Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Современные тенденции в развитии исследования рака гортани и маркеры, ассоциированные с данной патологией.
Введение 9
Предопухолевые заболевания гортани 10
Рак гортани: элементы эпидемиологии и этиология 14
Влияние алкоголя и канцерогенов табака 15
Влияние вирусной инфекции 16
Влияние пола на особенности возникновения РГ 19
1.4 Значимость наследственных факторов при развитии рака гортани, 20
1.4.1 Полиморфизм генов глутатион-5-трансферазы аассоции-
рованный с развитием РГ 20
1.5. Молекулярно-генетические изменения, связанные с клеточной
пролиферацией 22
Клеточный цикл 22
Белки, участвующие в регуляции клеточного цикла 25
1.5.3. Регуляторы циклинзависимых киназ , 26
1.5.4 Субстраты циклинзависимых киназ 30
1.6 Нарушения генов клеточного цикла в опухолях человека 32
Инактивацияр16МК4А аР151Ш4В 34
Нарушения^ 37
1.7 Нарушения генов участвующих в процессе программированной
клеточной смерти 39
1.8 Заключение 41
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
Характеристика обследованных больных 42
Получение, обработка и гистологический анализ тканей 45
Молекулярные ДНК-зонды и микросателлитные маркеры 45
Выделение нуклеиновых кислот 45
2.4.1. Выделение ДНК из биопсий 46
Выделение РНК из биопсий 46
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови 47
2.5. Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК 47
Синтез к-ДНК 47
Бисульфитный мутагенез ДНК 48
Полимеразная цепная реакция. 48
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 5}
Электрофорез ДНК в агарозном геле 51
Электрофорез ДНК в неденатурирующем полиакриламидном геле :, 51
2.9.3 Электрофорез продуктов ПНР в денатурирующем
полиакриламидном геле 52
2.10 Перенос ДНК из полиакриламидного геля на нейлоновые фильтры 52
Радиоактивное мечение зондов методом кинирования 53
Гибридизация ДНК, иммобилизованной на нейлоновых фильтрах 53
2.13 Иммуногистохимия * 54
2.14. Статистическая обработка данных 54
2.15 Список основных растворов и сред, использованных в работе 55
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 57
3.1. Результаты исследования потери гетерозиготности в зоне
локализации геновр161шт, plT Rb, bcl 2 57
Определение потери гетерозиготности в предраке и доброкачественных опухолях гортани , 59
Исследование молекулярно-генетических нарушений в динамике развития заболевания , 64
3.1.3 Определение потери гетерозиготности в злокачественных
опухолях гортани 66
3J.4 В ну три опухолевая молекулярно-генетическая гетерогенность
в доброкачественных и злокачественных опухолях гортани 69
3.1.5. Определение потери гетерозиготности в условно-
контрольной группе 71
3.1.6. Сравнительный анализ молекулярных нарушений в эпителии слизистой оболочки гортани среди курильщиков и некурящих
индивидуумов . 71
3.2 Исследование метилирования промотора гена
р!6ШК4А 73
3.3, Экспрессия генапр]61Ж4А, pl5]NK4b, Rb и Bcl-2 в предопухолевых и
опухолевых поражениях слизистой оболочки гортани. Корреляция со
структурными нарушениями исследуемых генов 76
3.3.1 Определение экспрессии ріб методом
иммуногистохимии
3.4 Определение папилломавирусной инфекции в исследованном
материале 84
3.4.1. Опеределение экспрессии белков папилломавирусов
методом иммуногистохимии 87
4. ОбСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 89
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 110
ВЫВОДЫ 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 115
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
РГ - рак гортани
Имп. - импульс
ИГХ - иммуногистохимический метод
кДа - тысяча Дальтон
мкКи. - микроКюри
н. п. - нуклеотидная пара
н.д. ~ статистически недостоверно (р »0.05)
об./мин. - оборотов в минуту
ПААГ - полиакрил амидный гель
т, п. н. - тысяча пар нуклеотидов
ЦЗК - циклинзависимые киназы
HPV (Human Papillomavirus) - вирус папилломы человека
LOH (loss of heterozygosity) - потеря гетерозиготносте
MI (microsatellite instability) - RER+ (replication errors repair) -
микросателлитная нестабильность
p - уровень значимости
PCR (polymerase chain reaction) - ПЦР, полимеразная цепная реакция
RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) - обратная
полимеразная цепная реакция
RP (restriction points) - точки ограничения
Введение к работе
Актуальность. Согласно статистическим исследованиям последних лет, в России к 2000 году число больных с впервые в жизни установленным диагнозом рака верхних дыхательных путей составило 8,0 на 100 000 населения и этот показатель в 1,5 раза больше по сравнению с 1995 годом (5,4 на 100 000). Это связано, в основном, с повышением заболеваемости раком гортани, который составляет 60% наблюдений среди злокачественных новообразований верхних дыхательных путей. При сохранении современных тенденций число случаев онкологических заболеваний будет увеличиваться. Многими научными исследованиями доказана связь развития рака гортани с экспозицией канцерогенами табачного дыма и промышленной загрязненностью окружающей среды. Одним из самых современных и перспективных подходов в диагностике онкологических заболеваний является исследование молекулярных характеристик предопухолевых заболеваний. Выявление диагностических маркеров опухолевого роста на ранних стадиях развития заболевания является одним из важнейших направлений в онкологии, а при исследовании рака гортани особенно актуально.
Приоритетное значение в развитии подавляющего большинства неоплазий имеют гены, регулирующие клеточный цикл, а значит уровень пролиферации опухолевых клеток. Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз, часто нарушается в опухолевых клетках. Некоторые из них, например, белки генов р53, Rbl, bcl-2 широко используются как возможные прогностические маркеры при развитии многих злокачественных опухолей человека. Однако в патогенезе опухолей верхних дыхательных путей их роль до конца не изучена. В некоторых работах было показано, что изменения данных генов отмечались в пренеопластических нарушениях эпителия слизистой оболочки гортани, при этом экспрессия некоторых из них изменялась в зависимости от степени выраженности анапластических изменений. Нарушение функции генов,
ответственных за клеточный цикл и апоптоз, влияет не только на трансформацию клетки, но и на характер прогрессии сформировавшейся злокачественной опухоли. Так, например, повышенная продукция bcl-2, обнаруженная на ранних стадиях неоплазии, ведет к снижению показателя выживаемости больных раком гортани почти в два раза. Все это говорит о ранних нарушения в данных генах и их важной роли в канцерогенезе.
Наиболее часто в карциномах гортани встречаются соматические нарушения гена р!6 К4а, кодирующего один из белков - ингибиторов циклинзависимых киназ INK4, и являющегося негативным регулятором сигнального пути Cdk-Rb-E2F, отвечающего за реализацию программы клеточного цикла. Наиболее частый механизм его инактивации -метилирование CpG островков промотора и 1-го экзона pl61NK4a, гомозиготные делеции и точечные мутации. Наличие делеций в данном гене может коррелировать с усилением инвазии и метастазированием в лимфатические узлы.
Цель. Целью данной работы является выявление соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием опухолей гортани на ранних стадиях, и изучение возможности их использования в качестве* маркеров для ранней диагностики и/или прогноза заболевания.
В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:
1. Создать банк образцов тканей для следующих групп больных:
A. Предраковые изменения слизистой оболочки и
доброкачественные опухоли гортани.
Б. Злокачественные новообразования гортани.
B. Неизмененная слизистая оболочка гортани (контрольная группа).
2. Исследовать частоту делеций в локусе 9р21-22 в зоне локализации
геновpl6iNK4a пр15,ык\ в локусе 13ql4.2, в зоне локализации гена Rbl,
и в локусе 18q21, в зоне локализации гена bcl 2.
Определить степень метилирования промоторной области гена р!б1Ш4а.
Исследовать экспрессию мРНК данных генов.
Провести типирование папилломавируса в исследуемых образцах методами полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии.
Проследить динамику накопления молекулярно-генетических нарушений от стадии гиперплазии до анапластических изменений слизистой оболочки гортани.
Провести сравнительный анализ молекулярных нарушений в зонах локализации исследуемых генов в зависимости от индекса курения пациентов.
Научная новизна. В рамках данной работы впервые проведен детальный динамический анализ молекулярно-генетических изменений комплекса генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, с целью определения молекулярных маркеров на ранних стадиях развития опухолей гортани на биологическом материале, полученном с помощью щипцовой биопсии. А также впервые проведено столь широкое исследование всех заболеваний слизистой оболочки гортани, а не только паппилом, на предмет наличия папилломовирусной инфекции. Показано, что случаи инфекции эпидермоидных клеток HPV 16 типа, столь характерные для опухолевого поражения плоского эпителия шейки матки и кожи, крайне редко наблюдаются при раке гортани, где превалируют случаи выявления HPV 18 типа.
Практическая значимость. Полученные результаты будут иметь теоретическое значение для понимания механизмов возникновения и прогрессии злокачественных новообразований и для выявления особенностей регуляции клеточного цикла в различных типах опухолей гортани. После дополнительного тестирования может быть предложен набор необходимых молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики неоплазии гортани и/или при составлении индивидуального прогноза.
