Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Результаты и перспективы применения пер-фторорганических соединений в системе реконструктивной офтальмохирургии .
1.1. Применение перфторорганических соединений в системе реконструктивной офтальмохирургии заднего отрезка глазного яблока 14
1.2. Применение донорского материала, консервированного различными способами, для кератопластики в системе реконструктивной офтальмохирургии переднего отрезка глазного яблока 26
Глава 2. Общая характеристика отечественных перфторорганических соединений и методов исследования безопасности их применения в офтальмохирургии .50
Глава 3. Экспериментальное исследование безопасности применения отечественных перфторорганических соединений в качестве временных интраокулярных имплантатов в офтальмохирургии 59
3.1. Методы исследования 59
3.2. Результаты офтальмобиомикроскопии при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 65
3.3. Результаты регистрации общей электроретинограммы при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 69
3.4. Морфологические изменения сетчатки при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 73
3.5. Результаты регистрации зрительных вызванных потенциалов при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 79
3.6. Морфологические изменения зрительного нерва при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 84
3.7. Результаты изучения клеточной реакции, развивающейся в стекловидной камере глаза при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей 91
3.9. Обсуждение результатов 98
Глава 4. Исследование биосовместимости «ретино-пресса» - нового отечественного офтальмологического имплантата стекловидной камеры глаза 105
4.1. Результаты санитарно-химических испытаний 106
4.2. Результаты токсикологических испытаний 109
4.3. Результаты испытаний на стерильность 123
4.4. Обсуждение результатов 124
Глава 5. Экспериментальное обоснование применения в офтальмохирургии для оптической сквозной кера топластики донорской роговицы, консервированной на основе комплесного использования «перфторана» .133
5.1. Методы исследования 133
5.1. Результаты биомикроскопии 138
5.2. Результаты адреналиновой пробы 144
5.3. Результаты определения содержания АТФ 147
5.4. Результаты определения содержания ЛДГ 149
5.5. Результаты электронной микроскопии 150
5.6. Обсуждение результатов 158
Обсуждение полученных результатов 163
Выводы 189
Иллюстрации 191
Список литературы 221
Приложение
- Применение донорского материала, консервированного различными способами, для кератопластики в системе реконструктивной офтальмохирургии переднего отрезка глазного яблока
- Общая характеристика отечественных перфторорганических соединений и методов исследования безопасности их применения в офтальмохирургии
- Результаты офтальмобиомикроскопии при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей
- Результаты токсикологических испытаний
Применение донорского материала, консервированного различными способами, для кератопластики в системе реконструктивной офтальмохирургии переднего отрезка глазного яблока
Проблема хирургической реабилитации больных, потерявших зрение из-за образования бельма, остается одной из важных проблем офтальмологии. Принципиальное направление ее решения — пересадка роговицы, было сформулировано в 1818 году F. Reisinger. Попытка пересадить роговицу кролика выполнена им же в 1824 году. Однако первая успешная пересадка рого-вичного трансплантата у человека с длительным сохранением прозрачности произведена лишь в 1906 году Е. Zirm. Этому прорыву в борьбе со слепотой предшествовал целый ряд открытий. Н. Power в 1872 году предложил пользоваться роговицей, взятой у человека, а не от животного. А. Нірреї в 1877 году разработал трепан для производства частичной сквозной кератопластики. За этим последовал целый ряд успешных кератопластик (Шимановский А.Ф., 1912; Lohlein W., 1910; Magitot М., 1911-1912; Plange О., 1912). Широкое внедрение пересадки роговицы связано с именем A. Elschnig. В период с 1908 по 1913 гг. им произведено 203 операции пересадки роговицы в Пражской клинике с прозрачным приживлением в 31 случае.
На первом этапе развития кератопластики использовались преимущественно роговицы, взятые из энуклеированных глаз пациентов. Для пересадки применялись глаза, удаленные у больных по поводу абсолютной глаукомы, травмы, иридоциклитов, глиомы и других патологических процессов. В.П. Филатов не считал возможным пользоваться роговицей глаз, удаленных по поводу злокачественных опухолей. Clausen (1912), Magitot (1912) и другие придерживались иного мнения и применяли роговицы таких глаз в целях кератопластики. Трансплантационного материала в виде роговиц энуклеированных глаз явно не хватало для удовлетворения всех больных, нуждающихся в операции, что являлось большим тормозом в развитии кератопластики. Для решения проблемы предпринимались попытки использовать роговицу плодов или новорожденных, умерших от асфиксии (Савельев СВ., 1924; Fuchs, 1894; Salzer, 1900; Magitot 1916; Kuhnt, 1922), однако, в связи с отсутствием положительных результатов, от применения этого трансплантационного материала отказались на длительное время. Использование аутологич-ных тканей в практической офтальмологии ограничивалось редкими случаями наличия прозрачной роговицы на парном слепом глазу или перемещения прозрачных участков роговицы оперируемого глаза в оптическую зону (Kraupa, 1914; Gradle, 1921). Попытки иссечения из одного и того же глаза по 3-4 трансплантата (Casroviejo, 1951) не решало проблемы. Людей, нуждавшихся в кератопластике, было огромное количество. Так, по данным Парижской конференции 1928 года, посвященной слепоте, в мире в то время насчитывалось около 6 миллионов слепых на оба глаза и 15 миллионов глубоких инвалидов по зрению, из которых 30-40 % были с помутнениями роговицы. Все это стимулировало дальнейший поиск полноценного донорского материала, в том числе исследование возможности использования глаз трупов в этих целях. Данная гипотеза высказывалась уже давно (Konigshofer, 1841; Plouver, 1843), однако редкие случаи применения неконсервированных трупных роговиц имели неудовлетворительные результаты (Шимановский А.Ф., 1912; Magitot, 1912; Савельев СВ., 1924). Одновременно с этим проблема получения трансплантационного материала в России тормозилось существовавшими законодательными актами. Вопрос об использовании свежего трупного материала был решен положительно лишь в период 1907-1912 годах (Шимановский А.Ф., 1911).
Настоящий прорыв в решении проблемы обеспечения донорским материалом в интересах кератопластики осуществлен В.П.Филатовым (1934). Им был найден практически неограниченный его источник, а именно глаза трупов (Пучковская Н.А., 1971). К тому времени накопилось достаточно большое количество как клинических наблюдений в области кератопластики, так и исследований процессов переживания изолированных органов и тканей. Это опыты по оживлению сердца животных (Кулябко А.А., 1902), сохранение жизнедеятельности отдельных органов в процессе консервирования (Кравков Н.П., 1916, 1922; Аничков СВ., 1922) изучение процессов анабиоза (Бахметьев П.И., 1900, 1912). Имелся опыт Magitot, который в 1911 году осуществил консервирование целого глаза, взятого от живого, в гемолизиро-ванной крови того же донора в течение 8 суток при температуре + 5С. В результате автор получил хороший результат при частичной кератопластике. Этот случай сам В.П. Филатов оценил, как имеющий принципиальное значение.
Данные наблюдения позволили В.П. Филатову в 30-х годах начать широкое применение для кератопластики роговицы, взятую от трупов и подвергнутую консервации, решившую, на тот момент, проблему создания необходимого запаса донорского материала. Он писал в 1934 году: «Наблюдения над моим материалом свидетельствуют, что трансплантаты от трупов (даже консервированные) в пределах наблюдения были не хуже, чем таковые от «живых» глаз». В.П. Филатов, используя трупный материал, примененный «остро» и подвергнутый консервации, отмечал, что последний «ведет себя в послеоперационном периоде как «живой». Многочисленные экспериментальные исследования и клинические наблюдения, выполненные В.П. Филатовым, показали, что оптимальными для консервации глаз трупов с целью сохранения жизнеспособности роговицы являются условия влажной камеры при температуре + 2 С, + 4С в течение 1-3 суток. Им же подготовлено ходатайство о разрешении брать глаза у трупов без согласия родных, которое было удовлетворено соответствующими законодательными органами. Таким образом, получение донорского материала было легализовано в СССР.
Не удивительно, что к середине 30-х годов мировой центр изучения пересадки роговицы переместился в Одессу. Благодаря выдающимся работам В.П.Филатова и его школы, был решен целый ряд принципиально важных вопросов проблемы частичной сквозной пересадки роговицы, усовершенствована техника операции, предложены новые инструменты, разработаны способы укрепления трансплантата, предложена классификация бельм, установлены показания и противопоказания к различным видам пересадки роговицы. Велика заслуга академика В.П. Филатова в разработке методов консервации донорской роговицы, в том числе и долгосрочных (методы высушивания и консервации в условиях низких температур). Им фактически была высказана идея о создании сегодняшних глазных банков, интеллектуальным отцом которой по праву он признан (Дронов М.М., 1997). Добившись значительного успеха в хирургическом лечении ограниченных центральных бельм, В.П. Филатов предлагал изучать принципиальную возможность применения донорских дисков роговицы большего диаметра. Пересадка целиком всей роговицы, по словам В.П. Одинцова (1934), «должна была бы явиться идеальной операцией, восстанавливающей и косметику и зрение». Последующие исследования, проведенные Н.А. Пучковской (1949-1954), способствовали обоснованию пересадки трансплантатов большого диаметра, то есть выполнению субтотальной пересадку роговицы (8 мм и более). К сожалению, результаты этих операций при использовании материала, консервированного во влажной камере, показали их низкую прозрачную приживляемость (до 10-15%).
Общая характеристика отечественных перфторорганических соединений и методов исследования безопасности их применения в офтальмохирургии
Работа носила экспериментальный характер, включала исследования 153 кроликов, 20 крыс, 105 пар кадаверных глаз, 210 специальным образом приготовленных проб и состояла из 2 основных частей. I часть заключалась в экспериментальном обосновании (доклинической оценке безопасности) применения отечественных перфторорганических соединений в качестве интраокулярных имплантатов для тампонады стекловидной камеры глаза в системе реконструктивной офтальмохирургии. Эта часть работы, в свою очередь, состояла из двух этапов. На 1 этапе исследований I части диссертационной работы изучали безопасность применения высокочистых отечественных ПФОС производства РНЦ «Прикладная химия» в качестве офтальмологических имплантатов в эксперименте на 113 кроликах (226 глаз) породы «Шиншилла». Предметом сравнительного исследования данного этапа работы являлись высокочистые отечественные ПФОС производства РНЦ «Прикладная химия» (г. Санкт-Петербург): перфтороктилбромид (ПФОБ) и перфтордека-лин (ПФД). Были выделены следующие группы наблюдения: 1. Интактные глаза лабораторных животных, п=20. 2. Глаза кроликов, на которых выполняли частичную витрэктомию с заменой иссеченного стекловидного тела 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Данная группа была контрольной, п=42. 3. Глаза лабораторных животных, которым, после частичной витрэктомии, инъецировали 0,5 мл ПФОБ (I экспериментальная группа), п=82. 4. Глаза лабораторных животных после интравитреального введения 0,5 мл ПФД — также с предварительно выполненной частичной витрэктомией (II экспериментальная группа), п=82. Срок наблюдения - 30 суток. Физико-химические свойства указанных ПФОС приведены в таблице 1. Все ПФОС, которые выпускались РНЦ «Прикладная химия» для наших экспериментальных и клинических исследовний, проходили специальную очистку и контроль (Максимов Б.Н. и др., 1996). Кроме общепринятых: щелочной отмывки, сушки, ректификации и фильтрации применялся метод сорбции с помощью никелевой сетки, сорбента кизильгур и фильтров «Шот-та». Указанный метод позволяет повысить процентное содержание основного вещества в конечном продукте до 99% и более, в том числе за счет удаления: следов F-иона, БҐ-содержащих веществ, летучих и коллоидных соединений фторидов металлов, которые являются чрезвычайно токсичными для биологических объектов (Седова Л. А. и др., 1980).
Это позволяло предположить, что ПФОС производства РНЦ «Прикладная химия», являясь высокочистыми, не будут вызывать выраженного повреждения тканей глаза при интравитреальном применении, что сделает допустимым их использование в качестве временного интраокулярного им-плантата для офтальмохирургии. Важным фактором при выборе предмета исследования являлась также относительно низкая себестоимость отечественных ПФОС.
Перед использованием ПФОС производства РНЦ «Прикладная химия» в качестве временных интраокулярных имплантатов в экспериментальной офтальмохирургии каждая партия перфторуглеродов (материалов) очищалась по специально разработанной методике, исследовалась на содержание основного вещества (с помощью хроматографии), стерилизовалась и расфасовывалась во флаконы. Таким образом, уже на 1 этапе исследований перфторорга-нических материалов использовали только высокочистые стерильные ПФОС.
После экспериментального офтальмохирургического вмешательства состояние глаз животных при пребывании ПФОС в стекловидной камере оценивали с помощью: офтальмоскопии, регистрации общей электроретино-граммы (ОЭРГ), трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) сетчатки, регистрации вспышечных зрительных вызванных потенциалов (ЗВП), ТЕМ зрительного нерва, сканирующей электронной микроскопии (SEM) сетчатки и задней капсулы хрусталика, световой микроскопии витреальных мембран.
Методы исследования Группы наблюдения Всего Контроль «Ретинопресс» Санитарно-химические:- рН-метрия, проб- ультрафиолетовая спектрофотометрия,проб 10 10 30 30 40 40 Токсикологические:- цитотоксическое действие, проб- раздражающее действие при многократных инсталляциях, глаз кроликов- раздражающее действие при внутри-кожном введении, кроликов- сенсибилизирующее действие, крыс- местное действие после имплантации,глаз кроликов 2079 1015 3079 1015 501418 2030 На стерильность:- на тиогликолевой среде, проб- на среде Сабуро, проб 10 10 30 30 40 40 Эксперимент проводили на 40 кроликах породы «Шиншилла» и 20 белых крысах одной линии обоего пола. Всего было изучено 210 специальным образом приготовленных проб (самого «Ретинопресса», вытяжек (экстрактов) из него и контрольных растворов). Выполняли санитарно химические испытания (рН-метрия и ультрафиолетовая спектрофотометрия), токсикологические испытания in vitro и in vivo (на цитотоксическое действие, на раздражающее действие при многократных инсталляциях, на раздражающее действие при внутрикожном введении, на сенсибилизирующее действие, на местное действие после имплантации) и испытания на стерильность. II часть работы заключалась в экспериментальном обосновании применения отечественных перфторорганических соединений для консервации роговицы с использованием разработанной нами комплексной системы оценки жизнеспособности донорского материала и его пригодности для оптической сквозной кератопластики в системе реконструктивной офтальмохирур-гии. Изучали эффективность и безопасность консервации кадаверных глаз для кератопластики на основе комплексного применения эмульсии отечественных перфторорганических соединений — препарата «Перфторан» производства ОАО НПФ «Перфторан» (г. Пущино).
Результаты офтальмобиомикроскопии при интравитреальном применении отечественных перфторорганических жидкостей
Как указано выше, работа была выполнена на 113 кроликах (226 глаз). Контрольная группа, где после частичной витрэктомии иссеченное стекловидное тело заменяли изотоническим раствором натрия хлорида, состояла из 42 глаз, I экспериментальная группа (ПФОБ) - из 82 глаз, II (ПФД) - также из 82 глаз лабораторных животных. При этом указанные ПФОЖ находились интравитреально в течение всего срока наблюдения (30 суток) соответственно в 30, 60 и 60 случаях. Остальные глаза кроликов были энуклеированы ранее (на 3 сутки) для определения динамики исследуемых показателей и морфологических изменений.
Биомикроскопию и офтальмоскопию проводили: до хирургического вмешательства, непосредственно после него, ежедневно в течение первых 5 суток, а в дальнейшем — до конца эксперимента - раз в 5 дней. Иссследовали состояние конъюнктивы, роговицы, передней камеры, хрусталика, стекловидной камеры глаза, содержащей пузырь ПФОЖ объемом 0,5 мл и сетчатки.
Каких-либо изменений преломляющих сред глаз экспериментальных животных до операции выявлено не было. В верхне-наружном квадранте наблюдали диск зрительного нерва бледно-розового цвета, правильной округлой формы с небольшим преобладанием горизонтального диаметра. Диск зрительного нерва кроликов имеет в норме четкие границы и экскавацию 0,6-0,8. В отличие от органа зрения человека, центральные артерия и вена сетчатки делятся только на две ветви — носовую и височную, а аксоны ганглиоз-ных (мультиполярных) клеток приобретают миелиновую оболочку еще ин-траокулярно, до формирования зрительного нерва. В остальных отделах глазного дна сетчатка прозрачна.
После замещения части стекловидного тела изотоническим раствором натрия хлорида у подавляющего большинства животных контрольной группы преломляющие среды оставались прозрачными. Лишь на 4 глазах (18%) в стекловидном теле к концу срока наблюдения было отмечено формирование «нежных» шварт по ходу операционного раневого канала (рис. 4, 5). Задняя капсула хрусталика оставалась интактной во всех случаях. Каких-либо изменений на глазном дне выявлено не было.
ПФОБ, введенный в стекловидную камеру глаза после частичной вит-рэктомии до 15-20 суток наблюдения лежал одним «пузырем» (рис. 6), который лишь к концу эксперимента начинал эмульгироваться и распадался на несколько более мелких. Из-за разницы коэффициентов преломления даной ПФОЖ и витреума сетчатка в верхних и нижних отделах четко офтальмоско-пировалась при различных положениях асферической линзы. В 16 случаях (26,7%), также к 15-20 суткам, на поверхности ПФОБ было отмечено формирование полупрозрачных мембран, простирающихся по ходу операционного раневого канала к диску зрительного нерва. При этом задняя капсула хрусталика в большинстве наблюдений выглядела интактной. На 30 сутки описанный процесс наблюдался на 24 глазах кроликов (40%), некоторые мембраны становились непрозрачными (рис. 5). Патологические изменения на глазном дне отсутствовали и в верхних и в нижних квадрантах во всех случаях в течение всего срока наблюдения.
Эмульгация изучаемого высокочистого отечественного ПФД при ин-травитреальном введении начиналась сразу после операции, а уже спустя 1 сутки ПФОЖ представляло собой 7-13 разнокалиберных пузырей. В дальнейшем отмечалось их дробление на все более мелкие частицы (рис. 7). Мембранообразование по границе раздела сред (остатки стекловидного тела и тяжелой жидкости) в ряде случаев было выявлено уже на 5-10 сутки (рис. 8), а к концу эксперимента (рис. 5) наблюдалось на 47 глазах кроликов данной экспериментальной группы (78%). При этом образовавшиеся непрозрачные мембраны тянулись по ходу операционного раневого канала к ДЗН, простирались между «каплями» ПФОЖ и по задней капсуле хрусталика, фиксируя к ней частицы эмульгированного ПФД. Офтальмоскопируя животных, перевернутых на 180, к концу срока наблюдения на 32 глазах (53%) в нижних квадрантах в экваториальной зоне и на периферии глазного дна выявили очаги дистрофии с перераспределением пигмента (рис. 9), а таюке наличие фиксации к поверхности сетчатки отдельных частиц ПФД «нежными» преретинальными мембранами. Кроме того, на 11 глазах (18%) ретинит был зафиксирован и в верхних квадрантах.
Результаты биомикроскопии и офтальмоскопии, описанные выше, свидетельствуют, что даже одинаково высокочистые ПФОЖ производства РНЦ «Прикладная химия» по разному переносятся тканями глаз экспериментальных животных. При этом реакция на интравитреальное применение ПФОБ выражена в меньшей степени и ближе к изменениям, выявленным в контрольной группе (табл. 5).
После офтальмохирургических вмешательств на лабораторных животных нет возможности оценить функциональный исход выполненных манипуляций с помощью визометрии и периметрии. Поэтому при экспериментальном изучении толерантности зрительного анализатора к различным воздействиям вместо субъективных клинических используют объективные электрофизиологические методы исследования, отличающиеся высокой чувствительностью.
Общая электроретинограмма (ОЭРГ) - графическое выражение электрической активности клеточных элементов ретины в ответ на световое раздражение. Изучение динамики функционального состояния сетчатки по данным ОЭРГ является базисным методом исследования при определении допустимых сроков и дозировок препаратов, вводимых в стекловидную камеру глаза. Запись ОЭРГ осуществляли до экспериментального витреоретинально-го хирургического вмешательства (трехкратно), а затем на 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 сутки после операции.
Поскольку электроретинография является высокочувствительной методикой, величина и форма ОЭРГ зависит от целого ряда условий: углового размера, интенсивности, длительности, частоты и длины волны стимула; условий адаптации; диаметра зрачка; степени пигментации тканей глазного дна и др. В связи с этим, ISCEV (Международное общество клинической физиологии зрения) рекомендует определять нормальные величины для каждой лаборатории, каждой системы аппаратуры и популяции (Marmor M.F. et al., 1989, 1995). Мы регистрировали ОЭРГ с помощью специализированной системы «MBN-Электроретинограф» (MBN, Россия) в экранированной камере на седьмой минуте темновой адаптации, используя роговичный электрод-присоску из молочного пластика, позволяющий равномерно освещать всю поверхность сетчатки, а также референтный и заземляющий электроды, накладываемые на уши. Белый стимул насыщающей интенсивности подавали с частотой 1Гц. Усредняли 15 ответов. Как контрольная, так и экспериментальные группы были сформированы только из животных серой окраски с коричневым цветом радужной оболочки (рис. 1).
По форме нормальные ОЭРГ глаз кролика и человека практически не отличаются. По величине ОЭРГ интактного глаза кролика характеризуется непостоянной низкоамплитудной негативной волной «а» и выраженной значительно лучше, хотя и меньшей по сравнению с аналогичным показателем нормальной ОЭРГ глаза человека позитивной волной «Ь».
Результаты токсикологических испытаний
С помощью данного метода определяли цитотоксический потенциал как самого имгатантата офтальмологического «Ретинопресс», так и вытяжек данного медицинского изделия. Образцы вытяжек готовили методом наслаивания экстрактантов на исследуемое полимерное изделие при термостатировании при температуре 37С в течение 24 часов. В качестве экстрактантов использовали стерильные: изотонический раствор натрия хлорида и ростовую среду (F12) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Таким образом, три экспериментальные группы представляли собой образцы имплантата офтальмологического «Ретинопресс» и вытяжек из него, полученных с применением указанных двух разновидностей экстрактантов. Контрольных групп было две. Материалом отрицательного контроля служила ростовая среда, материалом положительного контроля - раствор цинка (Zinc ICP/DCP standard solution). Готовили не менее трех проб на каждый образец.
Определение цитотоксического эффекта в указанных экспериментальных и контрольных группах проводили в условиях in vitro с использованием фибробластов мыши линии L929 методом прямого контакта. Клетки высевали в культуральные плоскодонные планшеты (96-луночные или 24-луночные) и инкубировали 24 часа во влажной атмосфере, содержащей 5+1% (по объему) СОг при температуре 37С до образования монослоя. Затем на них осаждали приготовленные пробы из образцов всех экспериментальных и контрольных групп, проводя исследование методом прямого контакта. Культуру клеток инкубировали с пробами еще 24 часа- также при температуре 37С.
Цитотоксичность определяли с использованием методов качественной и количественной оценки. При качественной оценке осматривали клетки через микроскоп, чтобы определить изменения: нарушение их общей морфологии, вакуолизацию фибробластов, расщепление, лизис клеток и целостность мембран. Количественная оценка включала: определение числа погибших клеток, замедление роста фибробластов, пролиферацию клеток и образование колоний. Сравнивали полученньте данные с положительным и отрицательным контролем.
Лизис клеток отсутствовал, морфология фибробластов была аналогичной отрицательному контролю, количество клеток отличалось от контроля в пределах допустимой погрешности (10%).
Таким образом, по результатам данного исследования как у офтальмологического имплантата «Ретинопресс», так и у вытяжек из данного медицинского изделия не было выявлено цитотоксического действия. Следовательно, «Ретинопресс» соответствует требованиям, предъявляемым к полимерным материалам, применяемым в условиях повышенной биосовместимости. При этом — для использования в виде имплантируемого медицинского изделия не только кратковременного контакта, а даже длительного.
С помощью данного метода оценивали потенциальную способность имплантата офтальмологического «Ретинопресс» оказывать раздражающее действие (то есть вызывать локализированную воспалительную реакцию без вовлечения иммунного механизма) на слизистую оболочку глаза. При этом необходимо отметить, что глаза лабораторных животных (конъюнктива, роговица и радужка) являются стандартным и наиболее распространенным объектом исследования раздражающего действия большинства медицинских изделий и лекарственных средств, независимо от планирующейся области применения и оцениваемых в плане безопасности их клинического использования. Исключение составляют материалы, вызвавшие коррозию и сильное раздражение при действии на кожу, а также вещества, обладающие сильными кислотными или щелочными свойствами (рН которых 2,5 ед. и меньше или 11,5 и больше), так как их способность вызывать раздражение и коррозию заранее известна.
В инсталляциях применяли экстракты (вытяжки) имплантата офтальмологического «Ретинопресс», которые готовили методом наслаивания дистил лированной воды на исследуемое медицинское изделие при термостатирова-нии при температуре 37С в течение трех суток.
Полученные таким образом образцы вытяжки (водного экстракта) представляли собой экспериментальную группу, а изотонический раствор натрия хлорида - контрольную (отрицательный контроль, то есть материал, который при исследовании в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.10 — 99 не оказывает раздражающего или сенсибилизирующего действия). Положительный контроль (материал, который при исследовании в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.10 — 99 оказывает воспроизводимое раздражающее или сенсибилизирующее действие) не применялся.
Для исследования использовали здоровых молодых половозрелых кроликов-альбиносов одной линии обоего пола массой 2-3 кг, после акклиматизации в условиях лаборатории не менее пяти дней до начала эксперимента и содержавшихся в одинаковых условиях. Использовали 7 лабораторных животных на одно исследование (нормативными документами определяется количество не менее трех). Не позднее, чем за 24 часа до исследования оценивали состояние глаз каждого кролика. При обнаружении патологических изменений хотя бы в одном глазу животное заменяли.
Экстракты имплантата офтальмологического «Ретинопресс» вводили (закапывали) в объеме по 0,1 мл в нижний отдел (свод) конъюнктивального мешка правого глаза кроликов с помощью глазных пипеток. Затем смыкали веки лабораторных животных и удерживали их так в течение 1с. По такой же методике выполняли инстилляцию изотонического раствора натрия хлорида (отрицательный контроль) в конъюнктивальный мешок левого глаза кроликов.
При однократных инсталляциях оба глаза животного осматривали через 1, 24, 48 и 72 часа после воздействия. При многократных — до, непосредственно после и через 1 час после каждой процедуры. Исследуя конъюнктиву и роговицу, использовали офтальмоскоп и ручную щелевую лампу. Для более четкого выявления изменений роговицы применяли 2,0% раствор флюоресцеина натрия.
