Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .12
1.1 Эпидемиология кератоконуса 12
1.2 Классификации кератоконуса 13
1.3 Диагностика и клиническое течение кератоконуса .15
1.4 Современные тенденции в лечении кератоконуса 18
Глава 2. Экспериментальная часть исследования 39
2.1 Экспериментальная разработка технологии дозированной скарификации эпителия роговицы 39
2.1.1 Разработка инструмента для дозированной скарификации эпителия роговицы 39
2.1.2 Исследование глубины повреждения эпителия роговицы при применении нового инструмента – скарификатора 44
2.1.3 Сравнение скорости восстановления целостности эпителия при выполнении деэпителизации и дозированной скарификации эпителия роговицы в эксперименте 46
2.2 Экспериментальное изучение доставки рибофлавина в строму роговицы при различных технологиях УФ-кросслинкинга .48
Глава 3. Клиническое исследование .55
3.1 Материал и методы клинических исследований 55
3.2 Технологии выполнения хирургических вмешательств 62
3.2.1 Проведение УФ-кросслинкинга по классической технологии .63
3.2.2 Технология проведения УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы 63
3.3 Клинико-функциональные результаты хирургического лечения 65
3.3.1 Клиническое течение и осложнения раннего послеоперационного периода...65
3.3.2 Сравнение клинико-функциональных результатов в исследуемых группах...68
3.3.3 Динамика изменения морфологии роговицы in vivo после выполнения УФ кросслинкинга по различным технологиям 74
Заключение 77
Выводы 88
Практические рекомендации 91
Список литературы
- Диагностика и клиническое течение кератоконуса
- Исследование глубины повреждения эпителия роговицы при применении нового инструмента – скарификатора
- Сравнение скорости восстановления целостности эпителия при выполнении деэпителизации и дозированной скарификации эпителия роговицы в эксперименте
- Технология проведения УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы
Диагностика и клиническое течение кератоконуса
Различные авторы предлагают классификации, которые основываются на систематизации разных признаков кератоконуса.
Впервые разделение кератоконуса на стадии было предложено оптометристами. Их классификации имели практическое значение и отражали сложность подбора контактных линз [165, 92, 106].
Наиболее признанная и распространенная классификация кератоконуса была предложена M. Amsler в 1961 году [60]. Автор разграничил 4 стадии заболевания, используя широкий арсенал методов исследования (кератография, биомикроскопия, острота зрения, офтальмометрия и скиаскопия). Он также впервые представил рекомендации по выбору метода лечения кератоконуса в зависимости от стадии заболевания.
Позже данную классификацию расширила и дополнила З. Д. Титаренко в 1982 году [52]. На основании данных остроты зрения, офтальмометрии, рефрактометрии, биомикроскопии, кератографии и глубины передней камеры она выделила 5 стадий кератоконуса. Недостатком данной классификации явилось то, что определяемые по разным критериям стадии кератоконуса могли не совпадать.
Слонимский Ю. Б., (1993) в предложенной им классификации кератоконуса выделил 3 стадии заболевания в зависимости от необходимости проведения сквозной кератопластики: дохирургическая, хирургическая и терминальная. Данная классификация основывается на данных остроты зрения, рефракции, толщины роговицы, радиуса ее кривизны, глубины передней камеры, длины глаза, наличия помутнений роговой оболочки и переносимости контактных линз [50].
В 2010 году классификацию Amsler дополнила Абугова Т. Д. Она выделила 4 стадии кератоконуса в зависимости от картины, наблюдаемой при биомикроскопии роговицы [3, 38]. Кроме того, было разграничено 6 типов кератоконуса на основе компьютерного анализа кератотопографии роговицы: островершинный, туповершинный, пикообразный, пикообразный атипичный, низковершинный и низковершинный атипичный. В зависимости от этапа развития болезни, на котором процесс остановился было выделено 3 клинические формы кератоконуса: несостоявшийся кератоконус, абортивная форма и классический кератоконус. В зависимости от характера течения кератоконуса определены 3 формы заболевания: непрогрессирующая, медленно прогрессирующая и быстро прогрессирующая.
Krumeich в 1998 году ввел классификацию тяжести течения кератоконуса, в которой учитываются показатели средней кератометрии, пахиметрии роговицы в самой тонкой точке, а так же аномалии рефракции [44].
J. Kanski в 2006 году предложил разграничить кератоконус на 3 стадии: начальную стадию, при которой показатель К (кератометрия) находится в пределах от 46,0 до 48,0 дптр, стадию развитого кератоконуса, когда К равен 48,0 - 54,0 дптр и стадию далеко зашедшего кератоконуса при которой К превышает 54,0 дптр [11, 12].
Таким образом, в настоящее время нет единой общепризнанной и удовлетворяющей всех офтальмологов классификации кератоконуса, в связи с этим специалисты как правило используют соответствующие их конкретным задачам [44, 52, 70, 156].
Общепризнанным является тот факт, что на ранней стадии кератоконус диагностировать труднее, чем в развитой, однако современное диагностическое оборудование позволяет справиться с этой задачей [156].
К клиническим симптомам кератоконуса относятся астенопические жалобы на фоне позднего возникновения «миопии» в сочетании с астигматизмом, степень которого со временем нарастает, а ось меняется. Также характерно постепенное, плохо корригируемое очками, снижение зрения, монокулярное двоение, многоконтурность предметов [4].
С целью выявления кератоконуса на ранних стадиях применяется целый комплекс методов диагностики. К ним относятся исследование остроты зрения, рефрактометрия, офтальмометрия, аберрометрия, пахиметрия, кератотопография, исследование передней и задней элевации роговицы, конфокальная микроскопия [40, 52, 158, 182].
При офтальмометрии определяется уменьшение радиуса кривизны роговицы, что увеличивает ее преломляющую силу и приводит к «миопизации» глаза. Наиболее характерными признаками кератоконуса, выявляемыми при офтальмометрии, являются «излом» горизонтальных меток, неодинаковый их размер, изменение угла между главными меридианами (так называемая «дисторсия») [10, 12, 55, 75].
Биомикроскопия роговицы также является важным методом диагностики кератоконуса. При обследовании пациента с кератоконусом за щелевой лампой обнаруживается нарушение правильного расположения роговичных пластин на вершине кератоконуса, что визуализируется как «разрежение» стромы роговицы. Также этот признак называют симптомом «гаснущей звезды» или «фейерверка» [31, 33].
Исследование глубины повреждения эпителия роговицы при применении нового инструмента – скарификатора
В экспериментальных исследованиях доктора G. Wallensak и соавторов (2004) было показано, что УФ излучение с длиной волны 370 нм, используемое при проведении УФ-кросслинкинга, обладает повреждающим эффектом на клетки роговицы [182]. Так, во время исследований на кроликах, после УФ-кросслинкинга авторы обнаружили гибель кератоцитов на глубине до 350 мкм, а через 6 месяцев их популяция полностью восстанавливалась. Временная потеря кератоцитов происходит так же после ФРК и LASIK и не считается критической. В отличие от кератоцитов, клетки эндотелия роговицы имеют низкую регенеративную способность [168] и их повреждение во время проведения операции является недопустимым. В серии экспериментов на глазах животных E. Spoerl (2003) определил, что строма роговицы, пропитанная рибофлавином, поглощает 95% УФ излучения, в то время как в отсутствии рибофлавина данный показатель составляет лишь 32%. Так был продемонстрирован защитный эффект, которым обладает рибофлавин по отношению к эндотелию роговицы и подлежащим структурам глазного яблока [183].
Таким образом, полное пропитывание стромы роговицы рибофлавином является необходимым условием успешного и безопасного проведения УФ– кросслинкинга. В связи с этим, изучение возможности проникновения рибофлавина в строму роговицы при моделировании различных технологий УФ-кросслинкинга явилось важным этапом нашего исследования.
Исходя из этого, задачей явилась разработка высокоточного и достоверного способа обнаружения рибофлавина в строме роговицы и применение его для оценки эффективности различных технологий УФ-кросслинкинга.
Для выявления проникновения рибофлавина в строму роговицы в ходе исследования применяли ИК Фурье-спектроскопию, являющуюся одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования структуры химических веществ, который может использоваться для обнаружения их в биологических жидкостях и тканях.
ИК-спектры отражения являются специфичными для каждого химического вещества благодаря тому, что отражают наличие каждой функциональной группы в их составе и характер химических связей, присутствующих в молекуле. Полученный с помощью ИК Фурье–спектроскопии ИК-спектр отражения рибофлавина, как и других химических веществ, является уникальным и позволяет четко идентифицировать его присутствие в роговице.
Ход эксперимента по изучению проникновения рибофлавина в роговицу при различных технологиях УФ-кросслинкинга
Данное исследование было выполнено совместно с к.м.н. Измайловой С.Б. на базе Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН и Центра Фундаментальных и Прикладных Медико-биологических Проблем МНТК «Микрохирургия глаза».
Исследование проводили на 9-и кадаверных глазах от 8-и доноров трупов без признаков патологии роговицы, не соответствующих критериям отбора для кератопластики. Возраст доноров составил от 30 до 39 лет. Интервал от момента смерти до энуклеации составил не более 8-и часов, от момента смерти до проведения эксперимента проходило не более 11 часов.
Были выделены 3 группы по 3 глаза. В первой группе перед закапыванием на роговицу раствора рибофлавина эпителий предварительно удаляли, что соответствовало начальному этапу выполнения УФ-кросслинкинга по классической технологии.
Во второй группе эпителий не удаляли, а для увеличения его проницаемости на него в течение 30-и минут инстиллировали 0,5% раствор проксиметакаина, содержащий бензаклония хлорид (Алкаин 0,5%), таким образом моделировали этап технологии трансэпителиального УФ-кросслинкинга.
В третьей группе для увеличения проницаемости эпителия выполняли механическое нарушение его целостности с помощью инструмента для дозированной скарификация эпителия роговицы.
В ходе эксперимента кадаверный глаз помещали в держатель, после чего согласно изучаемой технологии УФ-кросслинкинга, эпителий роговицы удаляли или обрабатывали для усиления проницаемости. После этого, для определения спектра контроля, роговицу выделяли и помещали на предметный столик ИК-микроскопа эндотелием вверх. Во всех случаях спектры регистрировали в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) на ИК-микроскопе Hyperion 2000 с кристаллом германия (Ge), совмещенным с вакуумным ИК-Фурье спектрометром модели IFS 66v/s (Bruker). Спектры усредняли по 50 сканам.
На ИК - микроскопе в режиме НПВО регистрировали ИК-спектр отражения рибофлавина в виде порошка.
Сравнивали ИК-спектр отражения рибофлавина с контрольным ИК-спектром отражения роговицы. В результате сравнения, выявили полосы спектра, не совпадающие по положению и интенсивности. Именно эти полосы служили индикатором присутствия рибофлавина в роговице.
Далее 0,1 % раствор рибофлавина в физиологическом растворе капельно наносили на переднюю поверхность кадаверной роговицы в течение 30 мин, после чего смывали физиологическим раствором до прозрачных смывных вод. Затем роговицу помещали на предметный столик ИК-микроскопа, и с помощью ИК-НПВО объектива регистрировали несколько ИК-спектров отражения с разных участков ее эндотелиальной стороны для выявления возможных флуктуаций.
После этого проводили сравнение полученных ИК-спектров отражения, при этом о проникновении рибофлавина в роговицу свидетельствовало увеличение интенсивности полос ее ИК-спектра, характерных для рибофлавина.
Сравнение скорости восстановления целостности эпителия при выполнении деэпителизации и дозированной скарификации эпителия роговицы в эксперименте
Анализ результатов спектроскопического исследования показал, что рибофлавин, нанесенный на поверхность роговицы после ее субтотальной деэпителизации проникает во все слои стромы и обнаруживается с эндотелиальной стороны роговицы, данный факт еще раз обосновывает эффективность и безопасность стандартной технологии УФ-кросслинкинга.
Отсутствие изменения характеристик ИК-спектра роговиц, на которые перед инстилляцией раствора рибофлавина был нанесен 0,5% раствор проксиметакаина, содержащий бензаклония хлорид, по сравнению с контролем, свидетельствует об отсутствии проникновения рибофлавина через эпителий роговицы, обработанной данным способом, что ставит под сомнение эффективность трансэпителиального УФ-кросслинкинга и обосновывает нецелесообразность его применения в клинике.
Нами также было показано, что при выполнении дозированного механического нарушения целостности эпителия роговицы с помощью разработанного оригинального инструмента - скарификатора происходит полное пропитывание стромы роговицы рибофлавином, что говорит об эффективности и целесообразности применения данного инструмента во время проведения УФ-кросслинкинга по технологии со скарификацией эпителия роговицы в клинической практике.
В ходе клинических исследований нами были проанализированы клинико-функциональные результаты на основе послеоперационного наблюдения 117-и пациентов (130 глаз) с прогрессирующим кератоконусом I-й-III-й стадии. Критерии отбора пациентов включали: прогрессирование кератоконуса, отсутствие помутнений роговицы, толщина роговицы в самой тонкой точке не менее 400 мкм, максимальная сила преломления по данным кератотопограммы не более 65 дптр. Из результатов проведенных ранее экспериментальных исследований следовало целесообразным сформировать 2 группы пациентов: в I-ую группу вошли 57 человек (65 глаз), которым проводили УФ-кросслинкинг по стандартной технологии, во II-ую группу были включены 60 человек (65 глаз), которым проводили УФ-кросслинкинг с дозированной скарификацией эпителия роговицы при помощи оригинального инструмента - скарификатора.
Ранний послеоперационный период у пациентов I-й группы характеризовался наличием выраженного болевого синдрома (в среднем 6.9 балла по 10-и бальной шкале) купирование которого происходило в среднем через 3-е суток после вмешательства. Пациенты II-й группы оценивали болевые ощущения в среднем на 2,9 балла из 10-и, а их купирование наступало в среднем через 1 сутки после операции. Кроме того, пациенты I-й и II-й групп после операции жаловались на «туман» перед оперированным глазом, который постепенно уменьшался и пропадал через 1 - 1,5 месяца. Данная жалоба коррелировала с наличием облаковидного помутнения передних и средних слоев стромы роговицы, выявляемого при биомикроскопии, который по данным зарубежных авторов представляет собой отек стромы роговицы и связан со скоплением жидкости на месте кератоцитов, погибших при комбинированном воздействии на них ультрафиолета и рибофлавина [180]. Динамика остроты зрения в I-й и II-й группах оказалась схожей.
Через 1 месяц после проведения УФ-кросслинкинга по классической технологии, отмечали снижение средних значений НКОЗ на 0,1±0,03 и МКОЗ на 0,09 ± 0,02. Через 3 месяца после операции средние показатели НКОЗ и МКОЗ возвращались к дооперационным значениям. Через 2 года после операции мы наблюдали достоверное увеличение средних показателей НКОЗ и МКОЗ на 0,07 ± 0,03 и 0,11 ± 0,04 соответственно.
После проведения УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы через 1 месяц также отмечали снижение средних значений НКОЗ на 0,11 ± 0,04 и МКОЗ на 0,08 ± 0,03, через 3 месяца они вернулись к дооперационному уровню. При обследовании пациентов данной группы через 2 года после операции мы выявили достоверное увеличение среднего показателя МКОЗ на 0,1 ± 0,04, средняя НКОЗ достоверно увеличилась на 0,08 ± 0,02.
Как и в данном исследовании, в своих работах большинство авторов отмечают постепенное улучшения как корригированной так и некорригированной остроты зрения после УФ-кросслинкинга, которое регистрируется в сроки от 1-го до года 5-и лет, однако приводимые цифры изменения данных показателей несколько разнятся [71, 101, 174, 183].
Кмах и Кave в обеих группах так же изменялись схожим образом на протяжении всего периода наблюдения. В обеих группах мы наблюдали постепенное снижение данных показателей в течение 1-го года послеоперационного наблюдения, их значения полученные через 1 год и через 2 года после операции не имели статистически достоверной разницы. В I-й группе средний показатель Кмах через 2 года после операции достоверно снизился по сравнению с дооперационным значением на 2,7 ± 0,4 дптр, средняя Кave также достоверно снизилась в этот срок на 2,6 ± 0,5 дптр. Во II-й группе через 2 года после проведения УФ-кросслинкинга мы отметили снижение Кмах на 2,2 ± 0,4 дптр и Кave на 2,4 ± 0,3 дптр.
В результате данного исследования мы выявили значительное уплощение поверхности роговицы, которое наблюдалось в обеих группах пациентов. Данное наблюдение согласуется с ранее опубликованными результатами, согласно которым после выполнения УФ-кросслинкинга по классической технологии преломляющая сила роговицы в крутом меридиане через 2 года после операции снижается по разным данным на 2,1 [184], 5,8 [174], 1,7 [101] и 1,3 [71] дптр, а стабилизацию данного показателя, согласно этим же исследованиям, констатируют в сроки от 6-и месяцев до 2-х лет.
Технология проведения УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы
1. Разработанный оригинальный инструмент для скарификации эпителия роговицы, представляющий пластину с кривизной, соответствующей форме передней поверхности роговицы и снабженную микроиглами, обеспечивающими дозированное проникновение через все слои эпителия, позволяет оптимизировать технологию УФ-кросслинкинга. В эксперименте на донорских глазах обоснован принцип действия инструмента и отсутствие повреждений Боуменовой мембраны и передних слоев стромы роговицы.
2. В эксперименте на животных (кролики породы Шиншилла) установлено, что дозированная скарификация эпителия роговицы с использованием разработанного инструмента завершается полным восстановлением эпителиального пласта на 1-е сутки после операции, в то время, как субтотальная деэпителизация (диаметром 7,5 мм) - лишь к 5-м суткам поле вмешательства.
3. В эксперименте на донорской роговице с использованием инфракрасной Фурье-спектроскопии с целью определения полноты проникновения рибофлавина в строму роговицы доказано, что субтотальная деэпителизация и дозированная скарификация эпителия обеспечивают пропитывание всей толщины стромы роговицы рибофлавином (при инстилляций его 0,1% водного раствора по 1-й капле в минуту на протяжении 30-и минут), о чем свидетельствует достоверное увеличение относительной интенсивности полосы 1542 см-1 ИК спектра, а трансэпителиальная доставка 0,1% водного раствора рибофлавина на протяжении 30 минут (1 капля в минуту) путем предварительной инстилляции на нее 0,5% раствора проксиметакаина, содержащего бензалкония хлорид (1 капля в минуту в течение 30 минут) не сопровождается изменением параметров ИК-спектра и не обеспечивает оптимальных условий для проведения УФ-кросслинкинга.
4. Результатами клинико-функциональных исследований доказано, что оптимизированная технология УФ-кросслинкинга с частичной дозированной скарификацией эпителия роговицы обеспечивает существенное снижение степени выраженности послеоперационного дискомфорта и его продолжительности по сравнению с классической технологией УФ кросслинкинга, предполагающей субтотальную деэпителизацию (в I-й группе в среднем 6,9 ± 1,3 балла (из 10-и), купирование через 3 ± 1,2 суток, во II-й группе в среднем 2,8 ± 1,1 балла (из 10-и), купирование через 1,1 ± 0,4 суток).
5. В результате выполнения клинико-функциональных исследований установлено, что после выполнения УФ-кросслинкинга как по классической, так и по модифицированной технологии в раннем послеоперационном периоде у пациентов биомикроскапически обнаруживается умеренно выраженное облаковидное помутнение роговицы, прозрачность которой полностью восстанавливается к 3-му месяцу после операции, что сопровождается постепенным уменьшением среднего показателя кератометрии роговицы (Кave) с его стабилизацией через 12 месяцев после операции при этом снижение данного показателя, по отношению к исходному значению, составляет 2,6 ± 0,5 дптр (р 0,05) и 2,4 ± 0,3 дптр (р 0,05) в I-й и II-й группах соответственно.
6. В соответствии с увеличением прозрачности роговицы и уменьшением ее кератометрических индексов, происходит восстановление и дальнейшее плавное нарастание показателей остроты зрения в обеих группах: ко 2-му году наблюдения, некорригированная острота зрения в I-й группе оказалась выше, чем до операции на 0,07 ± 0,03 (р 0,05), а максимально корригированная острота зрения выше на 0,11 ± 0,04 (р 0,05), аналогичный прирост показателей во II-й группе составил 0,08 ± 0,02 (р 0,05) и 0,1 ± 0,04 (р 0,05) соответственно.
7. При помощи оптической когерентной томографии переднего отрезка глаза к 2-м годам после операции было установлено снижение средних показателей центральной кератопахиметрии относительно дооперационных на 2,36 ± 0,57% (р 0,05) в I-й группе и 3,17 ± 0,88 % (р 0,05) во II-й группе, при этом демаркационная линия в глубоких слоях стромы роговицы в обеих группах была максимально выражена через 1 месяц после операции на глубине в среднем 327 ± 11 мкм в I группе и 318 ± 13 мкм во второй группе и полностью исчезла к 12-му месяцу после операции.
8. Конфокальная микроскопия после УФ-кросслинкинга позволила выявить следующую закономерность гистоморфологических изменений в роговице in vivo: через 1 месяц после операции в передних и средних слоях стромы отмечали выраженный отек, ацеллюлярность и отсутствие стромальных нервов, а на глубине в среднем 310 ± 9 (от 290 до 335) мкм в I-й группе и 300 ± 8 (от 280 до 330) мкм во II-й группе - наличие зоны перехода от гипоцеллюлярных слоев к слоям с нормальной плотностью кератоцитов; через 3 месяца после операции в передних и средних слоях стромы констатировали наличие частичной репопуляции активированными кератоцитами, а также значительное снижение выраженности отека и отсутствие стромальных нервов; через 6 месяцев после операции была достигнута полная репопуляция роговицы активированными кератоцитами, ее полная стромальная и субэпителиальная реиннервация а также отсутствие отека и увеличенная плотность стромальных волокон и отсутствие достоверного снижения плотности эндотелиальных клеток в течение всего послеоперационного. Указанные изменения в обеих группах были сходными, отличий между группами не наблюдали.
