Введение к работе
Актуальность проблемы.
Антимикробный эффект молочнокислых бактерий человечество использовало в той или иной форме в течение столетий для продления срока годности пищевых продуктов за счет образования молочной кислоты с сопутствующим понижением рН, а также биологически активных веществ, обладающих бактерицидным действием на специфические группы микроорганизмов, включая и патогенные формы. Ведущее место в объяснении явления антагонизма молочнокислых бактерий отводится специфическим антибиотическим веществам белковой природы – бактериоцинам. Бактериоцины – это гетерогенные антибактериальные комплексы, разнообразные по уровню активности, спектру и механизму действия, молекулярной массе, физико-химическим свойствам, но основной биологически активной частью всех бактериоцинов является белковый компонент (Блинкова и др.,1984; 2004; Егоров и др.,1999; Nes et al., 2007). Считают, что бактериоциногения – явление, закономерное практически для всех видов бактерий. Говоря об экологическом значении бактериоцинов, необходимо отметить, что синтез этих веществ выполняет главную роль в конкуренции внутри популяции.
Интерес к использованию бактериоцинов, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые химические консерванты и некоторые антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1998 года имеющий «GRAS» (Generally Recognized As Safe) cтатус, т.е. признанный Европейским парламентом как безопасный. Экспертный комитет по пищевым добавкам FAO/WHO (Пищевая и Сельскохозяйственная Организация ООН / Всемирная Организация Здравоохранения) рекомендовал использование низина в качестве консерванта для пищевых продуктов (код Е234). Низин не является чужеродным веществом для пищеварительного тракта человека, поскольку низинобразующие лактококки выделяют из слизистой носоглотки, а также кала животных и людей. Установлено, что низинобразующие штаммы имеют функцию поддержания экологического равновесия группы молочнокислых бактерий кишечного тракта. Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается, не оказывая влияния на микробиоту желудочно-кишечного тракта, не токсичен (Ross et al., 1999; Nete et al., 2006). Описаны несколько форм низинов (A, B, C, D, E, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия, продуцентами которых являются разные штаммы одного подвида Lactococcus lactis subsp. lactis. Однако активность описанных природных продуцентов низкая (от 579 до 1886 МЕ/мл) и антимикробный спектр действия низина распространяется, в основном, на грамположительные бактерии (Franz et al., 1997; Buyong et al.; 1998, Janes, 1999; Lee and Paik, 2001; Zendo et al., 2003; Yildirim et al., 2004; Porgtharaqkui and Demirci, 2006).
Синтез бактериоцинов - наследственная особенность микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. В большинстве популяции лактококков синтез бактериоцинов можно индуцировать генно-инженерными методами, различными физико-химическими воздействиями: ультрафиолетовыми лучами, мутагенами химической природы, ДНК-тропными веществами, перекисями и другими агентами. Разработка методов селекции продуцентов низина началась еще в 70-ые годы ХХ-го века, но, к сожалению, была приостановлена. Вследствие этого в настоящее время имеются немногочисленные данные по этому вопросу.
Сегодня известны два основных производителя низина. Фирма «Aplin & Barrett, Ltd» (Beaminster, Dorset, UK) производит продукт «Низаплин», а «Chr. Hansen A/S» (Hoersholm, DK) выпускает «Кризин». Препараты обеих компаний имеют очень схожие характеристики, содержат 2,5% активного компонента, который переводится на антимикробную активность как 1х106 МЕ/г. Получают их путем ферментации с помощью селекционного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis (Breukink, de Kruijff, 1999).
В настоящее время учёные многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами или же пытаются получить новые природные сбалансированные бактериоциногенные комплексы, безопасные для использования в качестве биоконсервантов. Возможность конструирования новых антимикробных аналогов (бактериоцинов) в перспективе может оказаться главным методом борьбы с антибиотикоустойчивыми патогенными бактериями. Особый научный интерес представляют молочнокислые стрептококки серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда отнесены микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. Поэтому лактококки, как и их бактериоцины, могут быть использованы в качестве природных биологических консервантов.
Завышенное потребление теплоэнергоресурсов и потери продукции до 30% при транспортировке, переработке и хранении являются актуальными проблемами Агропромышленного комплекса РФ. Экономический эффект от использования низина в консервной промышленности велик и обусловлен сокращением продолжительности стерилизации продуктов и увеличением сроков их реализации: на 15-25 % снижаются теплоэнергозатраты, сохраняются биологическая и пищевая ценность продукта питания, продлеваются сроки хранения (Кудряшов и др., 1995). Создание технологии производства бактериоцинов в России позволит отказаться от закупки дорогостоящих препаратов, а использование высокоактивного продуцента определит рентабельноть производства бактериоцинов.
Цель и задачи исследования.
Цель исследований состояла в получении новых высокоэффективных бактериоцинов, образуемых лактококками Lactococcus lactis subsp. lactis, для практического использования в качестве биологических консервантов.
Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
скрининг природных бактериоцинобразующих штаммов лактококков из естественной среды обитания молочнокислых бактерий, какой является коровье и кобылье молоко, кисломолочные продукты лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон, идентификация перспективных штаммов;
получение активных продуцентов бактериоцинов с использованием методов клеточной инженерии (протопластирования, слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза;
на основе высокопродуктивных бактериоцинобразующих штаммов оптимизировать процесс синтеза бактериоцинов;
разработать методы выделения, очистки и идентификации новых бактериоцинов;
показать возможность практического использования бактериоцинобразующих лактококков и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.
Научная новизна работы.
Впервые проведен скрининг бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков из лечебно-профилактических национальных продуктов смешанного молочнокислого и спиртового брожений курунги (Бурятия), Doogh (Иран), также из коровьего и кобыльего молока разных территориальных зон. Выделены новые высокоактивные бактериоцинобразующие природные штаммы: из свежего коровьего молока Московской области - штамм 119х с низинсинтезирующей активностью 3700 МЕ/мл (а.с. № I55I744), из Бурятии - штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия, что является неизвестным свойством для лактококков этого вида. Выделенные штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis.
Разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы для регенерации протопластов, изучено влияние протопластирования на физиолого-биохимические свойства лактококков, в том числе и на синтез бактериоцинов. Установлено, что протопластирование, реверсия протопластов к клеточной форме и слияние протопластов лактококков могут служить методами селекции активных форм. Получены продуценты, в 10 – 14 раз превышающие активность родительских штаммов (а.с. № 1687616, серебряная медаль ВДНХ).
Оптимизирован синтез бактериоцинов компонентным составом среды за счет снижения содержания фосфата, замены углеводного компонента, внесения аминокислот и рН-статирования.
Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых перспективными штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения. Получены и изучены их индивидуальные компоненты в хроматографически чистом виде. Установлено, что бактериоцины, синтезируемые гибридным штаммом F-116 и оригинальным природным штаммом 194, не имеют аналогов в компьютерной базе данных природных биологически-активных веществ BNPD (“Bioactive Natural Product Database”, Вerdy, Hungary).
Практическая значимость работы.
Выделены и идентифицированы новые природные перспективные бактериоцинобразующие штаммы мезофильных лактококков Lactococcus lactis. subsp. lactis, пополнившие коллекцию лактококков – активных продуцентов низина и новых бактериоцинов, обладающих уникальным для бактерий этого вида фунгицидным действием. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК природных новых бактериоцинобразующих штаммов депонированы в базу данных GenBank.
Использование в качестве ферментационных субстратов для получения бактериоцинов отходов ряда биотехнологических производств представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса.
Изучена диссоциация продуцентов, что облегчает отбор активных вариантов при использовании штаммов в промышленном производстве бактериоцинов.
Разработана технология получения нового препарата ЛГС, синтезируемого гибридным штаммом F-116, обладающего широким спектром антимикробного действия, включая патогенные и условно-патогенные формы, развивающиеся в продуктах питания при хранении, что позволяет рекомендовать его в качестве биологического консерванта (Акт опытно-промышленных испытаний от 19.09.2007г.).
Разработаны лабораторные регламенты на процесс синтеза бактериоцинов природным штаммом L. lactis subsp. lactis 194 как биологического консерванта фунгицидного действия для производства сырокопченных колбас (Акт испытаний от 16.06. 2006 г.).
Результаты исследований вошли в учебники для студентов вузов, подготовленные в соавторстве с сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова. Разработаны курсы лекций и практических занятий для подготовки специалистов в Биотехнологическом центре МГУ: «Актуальные проблемы микробиологии», «Бактериоцины молочнокислых бактерий» и др.
Работа с 1985 года была поддержана постановлениями Совмина СССР, ГКНТ, Правительства Москвы, Международной Правительственной программой между СССР и Индией, межвузовской программой «Биотехнология в российских вузах», грантами РФФИ 98-04-49822 и 01-04-48661 «Управление процессами биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами», ФЦАТП N 60123.01.02 по фундаментальным и поисковым исследованиям и разработкам Минпромнауки России «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2004 годы»; блок 2 «Проектно-прикладные исследования».
Положения, выносимые на защиту.
Выделение и идентификация новых бактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis из молока, молочных продуктов и национальных кисломолочных напитков лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон.
Селекция активных бактериоцинобразующих штаммов с помощью метода клеточной инженерии (слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза (с использованием ультрафиолетовых лучей и супермутагенов химической природы).
Оптимизация синтеза бактериоцинов компонентным составом ферментационной среды и стабилизацией рН в процессе ферментации. Использование в качестве ферментационных субстратов для получения низина отходов ряда биохимических производств.
Разработка способа выделения эффективных бактериоцинов из культуральной жидкости, идентификация новых антибиотических комплексов.
Практическое использование перспективных бактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.
Личный вклад соискателя.
Соискателю принадлежит определяющая роль в выборе направления исследований, постановке цели и задач для ее выполнения, разработке схем проведения экспериментов на всех этапах исследований, анализе и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель лично принимала участие в экспериментах, интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций, выступала с докладами на конференциях и международных симпозиумах.
Апробация результатов.
-
Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на различных конференциях и международных конгрессах. Сделано 45 докладов, в том числе на: ХVI World’s Poultry Science Congress, Brasilia, I978; VI съезде Всесоюзного микробиологического общества, Рига, 1980; Всесоюзной конференции «Создание химико-фармацевтических препаратов биотехнологическими методами», Москва, 1985; VП съездe ВМО «Достижения микробиологии - практике», Алма-Ата, 1983; конференции «МГУ-Главмикробиопрому», 1985; Всесоюзных конференциях: «Биосинтез ферментов микроорганизмами», Кобулети, 1986; «Биосинтез вторичных метаболитов», Пущино 1987; «Разработка и применение антибиотиков немедицинского происхождения», Москва, 1987; «Микроорганизмы - ингибиторы и стимуляторы роста животных и растений», Ташкент, 1989; Second International Symposium on Overproduction of microbial products. Сzechoslovakia, 1988; I-st International Symposium of Chiral Molecules, Paris, France, 1988; International Conference “Biotechnology and Food», Stuttgart, 1989; The Forth and Fifth Symposium of Lactic Аcid Bacteria, The Netherlands, I993, 1996; The 2-nd Workship оn Lantibiotics, The Netherlands, 1994; Международной конференции «Прикладная биотехнология на пороге ХХI века», Москва, 1995; Международная научно-техническая конференция «Пища. Экология. Человек», Москва, 1995; XIX-ом Международном симпозиуме ICFMH – FOOD MICRO, Slovenia, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», М., 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием “Автотрофные микроорганизмы” памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой, М., 2005; 10-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённая 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна, 2006, Москва–Пущино; Научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных исследований – основа развития современных аграрно-пищевых технологий». Углич. 2007; The International scientific and practical conference Biotechology. Water and food stuffs. Moscow. 2008.
Публикации.
По материалу диссертации опубликовано 100 печатных работ, в том числе 6 обзоров и разделы в 2-х монографиях, 34 статьи, 45 тезисов, 5 авторских свидетельств, заявка на патент, 6 нормативных документов.
Соискатель награждена 3 медалями ВДНХ «За достигнутые успехи в развитии народного хозяйства СССР»:
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I) и заключения по литературному обзору, экспериментальной части, которая включает материалы и методы (глава II), результаты и их обсуждения (глава III), заключения, выводов, списка литературы (430 наименований, из них 279 иностранные публикации) и 10 приложений, которые включают: методику определения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК; заключения о результатах определения патогенных свойств штаммов лактококков: акты опытно-промышленных испытаний, лабораторные регламенты на синтез бактериоцинов Lactococcus lactis subsp. lactis штаммами F-116 и 194.
Работа изложена на 356 страницах машинописного текста (без приложений), включает 98 таблиц и 63 рисунка; выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Некоторые исследования проводили в ГУ НИИНА (Государственном учреждении научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиоиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН), ФГУП НИИгенетика (Федеральном государственном унитарном предприятии научно-исследовательском институте генетики промышленных микроорганизмов), Государственных научных учреждениях (ГНУ) Россельхозакадемии: ВНИМИ (Всероссийском научно-исследовательском институте молочной промышленности), ВНИИПБ (Всероссийском научно-исследовательском институте Пищевой биотехнологии), ВНИИПП (Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности), ВНИХИ (Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности).
Похожие диссертации на Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование
![Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс]](/i/i/4271/187546.png "Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс] Белова Ирина Викторовна")
