Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Кристаллохимия апатитов
2.2. Фазовые равновесия в системе СаО-РгОз-ШО 12
2.3. Ортофосфаты кальция 15
2.4. Методы синтеза гидроксилапатита 20
2.4.1. Осаждение гидроксилапатита в водных растворах 20
2.4.2. Получение гидроксилапатита гидролизом ортофосфатов кальция 22
2.5. Морфология кристаллов гидроксилаиатнта и кинетика их роста 25
2.5.1. Влияние ионного состава раствора 30
2.6. Структура и свойства костной ткани *... 32
2.7. Материалы биомедицинского назначения 35
2.7.1. Гидроксилапатитовая керамика 35
2.7.2. Стеклокерамические материалы 39
2.7.3. Покрытия из гидроксилапатита на металлах 40
2.7.4. Композиты гидроксилапатит/полимер 41
2.7.5. Цементы на основе фосфатов кальция 43
2.8. Выводы из анализа литературы 46
3. Методы эксперимента 47
3.1. Синтез образцов 47
3.1.1. Синтез аморфных фосфатов кальция 47
3.1.2. Синтез гидроксилапатита методом осаждения 47
3.1.3. Получение и гидролиз СаНР04'2НгО, СаНР04, о>Са3(Р04)2 48
3.1.4. Синтез модифицированных фосфатов кальция 49
3.1.5. Синтез композиционных материалов гндроксилапатит/желатин 50
3.1.6. Получение цементов 51
3.2. Методы исследования образцов 52
3.2.1. Рентгенографические исследования 52
3.2.2. Электронная микроскопия 53
3.2.3. Фотометрические исследования 53
3.2.4. Инфракрасная спектроскопия 53
3.2.5. Ионометрия растворов 54
3.2.6. Анализ состава образцов и их стехиометрии 54
3.2.7. Биомиметическое тестирование in vitro 55
3.2.8. Механические испытания 55
3.3. Методы обработки экспериментальных данных 56
3.3.1. Обработка рентгенографических данных 56
3.3.2. Обработка данных факторного эксперимента 58
3.3.3. Расчет ионных и фазовых равновесий 61
4. Обсуждение результатов 63
4.1. Получение гидрокснлапатита методом осаждения 63
4.1.1. Исследование морфологии ГАП 63
4.1.2. Исследование кинетики образования ГАП 71
4.1.3. Анализ стехиометрии осадка 73
4.1.4. Рекомендации по синтезу порошков гидрокснлапатита 74
4.2. Синтез и исследование аморфного фосфата кальция 75
4.3. Получение ГАП гидролизом ортофосфатов кальция 84
4.3.1. Гидролиздикальциевых фосфатов 84
4.3.2. Гидролиз а-трикальциевого фосфата 92
4.4. Получение модифицированных фосфатов кальция 104
4.5. Исследование биоактивности материалов 112
4.6. Получение материалов гидроксилапатнт/желатин П7
4.7.Цементы на основе фосфатов и силиката кальция 122
5. Основные выводы 130
6. Список литературы 132
Приложение 1 143
- Получение гидроксилапатита гидролизом ортофосфатов кальция
- Синтез композиционных материалов гндроксилапатит/желатин
- Обработка данных факторного эксперимента
- Получение модифицированных фосфатов кальция
Введение к работе
Увеличение продолжительности жизни, которое должно стать характерной чертой нового тысячелетия, требует решения ряда медико-материаловедческих проблем, в частности, создания материалов для искусственных органов н тканей [1-8]. В настоящее время рынок биоматериалов оценивается суммой -3 млрд.$, прогнозируемый годовой прирост составляет 10%, а объемы требуемых материалов оцениваются на уровне десятков тонн [1]. При утрате значительных по размеру участков кости (вследствие ее механического повреждения или после удаления опухоли) возникает необходимость в возмещении возникшего дефекта. Число больных, нуждающихся в операциях по восстановлению целостности костей, очень велико — только в США это более 1 млн. человек ежегодно [1,2].
Создание биоматериалов для замены поврежденной костной ткани -перелетивная, бурно развивающаяся область исследований. Костная ткань представляет собой композиционный материал па основе ультрадисперсного карбонате о держащего гидрокенлапаткта Са[0-л-у/з(НРО4)х{СОз)у(РО4)б- у(ОН)г_ц и белка коллагена с многоуровневой структурной организацией компонентов [2,3].
В силу сходства химического состава, материалы на основе фосфатов кальция находят широкое применение в медицине при операциях по восстановлению целостности поврежденной кости. Считается, что не только химический состав, но и морфология синтетических кристаллов гидроксил апатита является важной характеристикой, определяющей отклик организма на чужеродный материал [9], С этой точки зрения идеальным является материал, химический состав и гранулометрия которого подобны костному биоминералу: нестехнометрический гидроксилапатит Са]0_х(НРО )к(РО4)б. х(ОН)2-я (0 х 1) с кристаллами в форме пластин размерами 40 х 20 х 5 нм и осью с" кристаллической структуры, лежащей в плоскости кристалла,
В настоящее время в медицинской практике наиболее широко используются крупнокристаллические керамические материалы в форме плотных и пористых блоков и гранул. Клинические испытания показали, что крупнокристаллический гидроксилапатит (ГАП) значительно медленнее превращается в новую костную ткань по мере резорбции (растворения в организме) в отличие от высокодисперсных материалов - аморфного фосфата кальция (АФК) или нанокристаллических фосфатов кальция [1,2].
Разработанные к настоящему времени растворные методы синтеза ГАП позволяют получать высокодисперсные порошки, форма частиц которых, в зависимости от условий синтеза, непредсказуемо варьируется в широких пределах от равноосной до игольчатой. Тем не менее, информация о влиянии параметров синтеза ГАП на морфологию конечного продукта, выраженная в явном и количественном виде, отсутствует. Отмечается, что образцы порошков фосфатов кальция, полученные в рамках одинаковой методики синтеза, вызывают различную реакцию организма» вплоть до полного отторжения материала [9]. В этой связи возникает целый ряд химико-материаловедческих задач в области синтеза фосфатов кальция с заданным составом и микроморфологией, оценки их будущей биоактивности in vitro и разработки приемов корректировки биоактивности путем химического модифицирования получаемого порошка.
Целью работы являлся направленный синтез биологически активных фосфатов кальция с заданным составом и микроморфологией и создание биорезорбируемых композиционных материалов на их основе.
«Биоактивность» - комплексная характеристика совместимых с организмом материалов, учитывающая, помимо биологических процессов роста й дифференциаций клеток, также: (а) скорость растворения материала в слабокислой среде создаваемой определенными группами клеток; (б) скорость осаждения гндроксил апатита из межтканевой жидкости организма на поверхности материала, В данной работе процессы растворения и осаждения ГАТТ изучались в модельных растворах, имитирующих состав жидких сред организма.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
L Систематическое исследование влияния параметров синтеза ГАП методом осаждения (рН, температура, состав раствора, ионная сила, время синтеза) на микроморфологию и состав получаемого фосфата.
2. Исследование кинетики синтеза ГАП путем гидролиза других ортофосфатов кальция; выявление влияния условий гидролитического синтеза на морфологию кристаллов ГАП,
3. Модификация химического состава ГАП с целью повышения его биоактивности; оценка биоактиБности полученных материалов в процессе модельных реакций растворения/осаждения in vitro.
4. Создание модельных композиционных материалов типа ГАП/биополимер и многокомпонентных цементов на основе синтезированных в работе фосфатов кальция.
Основные методы исследования, которые использовались в работе: рентгенография, растровая и просвечивающая электронная микроскопия, ИК спектроскопия, автоматическая ионометрия, рентгеноспектральний микроанализ, химический анализ, механические испытания.
В литературном обзоре рассмотрены кристаллохимические особенности апатита, приведены данные по фазовым равновесиям ортофосфатов кальция, краткие характеристики соединений и методы их получения. Рассмотрены вопросы, связанные с кинетикой роста гидроксилапатнта в водных растворах, влиянием ионного состава среды на морфологию частиц ГАП- Разделы методы эксперимента и методы обработки экспериментальных данных содержат подробное описание использованных экспериментальных методик и методов математической обработки полученных данных.
Полученные результаты представлены и обсуждаются в соответствии с целью и задачами настоящей работы.
Научная новизна работы состоит в следующих положениях, которые выносятся на защиту:
1. Систематически исследовано влияние параметров (факторов) синтеза ГАП методом осаждения из растворов солей (начальная концентрация реагентов, рН, температура) на размер и форму получаемых кристаллов. Морфологические характери стики кристаллов ГАП были установлены в результате совместного применения полнопрофильного рентгенографического анализа и просвечивающей электронной микроскопии.
2. В результате регрессионного анализа морфологических характеристик кристаллов получены математические модели, позволяющие количественно оценить факторы синтеза ГАП методом осаждения. Установлен значительный вклад двойных эффектов взаимодействия факторов при синтезе ГАП из Са(гТОз)2 и тройного эффекта при синтезе из Са(СНзСОО)2- Интерпретация регрессионных моделей дана на основании расчетов ионных равновесий в растворах солей.
3. Впервые обнаружена мезопористая структура аморфного фосфата кальция с размерами пор 5 - 50 нм и предложена модель ее образования. Изучено наследование пористости нанокристаллами ГАП, полученными кристаллизацией АФК.
4. Показано, что при синтезе ГАП гидролизом трнкальциевого фосфата а-Саз(РСЫ)2 (ТКФ) с примесью гидрокс ил апатита скорость реакции падает с увеличением степени химической неоднородности материала, задаваемой соотношением Са/Р исходных реагентов при синтезе ТКФ. Впервые отмечено, что рост температуры гидролиза приводит к изменению морфологии ГАП с пластинчатой (при 40 °С) на игольчатую (при 100 °С).
5. Предложен метод синтеза, позволяющий проводить химическую модификацию ГАП посредством частичного замещения фосфатных групп на силикатные (до 4% вес. кремния). Показано, что кремнийсодержащий ГАП обладает большей растворимостью в слабокислых растворах по сравнению с незамещенным гидроксилапатитом.
Практическая значимость работы заключается в следующем:
L Получены регрессионные уравнения, позволяющие путем выбора определенных параметров растворного синтеза проводить направленное получение высокодисперсных порошков ГАП с кристаллами требуемого размера, формы и состава. Для контроля микроморфологии получаемых кристаллов может быть использована апробированная в работе методика полнопрофильного рентгенографического анализа в варианте для анизотропной частицы.
2. Синтезированные в работе порошковые материалы ранжированы по биоактивности на основании скорости растворения при рН = 4-6, Использованная методика может быть рекомендована как простой прием предварительного тестирования биоматериалов invitro.
3. Предложены цементные смеси фосфатов и силикатов кальция, компактные материалы на основе которых демонстрируют прочность 5-13 МПа после трехдневной обработки в растворе искусственной межтканевой жидкости и могут быть использованы в стоматологии для заполнения внутренних полостей зубной ткани любой формы. Методом двойной диффузии через проницаемую полимерную мембрану получены композиционные материалы ГАП/желатин; примененная методика может быть использована для биомиметического синтеза резорбируемых композитов.
4. Рекомендовано использовать мезопористый АФК с высокоразвитой поверхностью, а также цементные материалы с добавками биополимера, в качестве систем-носитеяей лекарственных препаратов локального пролонгированного действия. Данная идея реализована на примере инкапсуляции антибиотика широко спектра действия (гентамицина) в композит силикофосфатный цемент/желатин.
Материалы диссертационной работы опубликованы в 11 работах, в том числе в 4-х статьях и в тезисах 7 докладов на международных научных конференциях.
Настоящая работа является частью систематических исследований, проводимых на Факультете наук о материалах МГУ и в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета МГУ в рамках программы поддержки ведущих научных школ России (грант НШ-2 03 3.0 3.2003), Часть работы была выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ 02-03-33271, ОЗ-ОЗ-42524-з) и программы "Университеты России 1 (грант УР.Об.03.006).
Автор считает своим приятным долгом выразить благодарность студентам Факультета наук о материалах МГУ Ошицыной О.В., Плохих Н.В., Кузнецову А.В., Соину А-В., Ковалевой Е.С., аспиранту Гаршеву А.В, за активное участие в получении результатов; всем сотрудникам и аспирантам лабораторий неорганического материаловедения, сотруднику Химического факультета МГУ Бобылеву A.IL за помощь в проведении спектроскопических исследований, а также Prof. М, Epple (Университет Рур Бохума, г, Бохум, Германия) и Dr. A. Ravaglioli (Исследовательский институт керамических технологий, г. Фаенца, Италия) за плодотворное сотрудничество.
Получение гидроксилапатита гидролизом ортофосфатов кальция
Полученные растворными методами порошки в большинстве случаев ГАП имеют большую поверхность 10п м /г и малый размер кристаллитов — 100-200 нм [14, 37-79], Размеры и габитус кристаллов определяются временем кристаллизации, температурой, составом раствора, степенью пересыщения, ионной силой, рН, порядком добавления н интенсивностью леремешивания реагентов. Разнообразие морфологии кристаллов ГАЛ связано с тем, что синтез проводится в сильно неравновесных условиях, большое влияние на форму кристаллов оказывают примеси.
На практике морфология кристаллов определяется скоростью роста его граней [80-82]. С точки зрения кинетики наибольшую скорость роста демонстрируют грани с максимальной плотностью перегибов. Молекулярно гладкие F грани (см. рисунок. 2.15) медленно растут за счет механизмов спирального роста или двумерного зародышеобразован ия.
Для роста S и К граней, имеющих высокую плотность перегибов, не требуется двумерного зародышеобразования. Скорость их роста велика и линейно возрастает с пересыщением [80]. Теории, объясняющие механизмы и скорость роста кристаллов можно классифицировать следующим образом: теории поверхностной энергии, теория адсорбционного слоя и теория диффузии [80]. Теория поверхностной энергии основываются на идеях Гиббса о том, что растущий кристалл принимает форму с минимумом поверхностной энергии. Диффузионные теории предполагают непрерывное осаждение материала на грань растущего кристалла со скоростью R, пропорциональной разности концентраций в пересыщении:
В рамках теории адсорбции рост кристалла - непрерывной процесс, идущий путем адсорбции ростовых частиц на грань кристалла, слой за слоем. Частицы не сразу встраиваются в решетку, а могут мигрировать по поверхности (поверхностная диффузия) в положения, наиболее энергетически выгодные (например, в места перегибов). В рамках поверхностно-диффузионной теории скорость роста по спирали (например, в месте выхода на поверхность винтовой дислокации) описывается параболическим уравнением:
Закон изменения скорости при двумерном зарождении (особенно, полизародышевом) имеет экспоненциальный (степенной) вид: В общем случае скорость роста (растворения) кристаллов может быть записана, как: где к — константа, F и С — функции поверхностных свойств и концентраций. В методе постоянного состава раствора можно считать, что С - константа, т.е. изменения скорости роста связаны исключительно с изменением активности поверхности.
Было показано, что скорость роста СаНРО НгО при 25-37 С подчиняется параболическому закону R г [81]. Это означает, что концентрация активных точек перегиба на поверхности кристалла является функцией пересыщения (в рамках этой модели рост кристаллов ДКФД осуществляется осаждением ионов в точки перегиба).
В настоящий момент хорошо установлено, что рост большинства фосфатов кальция (ДКФД, ОКФ, ГАП) контролируется поверхностными процессами [81]. В отличие от ДКФД, растущего по механизму спирального роста, порядок реакции п=4 в случае октакальциевого фосфата CaatHPC MPO+ySHaO в диапазоне пересыщений 0.45 а 1.05 свидетельствует о полизародышевом механизме роста. При более высокой движущей силе 1.11 а 1.69 скорость роста пропорциональна пересыщению и зависит от скорости перемешивания- Т.е. при возрастании пересыщения рост ОКФ контролируется диффузией к поверхности. При о 0,6 ОКФ растет по механизму спирального роста [81].
В случае фторапатита при 2 S 7 при рН = 5,6,5 и гидроксилапатита при рН — б, 7,2 (Са/Р — 0,1-20) отмечен полизародышевый механизм роста [82]. При исследовании роста ГАП на различных затравках (ГАП, ДКФД, CaF2, СаСОз) была показана линейная связь между скоростью роста и концентрацией затравки (при рН = 6-8.5 и Тс - ОД - 0.3
Небольшие количества примесей в растворе могут изменять скорость роста и морфологию кристаллов. «Отравляющие» рост примеси обычно наблюдаются либо адсорбированными на перегибах и ступенях роста, либо образуют эпитаксиальнын слой, кристаллографически подобный растущей грани [80]. В первом случае изменение формы роста связано с изменением скорости движения ступени (физическое блокирование ступени примесью). Во втором случае происходит экранирование грани от маточного раствора.
На морфологию кристаллов ГАП помимо адсорбции также может оказывать влияние и изоморфное замещение ионов Са2+, РО43", ОН" в структуре гидроксилапатита на другие ионы, присутствующие в растворе: СОэ ", СГ, F, Na+, Mg +, Zn + и др. [83-96].
Присутствие в растворе карбонат-ионов приводит к росту кристаллов карбонатапатита А-типа Саю(Р04)б(ОН)2.х(СОз)х/2 и Б-типа Са1&_хЫах(РС 4)б-х(СОэ)х(ОН)2 с различным форм-фактором в зависимости от содержания карбоната (рис.2.16) [15, 85, 89-96]. Б-карбонатапактит более точно соответствует составу взрослой костной ткани, чем незамещенный ГАП [6,8]. Сообщается о возможности получения полностью замещенного А-карбонатапатита Сак,(Р04)бС03 в системе CaCI2- (NRO2HPO4 - (NH4)2C03 -NH3 - Н20 при 25 С [64, 85].
Ионы фтора сравнительно легко замещают гидроксил в растворах, формируя фторапатит (ФАП) Саю(Р04)бРг на поверхности ГАП. ФАП (-IgTIP = 119-122) менее растворим, чем ГАП (-1цПР - 117) [87, 88], Фторид-ион способствует осаждению крупных столбчатых кристаллов фторапатита с гексагональной огранкой. Некоторые апатиты биологического происхождения содержат как фгор, так и карбонат-ионы [6, 12].
Катионы магния существенно тормозят рост кристаллов гидроксилапатита, при Mg/Ca 0.2 ингибируют кристаллизацию ГАП из аморфного фосфата кальция [83]. При содержании магния [Mg]/([Mg]+[Ca]) 0-25 в растворе кристаллизуется фаза Ca9MgH(P04)7 [26]. Ионы цинка являются еще более сильными ингибиторами образования ГАП, чем ионы магния: они на три порядка сильнее подавляют рост апатита в направлении [001] (рис.2.17) [26, 27, 83, 84].
Синтез композиционных материалов гндроксилапатит/желатин
Поэтому в ранний послеоперационный период нмплантат не должен подвергаться значительным механическим нагрузкам. Наиболее типичный путь получения высокопористой ГАП керамики (с размерами пор 100-600 мкм) - отжиг порошка гйдроксилапатита с порообразующимн добавками парафина, нафталина, перекиси водорода, целлюлозы [103, 111]- Также используют коралл (основное вещество СаСОз), который в ходе гидротермальной обработки переходит в ГАП (250 С, 24-48 ч), сохраняя исходную микроструктуру и открытую пористость [2].
Пористая керамика на основе ГАП находит широкое применение в медицине в форме блоков и гранул в качестве наполнителей костных дефектов, носителей в методах адресной доставки лекарственных средств в организм (Drug Delivery Systems), стоматологии (рис.2.20) [107, 108].
С целью улучшения механических характеристик проводят армирование апатитовой керамики различными добавками (вискерами ГАП, металлическими частицами, ZrCh, АІ2О3, SiC SiiN и др.). Другой тип керамических композитов - смеси ФК» состав и соотношение фаз которых является средством контроля их биологических свойств; ГАП-ТКФ, ГАП-СаЭО Трикальциевый фосфат обладает большей по сравнению с гидроксилапатитом растворимостью [2,98,101,110].
Существенным недостатком чистой ГАП керамики является крайне низкая скорость ее резорбции (растворения) в контакте с межтканевыми жидкостями в организме - на уровне 15 мкм в год [2]. Скорость биодеградации зависит от морфологии частиц, гранулометрии, стехиометрии, условий среды. Зачастую гидроксилапатитовую керамику классифицируют как биосовместимую, но не биоактивную [2, 16]. Крупные гранулы гидроксилапатитовой керамики присутствуют в организме длительное время (очень медленная резорбция), что нежелательно.
Биоактивные стекла (в системе NaiO-CaO- Os-SiCb) проявляют высокую биоактивность и биосовместимость (рис.2.21) [1], При создании большинства стекол используется состав марки 4555 24.5% вес, Na20, 24.5% весСаО, 45-0% вес. SiC , 6% вес. Р2О5. Варьируя состав стекломатериалов, можно существенно изменять их биоактивность и резорбируемость (рис.2.21) [1,2, 98, 100].
Существует несколько типов стеклокерамических композитов- Один из них - так называемая стеклокерамика, которую получают кристаллизацией ГАП или/и волластонита CaSiCb из стекломатрицы в ходе соответствующего отжига [98, 112]. Биоактивная стеклокерамика имеет прочность порядка 100-200 МПа, Кіс - 1.0-2.6 МПа/м1Д, модуль Вейбула m = 9, коэффициент докритического подрастания трещины n = 18-33.
Композиты ГАП/биостекло получают также в ходе простои процедуры отжига соответствующей смеси порошков. Если такой отжиг проводится при температурах ниже 1000 С, то гидроксилапатит практически не вступает в химическое взаимодействие со стеклом, что зависит также и от состава стекла. Другой подход - легирование ГАП керамики малыми добавками биостекла с целью улучшения прочностных характеристик материала, достижения большей его плотности [110]. Величина К\с для таких материалов 1.3-1.7 МПа с1 2 [2]. Зачастую добавки стекла активируют распад ГАП с образованием значительных количеств ТКФ.
В настоящее время ГАП находит широкое применение в качестве материала для покрытий металлических имплантатов (главным образом, титана и его сплавов) (рис.2.20) [2, 16]_ Металлы в большинстве случаев токсичны. Их роль как биоматериала - нести на себе высокую механическую нагрузку в ходе эксплуатации. Покрытие из ГАП выполняет сразу несколько функций. В первую очередь, оно обеспечивает прочную фиксацию имплантата и кости. Покрытие выступает в качестве барьера между металлом и средой, минимизирует отрицательную реакцию организма на чужеродное тело, препятствуя отравлению организма ионами металла [2, 113-116]. В случае пористых имплантатов гидроксилапатит активизирует прорастание костной ткани в поры. Наиболее часто используемая методика получения покрытий — плазменное напыление. Толщина получаемых покрытий 40-200 мкм [2]. Покрытие должно быть достаточно толстым (с учетом резорбции ГАП со скоростью 15-30 мкм в год)- С увеличением толщины естественно уменьшается влияние металла на организм. Соответственно, покрытие не должно содержать примесных фаз (ТКФ, АФК, СаО), которые уменьшают химическую стабильность и увеличивают! деградацию [2Д6]. Вторые фазы легко образуются в системе, если процесс напыления проводится с недостаточной технологической точностью. Другая общая проблема покрытий из керамики на металлах - плохое «сцепление» слоев. Для улучшения адгезии ГАП - метал используют буферные слои из биостекол или CaiSiCU [2].
Суставные протезы с покрытиями из ГАП широко используются в настоящее время (рис,2.20). В Европе уже имплантировано порядка 200,000 таких изделий. Качество имплантатов улучшается год от года [2], Но в ряде случаев отмечена деградация керамических покрытий, наблюдалась ускоренная резорбция костной ткани вокруг протеза из-за большой жесткости материала имплантатов по сравнению с костной тканью. В ряде случаев отмечена отрицательная реакция организма на титан в его сплавы.
Обработка данных факторного эксперимента
Микроморфология порошков ГАП является важной характеристикой, которая во многом определяет области практического использования калыщйфосфатных биоматерналов [2, 14], Проведенное исследование является частью более общей задачи -исследования кинетики роста кристаллов ГАП при различных наборах управляющих параметров растворного синтеза. Следует отметить, что выбор условий постановки кинетических экспериментов подразумевает наличие у исследователя информации о «весе» каждого параметра синтеза (фактора) и результатах их совместного действия (взаимодействия факторов) на два характерных размера анизотропного кристалла ГАП: вдоль оси [001] и перпендикулярно ей. Именного такая информация, не выраженная в явном и количественном виде в обширной литературе по методам синтеза апатита, и была получена в настоящей работе. Среди возможных факторов, которые могут потенциально влиять на морфологию синтезированных из раствора кристаллов ГАП — начальной концентрации растворов, рН, температуры синтеза, ионной силы раствора, концентрации примесного нона-модификатора, времени синтеза, были отобраны три первых. Именно их приходится выбирать при планировании любого варианта осаждения ГАП из раствора, в то время как введение примеси не является непременным атрибутом синтеза, а уровень ионной силы в большинстве случаев фиксируют фоновым электролитом (обычно, хлоридом натрия). Параметр времени на дано этапе работы был намеренно исключен из рассмотрения (зафиксирован), поскольку его введение означат постановку кинетического, а не факторного эксперимента. Время синтеза - 7 сут, было выбрано таким образом, чтобы обеспечить прохождение всех процессов, предваряющих рост кристаллов ГАП (образование АФК и превращение его в апатит, см главу 4.2).
Помимо указанных, имеется дополнительный фактор - анионный состав раствора (т.е., состав Са-содержащей соли). В данной работе были использованы нитрат и ацетат кальция, и это приводит к двум различным факторным экспериментам. Выбор этих солей их большой растворимостью в воде: s саогазр нго = 428 20 г/100 г И20 и s смснзсоо нго = 43.6 20 г/100 г Н2О. Нитратный анион относится к числу немодифицирующих, т,к. он не встраивается в структуру ГАП и не подвержен гидролизу (активно не участвует в ионных равновесиях). Ацетатный ион активно участвует в ионных равновесиях: гидролизуется и уменьшает кислотность среды, связывает ноны кальиия, образуя ионный ассоциат СНэСООСа (lgOO = 1.18, где к - константа образования ионной пары). Вопрос о возможности встраивания ацетата в структуру апатита не ясен. Отмечается, что ацетатный ион способствует образованию октакальциевого фосфата при 40 С в почти нейтральной среде [14].
По результатам, полученным после обработки обобщенных данных по размерам кристаллов гидроксилапатита методом ортогональной регрессии, были получены следующие зависимости форм-фактора F и размеров частиц Lc, La (вдоль [001] и [010] соответственно) от условий синтеза с использованием нитрата кальция (см. Приложение 3):
Из сопоставления значений коэффициентов в уравнении (4.1) можно сделать вывод, что все управляющие параметры синтеза оказывают существенное влияние на форму кристаллов. С увеличением исходной концентрации кальция, рН или температуры синтеза форм-фактор частиц и их линейные размеры возрастают. Действительно, наши данные хорошо согласуются с литературными, согласно которым при высоких температурах, как правило, получаются кристаллы ГАП игольчатой формы [2,62]. Можно видеть, что коэффициент при температурном слагаемом в уравнениях (4.1, 4.3) имеет наибольшее положительное значение. Сильная зависимость формы кристаллов от температуры связана с резкой температурной зависимостью размера кристаллов вдоль оси «с» (вдоль направления [001]). Существенный вклад оказывают не только линейные члены регрессии, но также и смешанные эффекты. Влияние двойных эффектов не может быть учтено (н оценено) при обычной постановке эксперимента, когда варьируется лишь один параметр, а остальные зафиксированы.
Более наглядно взаимосвязь параметров можно представить в виде проекций значений исследуемых параметров в двухмерных координатах (т.е. в виде линий уровня на плоскости в зависимости от двух параметрах при фиксированном третьем), построенных на основании уравнений (4.1)-(4.3) (см. рис. 4.1).
Один из наиболее спорных вопросов — роль рН в контроле морфологии ГАП. Анализ полученных данных показывает, что в сильно щелочном растворе габитус частиц определяется совместным влиянием факторов концентрации и температуры. При низких рН 7 «переключение» формы кристаллов с равноосной на игольчатую обеспечивается температурой (рис.4.1, в,г), т.о., полученные данные убедительно демонстрируют эффект взаимного влияния параметров синтеза - рН и начальной концентрации кальция на форм-фактор частиц. При увеличении численного значення одного из этих факторов возрастает роль второго. Этот эффект можно объяснить изменением ионных равновесий в данной системе при вариациях указанных параметров. В сильно щелочной среде доминирующей ионной формой в растворе является ионный ассоциат CaP(V, в нейтральной среде преобладают ионы - HPG43", Са2+ (см. Приложение 4).
Как уже ранее отмечалось, изменение форм-фактора частиц ГАП в основном связано с резким ростом кристаллов вдоль оси [001] при плавном изменении их размера в перпендикулярном направлении (протяженности в плоскости (001)) (рис.4.2). Следует отметить, что влияние рН на изменение поперечного размера кристаллов противоположное, чем для длины. В щелочной среде доминирует фактор температуры, определяющий изменение ширины кристаллов, в нейтральном растворе основную роль в изменении толщины играет концентрация кальция (рисАЗ. а,б).
Ранее уже высказывалось предположение, что влияние факторов, в том числе и совместное, может быть обусловлено ионными равновесиями в растворе при синтезе ГАП (изменение температуры рН, сходной концентрации приводит к изменению и концентраций ионных форм). Так, расчеты для растворов низкой концентрации при 20 С ([Са2+] = 10 мМ) показывают, что при получении ГАП из нитрата кальция в начальный момент времени при рН 7 доминирующие ионные формы - Са2 , СаНРО и НРО42"- При рН 12 в растворе преобладают СаРО-Г Са+. При нагревании до 80 С при рН 7 возрастает доля CaPCV и СаНРСМ за счет уменьшении содержания ионов Са + и фосфата. При рИ 12 на порядок возрастает содержание СаОН , и эта ионная пара становится одной из основных наряду с CaPCV (рис.4,4.)
Получение модифицированных фосфатов кальция
Среди требований, которые адресуют биоактивным материалам, применяемым в медицинской практике для восстановления целостности костной ткани, на первом плане стоят относительно высокая скорость растворения (на уровне десятков мкм в год) и активная роль поверхности в биохимических реакциях, протекающих па границе раздела кость/имплантат, с участием клеток, специфических для процесса остеосинтеза [2,9], Говоря о скорости резорбции материала, находящегося в контакте с межгканевой жидкостью организма, принято сравнивать новые материалы с уже используемыми & медицине - керамикой на основе гидроксилапатита и на основе р-трикалъциевого фосфата [1,2]. Крупнокристаллическая керамика на основе ГАТТ резорбируется крайне медленно, включения искусственного материала можно обнаружить в кости по прошествии многих лет; это естественным образом коррелирует с произведение растворимости ПРГАЛ - 10" (при 25 С). Керамика, полученная с использованием Р-Саэ(Р04)г (ПРрткФ ЮJ растворяется столь быстро, что растущая кость не успевает заполнить появляющиеся полости [2,57]. Как отмечалось выше, скорость растворения материала зависит от величины его поверхности и ее физико-химических характеристик (строения, состава, дефектности). Последние определяют отклик организма на инородный имплантат [1,9]. Биоактивные материалы характеризуются быстрым срастанием с костной тканью посредством образования промежуточного слоя ГАТТ, образующегося: 1) по механизму растворение фосфата кальция осаждение гидроксилапатита, 2) за счет осаждения ГАП на поверхности имплантата из пересыщенной межтканевой жидкости.
Практически важная процедура оценки такой интегральной характеристики биоматериала как «биоактивность» подразумевает тестирование in vivo [7]. Такая процедура является дорогостоящей, требует больших временных затрат, сопряжена с риском, ее моральный и законодательный аспекты недостаточно проработаны и по сей день. В силу указанных обстоятельств ведется активная разработка методик, позволяющих на раннем этапе (т.е., на доклинической стадии) ранжировать материалы по степени биоактивности в ходе выполнения относительно простых экспериментов in vitro, моделирующих упомянутые выше реальные процессы в организме человека - растворение материала и осаждение ГАП на поверхности материала из растворов, подобных жидкостям организма [6,7].
В настоящей работе скорость резорбции полученных ранее материалов изучалась в ходе модельных реакции по растворению в слабокислых растворах. Были реализованы два варианта растворения материалов — «статический», включающий в себя потенциометрическое измерение активности ионов кальция по мере растворения материала в ацетатном буфере с рН = 4.5, и специально разработанный «динамический», когда к суспензиям порошков фосфатов кальция с постоянной скоростью добавлялись малые порции соляной кислоты и автоматически регистрировалось значение рН раствора (рисА56.,4.57.). Считая адсорбцию протона из раствора на поверхности материала важным элементарным актом процесса растворения, можно попытаться проанализировать полученный выше ряд растворимости апатитов с точки зрения кислотно-основных свойств поверхности. Если допустить обогащение поверхности частиц соответствующим примесным анионом (за счет сегрегации, см. главу 4.4., стр. 108, 111) то наиболее основными поверхностями должны быть поверхности модифицированного и Si-ГАП, поскольку константа основности карбонат-иона меньше таковых для фосфатного и силикатного анионов.
Отсюда, помимо того, что адсорбция протона не является лимитирующей стадией растворения, можно сделать заключение о характере модифицирующего действия анионов. По-видимому, большое значение имеет деформация є, вносимая анионом в поверхностный слой; она является наибольшей для карбонатсодержащего ГАП среди других изученных материалов. Зависимость удельной скорости растворения от локальной деформации, производимой примесным анионом, R=J(t) - должна быть возрастающей функцией. Можно с полным основанием трактовать величину , как микроискажения решетки, приводящие, в частности, к дополнительному упгирению рентгеновских линий. В этой связи прецизионный рентгенографический анализ материала, позволяющий определить компоненты тензора микродеформаций, мог бы стать интересным априорным методом оценки биоактивности материала по цепочке микродеформация — скорость растворения — биоактивность.
Исследование осаждения ГАЛ из растворов на поверхность материалов проводилось в ходе гермостатирования образцов в растворе, моделирующем состав межтканевой жидкости организма (см. стр 55 главы 3), пересыщенной относительно ГАЛ (lg(oTAn) = 9.1). Данный тест является более комплексным, чем вышеописанные эксперименты по растворению, поскольку в ходе его могут происходить процессы и растворения (если образец представляет собой модифицированный ГАП или, например, ТКФ) и осаждения ГАП на поверхность образца из пересыщенного раствора.
Анализировалось образование «ажурного» слоя гидроксилапатита на поверхности таблеток различных фосфатов кальция, толщина слоя (по истечении 3 суток обработки) служила количественной мерой биоактивности поверхности материала (см, рисА69.)-Микроструктуры ГАП покрытий у всех рассмотренных материалов идентичны. Наибольшая толщина слоя осажденного ГАП соответствует ct-трикальциевому фосфату, что связано с наибольшей растворимостью этого фосфата в ряду рассматриваемых материалов (высокой степенью пересыщения раствора относительно ГАП), а также возможностью протекания реакций гидролиза ТКФ с образованием ГАП на поверхности таблетки. Среди гндрокенлапатитов наибольшую активность проявляет кремнийсодержащий материал, несмотря на более высокую растворимость карбонатсодержащего ГАП. Высокую поверхностную активность Si-ГАП, как и в случае биоактивных стекол, можно связать с образованием на поверхности материала силанольных -SiOH групп, активно участвующих в процессе минерализации интерфейса. Такой материал интенсивно обменивается нонами кальция и фосфата с раствором, силанольные группы прочно связывают ноны кальция, способствуя формирования слоя аморфного фосфата кальция на поверхности, расслоение и кристаллизация которого приводит к формированию ажурного слоя, состоящего из частиц карбонатгидроксилапатита размерами — 10 нм (см. рис.4.69.).
Описанные выше эксперименты демонстрируют применимость метода модельных реакций для предварительной оценки биоактивности кальцийфосфатных материалов. С их помощью показано, что анионное модифицирование материала приводит к его большей реакционной способности в процессах растворения-осаждения ГАП в средах, близких к физиологическим жидкостям.
