетанной патологии [Вихляева Е.М., 2000, Гаврилов А.С. c соавт., 2002, Мамедбекова Р.Б., 2003, Studzinski Z. et al., 2000, Koshiyama M. et al., 2001]. В настоящее время не изучены уровень половых гормонов, рецепторов к ним, а также активность ферментов метаболизма эстрогенов в гиперплазированном и малигнизированном эндометрии и миоматозных узлах у больных с гиперплазией и РЭ в сочетании с миомой матки, а онкологические аспекты проблемы не акцентированы. Сведения об уровне половых гормонах у данной категории больных немногочисленны и требуют детализации с учетом менопаузального статуса и морфологического состояния эндометрия [Савицкий Г.А. с соавт. 2000].
Все вышесказанное определяет актуальность исследования, которое позволило выявить участие рецепторов эстрогенов и прогестерона и ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе пролиферативных процессов эндометрия, оценке онкологического риска у больных с гиперпластическими процессами и и прогнозе течения РЭ.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось комплексное изучение роли рецепции и метаболизма эстрогенов в патогенезе гиперпластических процессов и РЭ, а также определение клинического и прогностического значения изучаемых показателей.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Оценить особенности гормонального фона, рецепции эстрогенов и прогестерона, а также уровень локальной продукции половых стероидов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ.
-
Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов во взаимосвязи с клинико-морфологическими, гормональными параметрами и уровнем рецепторов стероидных гормонов у больных исследованных групп.
-
Оценить активность ферментов метаболизма эстрогенов во взаимосвязи с экспрессией про- и антиапоптотических белков и неоангиогенезом в опухолях эндометрия.
-
Изучить прогностическую значимость гормональных параметров, рецепторов стероидных гормонов и ферментов метаболизма эстрогенов у больных РЭ.
-
Разработать патогенетическое обоснование использования ингибиторов ароматазы в комплексном лечении резектабельных форм РЭ.
-
Изучить особенности гормонального статуса и метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в различные возрастные периоды.
-
Создать математическую модель для оценки риска развития РЭ у больных с гиперпластическими процессами эндометрия с учетом возрастного периода и факторов, ассоциированных с рецепцией и метаболизмом эстрогенов.
-
Изучить особенности рецепции и метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой и без миомы матки.
-
Разработать новую схему метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой матки.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное исследование рецепции и метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ. Исследован уровень рецепторов стероидных гормонов и активность ферментов метаболизма эстрогенов в эндометрии во взаимосвязи с уровнем половых гормонов в системном и локальном маточном кровотоке. Выявлено что, активность ароматазы в гиперплазированном эндометрии коррелировала с уровнем РR, уровнем эстрадиола и глобулина, связывающего половые стероиды (SHBG) в сыворотке крови, а активность ГТ - с SHBG. Активность стероидсульфатазы в опухолях эндометрия коррелировала с уровнем ER и эстрона в локальном маточном кровотоке, с уровнем эстрона и эстрадиола в сыворотке крови, активность КОМТ – с уровнем прогестерона в локальном маточном кровотоке, активность ГТ с уровнем прогестерона и SHBG в сыворотке крови.
Впервые с помощью наиболее прогностически значимых клинических показателей, гормональных параметров, данных по рецепторному статусу и активности ферментов метаболизма эстрогенов разработана математическая модель в виде формулы для прогноза онкологического риска у больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные периоды.
Получены новые данные о наличии взаимосвязи между экспрессий антиапоптотического белка Bcl-2, неоангиогенезом и активностью стероид сульфатазы в опухолях эндометрия. Вне зависимости от наличия или отсутствия мутантного р53 в Bcl-2-позитивных опухолях в 72,2% выявлялась высокоразвитая сеть кровеносных сосудов, а в Bcl-2-негативных опухолях в 75% - низкая плотность сосудов. В Bcl-2-позитивных опухолях активность стероидсульфатазы была значимо выше по сравнению с Bcl-2-негативными опухолями. В опухолях со слабым кровоснабжением активность стероидсульфатазы была статистически ниже по сравнению с опухолями с умеренным и высоким кровоснабжением.
Впервые выявлено, что активность ароматазы и КОМТ в ткани рака эндометрия являются прогностически значимыми факторами для больных РЭ. Высокая активность ферментов связана с низкой безрецидивной выживаемостью.
Впервые показано, что больные с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой матки имеют особенности в метаболизме эстрогенов. У больных с гиперпластическими процессами и РЭ с миомой матки доминирует ароматаза-зависимый путь синтеза эстрогенов в сочетании с высокой активностью ГТ в эндометрии, а у больных без миомы матки – стероидсульфатаза-зависимый путь в сочетании с низкой активностью ГТ. Впервые представлена схема, характеризующая пути образования и основные эффекты эстрогенов и их гидроксилированных метаболитов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой матки.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные результаты исследования позволяют расширить теоретические представления о роли рецепции и метаболизма эстрогенов при гиперпластических процессах и РЭ.
Выявлены особенности метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в различные возрастные периоды. Одним из значимых аспектов в патогенезе РЭ в репродуктивном возрасте и перименопаузе является повышение активности КОМТ и суммарной эстрогенгидроксилазной активности в малигнизированном эндометрии по сравнению с нормальной тканью. Выраженная гипопрогестеронемия и сниженный уровень SHBG являются значимыми в развитии РЭ у больных в перименопаузе. У больных в постменопаузе в патогенезе РЭ играет значение повышение интенсивности как ароматаза-зависимого, так и стероидсульфатаза-зависимого пути локального синтеза эстрогенов.
Полученные результаты формируют новые представления о механизмах синтеза и метаболизма эстрогенов у больных с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой матки с выявлением 4 основных источников синтеза эстрогенов (жировая ткань, миометрий, миоматозные узлы, эндометрий).
Разработанная математическая модель позволяет формировать группы повышенного онкологического риска среди больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные периоды. Чувствительность разработанной модели в различные возрастные периоды составляет от 80 до 92%, специфичность – от 83 до 90%.
С учетом выявленных новых объективных гормонально-биохимических прогностических факторов возможно разработка индивидуального прогноза для больных РЭ и выбора индивидуальной тактики лечения.
Патогенетически обоснован и апробирован новый комплексный метод лечения резектабельных форм РЭ с включением в схему адьювантной гормонотерапии ингибитора ароматазы анастразола. Сформулированы показания к применению разработанного метода лечения. Оценка его эффективности показала достоверное повышение двухлетней безрецидивной выживаемости по сравнению с контрольной группой при сохранении высокого уровня качества жизни.
Положения, выносимые на защиту
-
При гиперпластических процессах эндометрия активация синтеза эстрогенов в эндометрии не сопровождается повышением их биотрансформации и не связана с уровнем половых стероидов в локальном маточном кровотоке. В злокачественных опухолях эндометрия усиленный синтез эстрогенов за счет повышения активности ароматазы сопровождается повышением активности ферментов II фазы биотрансформации – КОМТ и ГТ, и зависит от уровня половых стероидов в локальном маточном кровотоке
-
Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолях эндометрия зависит от стадии опухолевого процесса и гистологического типа. Уровень эстрадиола, активность внутриопухолевой ароматазы и КОМТ являются прогностически значимыми факторами в отношении двухлетней безрецидивной выживаемости при РЭ.
-
Использование прогностически наиболее значимых клинико-анамнестических показателей, гормональных параметров, данных по рецепторному статусу и активности ферментов метаболизма эстрогенов дает возможность определить риск развития РЭ у больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные периоды.
-
У больных с гиперпластическими процессами и РЭ в сочетании с миомой матки наблюдается активация ароматаза-зависимого пути синтеза эстрогенов в эндометрии, миометрии и миоматозных узлах, которая сопровождается повышением активности ГТ. У больных без миомы матки усиление синтеза эстрогенов просходит, главным образом, за счет активации стероидсульфатаза-зависимого пути синтеза эстрогенов и сопровождается снижением активности ГТ в эндометрии.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на всероссийской научно-практической конференции «Рак репродуктивных органов: профилактика, диагностика, лечение», Томск, 2002; на всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы онкоурологии и онкогинекологии», Барнаул, 2002; на всероссийской конференции «Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии», Томск 2003; на всероссийской конференции «Актуальные проблемы лабораторной медицины», Томск 2003; на X национальном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; на V Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке», Томск 2004; на III Съезде онкологов СНГ, Минск, 2004; на всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2004; на региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкогинекологии», Кемерово, 2004; на научно-практической конференции «Экстрагенитальная патология и репродуктивное здоровье женщин», Томск, 2004; 14th international meeeting of the ESGO, Istanbul, 2005; на международном симпозиуме “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки”, Тюмень, 2005; на 9-ой Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии», Ленинск-Кузнецкий, 2005; International meeting “Endocrine treatmeant, prevention of breast and gynaecological cancers”, Brussels, 2006, на 10-ой Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии», Ленинск-Кузнецкий, 2006.
Публикации
Основные результаты диссертации опубликованы в 37 печатных работах, в том числе 13 статей в отечественных реферируемых журналах, 10 из которых - в рекомендованных ВАК изданиях. Материалы исследования использованы при написании монографии «Клинико-морфо-биохимические аспекты гиперпластических процессов и рака эндометрия» (Коломиец Л.А., Чернышова А.Л., Крицкая Н.Г., Бочкарева Н.В, 2003).
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в учебном процессе для студентов и клинических ординаторов при изучении вопросов, посвященных патогенетическим аспектам и терапии гиперпластических процессов и РЭ, на кафедре акушерства и гинекологии ФУС СГМУ, а также внедрены в работу онкогинекологического отделения НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН и ГУ НИИ акушерства, гинекологии и перинаталогии ТНЦ СО РАМН для объективизации формирования групп повышенного онкологического риска по РЭ и уточнения прогноза у больных РЭ. Получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение «Способ комплексного лечения резектабельных форм рака эндометрия» N2005130582 от 03.10. 2005.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 251 странице и иллюстрирована 18 рисунками и 26 таблицами. Библиография включает 293 литературных источника, из которых 122 отечественных и 171 иностранный.
Рак эндометрия в свете современных концепций канцерогенеза
Эстрогены - стероидные гормоны, вырабатываемые, в основном, яичниками, играют ключевую роль в установлении и поддержании нормальной репродуктивной функции. Кроме того, доказана их физиологическая роль в функционировании сердечно-сосудистой системы. развитии и укреплении костной и мышечной ткани, в нейро-эндокринной регуляции [49]. Небольшое количество эстрадиола вырабатывается и у мужчин и у женщин в мозговом слое надпочечников [22]. Эндогенные эстрогены - эстрадиол, эстрон и эстриол по своей химической структуре являются С18-производными холестерола. Основным источником эстрадиола в преме но паузальном периоде являются тека-ткань и клетки гранулезы яичника. В соответствии с «двух-клеточной теорией» тека-ткань секретирует андрогены. которые диффундируют в гра ну лезу и там происходит их превращение в эстрогены при участии фермента ароматазы. Существуют данные о том, что оба типа клеток обладают способностью синтезировать и эстрогены и андрогены. Ароматаза выявлена во многих тканях и органах - в жировой и костной тканях, в мышцах, в мозге, в молочной железе и эндометрии, но значение так называемого экстрагонадного синтеза эстрогенов у менструирующих женщин, по-видимому. не велико. Ежедневно в норме в организме женщины вырабатывается сотни микрограмм эстрадиола. Это примерно (8 молекул, которые «находят» свои рецепторы в ядрах и цитоплазме клеток. В течение менструального цикла отмечается цикличность а продукции эстрадиола, наивысшая концентрация эстрадиола отмечается в преовуляторяой фазе [163].
У женщин в постменопаузе наряду с угасанием синтеза эстрадиола в яичниках, активизируется синтез эстрогенов, преимущественно эстрона, в периферических тканях при участии ферментов ароматазы и стероидсульфатазы. Последний фермент осуществляет отщеплением сульфогруппы от неактивного эстрон сульфата и превращает его в активный эстрон. Фермент широко представлен в организме и выявлен в эндометрии, миоэпителиальных клетках молочной железы, в коже, в остеобластах, в лейкоцитах и тромбоцитах [231]. Синтезированный в результате ферментативных реакций эстрон называют также и ост м єно паузальным эстрогеном. Эстрогенный потенциал эстрона почти в 5 раз ниже эстрадиола. Минорный эстроген эстриол синтезируется в основном во время берем е н н о сти с и н ц итиотро фоб ластом.
В сыворотке крови эстрадиол находится в основном в связи с транспортными белками - глобулином, связывающим половые стероиды (SHBG) и альбумином. Оба транспортных белка синтезируются в печени. Синтез SHBG является эстроген-зависимым [52]. Свободная фракция эстрадиола (не более 2-3%) является биологически активной. Эстрон практически не связывается с транспортными белками и его транспортной формой в сыворотке крови является эстрон сульфат. Определенный баланс между эстрадиолом и эстроном в периферических тканях регулируется семейством тканевых ферментов под названием Пр-стероиддегидрогеназы.
Существуют 2 пути метаболизма эстрогенов (рис. 1). Первый путь включает сульфатированне и глюкуронидацию эстрогенов при участии ферментов стероидсульфотрансферазы и S аденозилглюкуронилтрансферазы. Этот путь преимущественно осуществляется в печени Образующиеся коньюгаты выводятся из организма с желчью и мочой.
Второй путь метаболизма эстрогенов включает гидроксилирование при участии иитохром Р 4 50 -содержащих эстроген гидроксилаз (CYP1A1, CYP1A2, CYPIBI, CYP3, CYP3A) и последующее метилирование при участии КОМТ с образованием метокеилированных метаболитов эстрогенов
Основные пути синтеза, транспорта и метаболизма эстрогенов в организме. [167, 237]. Метоксиэстрогены не обладают эстрогенной активностью и хорошо выводятся с мочой. Образующиеся при гидроксилировании эстрадиолз и эстрона во втором и четвертом положении метаболиты эстрогенов по химической структуре являются катеколэстрогенами. Возможно ферментативное и неферментативное окисление катехолэстрогенов до катехолэстроген орто-хинонов. Высокореакционноспособные орто-хиионы способны формировать комплексы с глутатионом при участии фермента ГТ [145]. Такие комплексы химически инертны и водорастворимы. Этот путь метаболизма в основном характерен для периферических тканей и органов-мишеней, хотя интенсивность гидроксилирования эстрогенов в печени у человека так же значительна.
Таким образом, формирование комплексов эстрогенов с сульфатами. глюкуронидами, метоксилирование и формирование коньюгатов эстрогенных метаболитов с глутатионом является значимыми путями ограничения эстрогенных эффектов в тканях и органах-мишенях. SHBG обеспечивает определенный резерв эстрадиола, и обладая относительно высокой способностью к связыванию, выполняет роль буфера, противостоящего резким колебаниям уровня гормона в крови [22].
Методы исследования
Традиционно развитие гиперпластических процессов эндометрия ассоциировалось с гиперкетрогенемией Одной из функций поступающих из крови и синтезированных in situ (при участии ароматазы и стероидсульфатазы) эстрогенов является стимуляция пролиферации эндометрия. Этот эффект зависит от наличия в ткани ER. Кроме того. эстрогены могут метаболизироваться непосредственно в эндометрии при участии 2- и 4-эстрогенгидроксилаз. превращаясь в катехолэстрогены. Эстрогены также могут подвергаться гидроксилированию в 16 положении. 16-гидро кс и метаболиты эстрогенов по суммарному эстрогенному потенциалу превосходят эстрадной. Дальнейший метаболизм катехол эстрогенов протекает с участием КОМТ и ГТ с образованием неактивных и немутагенных производных. При недостаточной активности этих трансфераз, возможно 2 варианта развития событий.
Первый из них заключается в том. что пролиферативный эффект эстрогенов усиливается катехолэстрогенами и 16-гидроксиметаболитами. Во втором варианте под действием пероксида І катехолЭСтрогены превращаются в катехол эстроген орто-хиноны. которые обладают генотоксическим эффектом и могут вызывать онкогенные мутации. Предполагают, что первый путь типичен для гиперпластических процессов эндометрия. Для злокачественных новообразовании эндометрия, вероятно. возможна реализация обоих метаболических вариантов [13, 19, 145. 151].
В эндометрии эстроген 2-гидро кс ил аз пая активность в основном определяется активностью цитохрома CYP1AI. а эстроген 4-гидроксилазиая - CYP1B1. CYP1A2, CYP2B1/B2 и CYP3A, причем основной эстроген 4-гидроксилазой является CYPIBI [44, 131. 175. 262]. Данные о регуляции эстроген г и дроке плаз в эндометрии весьма немногочисленны Так выявлено, что бензпиреном индуцируется только CYP1A1, а индол-3-карбинол ингибируетСУРІВІ и индуцируетCYP1A1 [131. 184].
Необходимо отметить, что 4-гидро кс и метаболиты эстрогенов намного более канцерогенны, чем 2-гидрокси метаболиты. Высокая канцерогени ость 4-гидроксиэстрадиола может быть объяснена высокой потенциальной генотоксичностью его метаболитов {катехол эстроген орто-хинонов). высокой гормональной активностью, сравнимой с эстрадиолом. и способностью индуцировать неоангиогенез. Показано. что в гормонозависимых тканях 2-гндроксиироитодиые эстрогенов подавляют О-метилирование 4-пщроксипроизводных эстрогенов [236. 290].
2-гидроксиэстрогены обладают более слабой гормональной активностью и не являются ангиогениыми агентами. Кроме того, показано, что 2-метоксиэстрадиол - продукт ферментативного метилирования 2-гидрокси эстрад иол а - эффективно подавляет опухолевый рост и неоангиогенез экспериментальных опухолей молочной железы [183]. Потенциальная генотоксичность 2-гидроксиэстрогенов реализуется слабо. поскольку они имеют высокое сродство к КОМТ. Формирующиеся при участии КОМТ. 2-метоксиэстрогены имеют высокий клиренс и быстро выводятся из тканей, а в сыворотке крови они имеют высокое сродство к SHBG [203. 288. 289. 290]. В эндометрии путь 4-гидроксшшрования значительно доминирует над 2-гидроксилированием. как и во многих других тканях за исключением печени, в связи с чем возрастает роль коньюгируюших ферментов - КОМТ и ГГ.
Оба являются чрезвычайно распространенными тканевыми ферментами, катализирующими широкий спектр ферментативных реакций. Ферменты локализуются преимущественно в цитоплазме. Для КОМТ основными субстратами являются катехоламины и катехолэстрогены. а основными регуляторами активности фермента - катехол амины. 2-мето кс и эстрогены, фолаты и гомоцистеин [289] В исследовании ВТ. Zhu et al. (1993) показано, что в матке и в молочных железах концентрация катехоламинов выше, чем в других тканях почти в 50 раз. Высокие концентрации катехоламинов в матке конкурентно ингибируют активность КОМТ в отношении кате\о. п :їр\ іов. что. но-видимому, может привести к повышению концентрации 2- и 4-гидроксилнроваиных эстрогенов [291]. Выявлены определенные ассоциации генотипа КОМТ (Met/Met). кодирующего термолабильный фермент с низкой активностью, с повышенным уровнем экскреции 2-й 1 б-гидроксиэстрогенов среди женщин в постменопаузе, что представляется особенно актуальным, поскольку пик развития и атипичной гиперплазии, и РЭ приходится на постменопаузу [272].
Роль ограничении генотоксических эффектов эстрогенных метаболитов многообразна. Во-первых, при ее участии формируются комплексы катехолэстроген орто-хинонов с глутатионом, что делает их химически инертными [58]. Во-вторых. ГТ эффективно связывая катехолэстроген орто-хиноны. существенно ограничивает генерирование активных форм кислорода в процессе редокс-циклизации хинонов до семихиконов при участии хинонредуктазы. При отсутствии ограничения этих процессов активные формы кислорода при взаимодействии с липидами мембран формируют липоперекиси. Сами липоперекиси значительно усиливают процесс НАДФН-независимого кеферментативного окисления катехолэстрогенов до катехолэстроген орто-хинонов [145. 151].
Кроме того, в последнее время в литературе появились новые данные о том, что катехолэстроген орто-хиноны в присутствии ионов двухвалентной меди и НАДФН индуцируют так называемые альдегидные повреждения ДНК. Было показано, что в 70% случаев эти повреждения ассоциировались с окислительной модификацией дезоксирибозы. Оставшиеся повреждения приходились на формирование апуриновых и апиримидиновых фрагментов ДНК. окислительные модификации оснований и однонитевые разрывы ДНК [196] Таким образом, в гормонозавнеимых тканях ГТ регулирует несколько каскадов ферментативных и неферментативных реакций, существенно ограничивая повреждения ДНК. липидов и других макромолекул эстрогенными метаболитами.
В настоящее время известно 8 классов цитозольных ГТ. Содержание ГТ в клетке составляет около 10% суммарного клеточного белка. ГТ имеют определенную тканевую специфичность. Выявлена гормональная регуляция уровня восстановленного глутатиона - кофактора ГТ - в ткани нормальной молочной железы [152]. В эндометрии в основном доминируют ГТ
Уровень рецепторов эстрогенов и прогестерона в гиперплазированном и малигнизированном эндометрии
Определение активности ароматазы
Активность ароматазы оценивалась по образованию тяжелой воды из меченного тритием в 1 р-положенил андроетендиона в описанной ранее модификации [20. 62]. Образцы эндометрия, миометрия и миомы матки (около 80 мг). гомогенизировали В жидком азоте до порошкообразного состояния. Порошок экстрагировали 5-кратным объемом 12.5 шМ калий-фосфатного буфера с ImM ЭДТА (рН=7.5) Гомогенат центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин и 4С. Надоеадок использовали для определения активности ароматазы радиометрическим методом. Использованный в методике [ір-3Н]-андросгендиоіі с молярной радиоактивностью не менее 30 Ci/mmol был синтезирован в лаборатории изотопного обмена Института Молекулярной Генетики РАН (г.Москва) по оригинальной методике [! 17]. Счет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). В методике использовали сцинтилляционный коктейль EcoLume ("ICN", США). Активность фермента рассчитывали с учетом молярной радиоактивности меченного андростендиона, времени инкубации и концентрации белка в супернатанте. Активность ароматазы выражали в фмоль андростендиона/мг белка в час.
Определение активности стероидсульфатазы
Активности стероидсульфатазы оценивали радиометрическим методом [133]. Принцип метода основан на количественном определении образующегося в ферментативной реакции меченного эстрона из меченного тритием эстрон сульфата. Для определения активности стероидсульфатазы образцы эндометрия (около 50 мг) гомогенизировали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Порошок экстрагировали 6-кратиым объемом SOmM Na-фосфатного буфера (рН=7,0). Гомогенат центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин и 4С. Надосадок использовали для определения активности фермента Использованный в методике [3Н]-эстрон сульфат с молярной радиактивностью не менее 70 СІ/mmol был синтезирован в лаборатории изотопного обмена Института Молекулярной Генетики РАН (г.Москва) по методу Ranadive G.N. еї al. (1998) [230]. Активность стероидсульфатазы в пробе пересчитывали с учетом молярной радиоактивности эстрон сульфата, концентрации белка и времени инкубации. Активность фермента выражали в фмоль эстрон сульфата/мг белка в час .
Определение суи.шірін і/ икінішікіспиі 2. 4- іеінрогеисидроксилаз.
Суммарную активность 2/4- эстроген ги дрокси л аз определяли радиоферментативным методом по С. N. Theron (1986) [271], Для определения активности образцы эндометрия (около 110-120 мг) гомогенизировали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Порошок экстрагировали 8-кратным объемом 50mM Tris-HCI буфера (рН=8,0). Из гомогената методом дифференциального центрифугирования получали микросомальную фракцию [71]. Микросомы ресуснендировали в 50гаМ Tris-HCI буфере (рН=8,0) и определяли концентрацию белка по Лоури. Концентрация белка в суспензии не должна была превышать 1-2 г/л. Около 100 ці суспензии микросом брали в инкубационную среду. В качестве субстрата ферментативной реакции использовали I 7[}-эстрадиол ("Sigma") в конечной концентрации 40 пМ.
В методике C.N, Theron et al. продукты эстроген гидроксилазных реакций катехолэстрогены превращались в стабильные, меченные тритием 2-и 4-метокси.эстрогены при участии экзогенной КОМТ ("Sigma") и S-аденозил-[ Н-метнл]-метионина (молярная радиоактивность 15.0 Ci/mmol. "Amersham Biosciences") в качестве донора метил ьной группы. Радиоактивные метоксиэстрогены экстрагировались из инкубационной смеси N-гептаном (Россия). Гептановый экстракт выпаривали на песчаной бане. добавляли сцинтилляционный коктейль EcoLume (" ICN"". США) и производили подсчет радиоактивности.
Активность эстроген-2/ 4-гидроксилаз в пробе пересчитывали с учетом молярной радиоактивности 8-аденозил-[1Н-метил]-метионина. концентрации белка в суспензии микросом и времени инкубации. Суммарную 2/4 эстрогенгидроксилазную активность выражали в пмоль метоксизстрої еиов/мг белка в час.
Определеим икпитшн-ти катехої-О-иетштранферазьі (КОМТ).
Активность КОМТ в эндометрии определяли радиометрическим методом [293]. Для определения активности фермента образцы эндометрия (около 40-50 мг) гомогенизировали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Порошок экстрагировали 9-кратным объемом 50тМ К-фосфатного буфера с 0.5 тМ дитиотрейтола (рН=7.6). Гомогенат це нтри фугировал и ЗО минут при 17000 об/мин и 4НС. Надосадок использовали для определения активности КОМТ.
Радиометрический метод определения активности КОМТ основан на количественном определении [ Н]гваякола, который формируется при ферментативном метилировании пнрокатехола ("Sigma") в присутствии ионов магния, аденозин деаминазы ("Fluka"). д йти отре и тол a ("Sigma") и S аденозил-[ Н-метил]метиошіна (молярная радиоактивность 15.0 Ci/mmol. "Amersham Biosciences") в качестве донора метальной группы. Меченный гваякол экстрагировали из инкубационной смеси сцинтилляционной жидкостью. Для приготовления оригинальной сцинтилляционной жидкости 5г 2-(4 -іеіТ-бутилфенил)-5-(4"-дифенил)-1,3.4-оксдиазола ("Fluka") растворяли в 200мл толуола (Россия), после растворения порошка добавляли 800 мл N-гептана (Россия) а перемешивали Белок определяли по Лоури. Активность КОМТ в пробе пересчитывали с учетом молярной радиоактивности Б-аденознл- Н-метшт метионина. концентрации белка и времени инкубации. Ферментативную активность выражали в мкмоль гваякола/мг белка в час.
Оценка риска развития рака эндометрия у больных с гиперпластическими процессами эндометрия в различные возрастные
Основными регуляторами активности ароматазы в различных тканях, в том числе и в опухолях, являются интерлейкины, простагландин Е2 и андрогены, уровень которых не научался в нашем исследовании. Однако нами выявлено, что в ГШерЕдазйровШНШ эндометрии активность ароматазы коррелировала с уровнем эстрадиола и SHBG в сыворотке крови, что свидетельствует об определенных особенностях гормональной регуляции в нормальном, атрофнчном, гиперплазированном и малигннзированном эндометрии.
Рядом исследовании покакшо. что активность стероидсульфатазы в тканях регулируется соотношением эстрона, эстрон сульфата и эпиандростерона сульфата в сыворотке крови [265, 231]. В нашем исследовании выявлено, что активность стероидсульфатазы в нормальном и измененном эндометрии коррелирует с целым рядом гормональных параметров: с уровнем общего эстрадиола и его свободной фракцией (ИСЭ), с уровнем эстрона как в системном, так и локальном маточном кровотоке.
Известно, что основными регуляторами активности КОМТ являются катехоламины, метокенэстрогены, фолаты и гомоцистеин [203, 289]. Нами выявлено, что уровень прогестерона в локальном маточном кровотоке также связан с активностью КОМТ в опухоли у больных РЭ. Эти результаты созвучны ранее полученным данным об индукции КОМТ в эндометрии и миометрии прогестероном [180].
При анализе корреляций между активностью ферментов метаболизма эстрогенов и клинико-морфологическими параметрами выявлено, что активность ГТ в эндометрии в контрольной группе коррелировала с наличием артериальной гипертонии, а у больных РЭ - с рядом параметров: наличием избыточной массы тела, доброкачественных опухолей и киетозных образований яичников, артериальной гипертонии. Выявлена зависимость между активностью ГТ в опухоли В стадией заболевания, а также глубиной инвазии опухоли в миометрии. При анализе гормональных параметров выявлено, что активность ГТ во всех клинических группах коррелировала с уровнем SHBG в сыворотке крови, а у больных РЭ - с уровнем прогестерона.
Полученные данные свидетельствуют о весьма многообразной и сложной регуляции активности ГТ в эндометрии в норме и патологии. Такие результаты, по-видимому, свидетельствуют о том, что фермент является ключевым в метаболизме эстрогенов. Высокая значимость ГТ в формировании различной патологии эндометрия обусловлена и тем, что субстратная специфичность данного фермента достаточно низкая. Фермент эффективно коньюгирует с гдутатионом не только катехолэстроген орто-хиноны. но и различные эпоксиды. ареноксиды. хиноны. андростендион. галогенированные арил-и алкилуглеводороды [58. 99. 132, 148. 229]. Таким образом, ГТ в эндометрии участвует не только в эстроген-индуцированном. но и в химическом канцерогенезе.
Не выявлено корреляционных взаимосвязей между уровнем рецепторов стероидных гормонов и активностью ферментов метаболизма эстрогенов в контрольной группе. У больных РЭ активность стероидсульфатазы коррелировала с уровнем ER в опухоли (г=0,369, р=0,048). У больных с гнпер пластическим и процессами эндометрия активность ароматазы коррелировала с уровнем PR (г=-0.433. р=0.040).
Таким образом, полученные данные выявили, что активность ферментов метаболизма эстрогенов в нормальном. атрофичном. гиперплазированном и малигнизированном эндометрии коррелирует с рядом гормональных параметров, в том числе и с уровнем половых стероидов в локальном маточном кровотоке. В ги п ерп лаз и ро ванном и малигнизированном эндометрии активность ферментов синтеза эстрогенов связана с уровнем рецепторов стероидных гормонов.
Проблема патогенеза предрака и РЭ в течение многих лет ассоциируется с развитием "эстрогенной теории". Важное значение в модуляции эстроген но го сигнала в эндометрии придается ферментам метаболизма эстрогенов. В настоящее время канцерогенез рассматривается как многоступенчатый процесс накопления различных генетических повреждений, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза. утрате способности к полной дифференцировке. инвазивному росту и метастазированню. тесно связанному с неоангиогенезом [54]. Поэтому для выяснения механизмов патогенеза РЭ актуальными являются исследования, посвященные изучению активности ферментов метаболизма эстрогенов во взаимосвязи с экспрессией белков - регуляторов клеточного цикла, апоптоза. пролиферации и неоангиогененеза в малигнизированном эндометрии Для решения поставленной задачи проведено иммуногистохимическое исследование опухолей эндометрия совместно с оценкой в них активности ферментов метаболизма эстрогенов. Обследована 31 больная РЭ. Средний возраст пациенток составил 58,1±2,1 лет. Иммуногистохимические исследования м определение активности ферментов выполнено у больных РЭ. которые в основном находились в постменопаузе (68%). 29% пациенток были перименопау зального возраста. 3% - в репродуктивном возрасте. Доминировали пациентки с 1 стадией заболевания (60%). 35% - имели II стадию заболевания. По гистотипу преобладали эндометриоидные карциномы, причем в подавляющем большинстве они были умеренно- и низкодифференпированиымн Клинико-морфологическая характеристика обследованных больных РЭ представлена в таблице 12.
В опухолях эндометрия изучена экспрессия онкосупрессорного протеина р53. про- и антиапоптотических белков Вах и Bcl-2. а также ER и PR. Оценка ангиогенеза в опухоли проводилась путем подсчета количества
