Содержание к диссертации
Список сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава 1. Основные пути ассимиляции СОг у микроорганизмов 9
Реакции гетеротрофной фиксации СОг 9
Системы автотрофной фиксации СОг 13 Глава 2. Пути ассимиляции серы и ее восстановленных соединений у сераокисляющих
прокариот. 23
Глава 3. Характеристика пурпурных и зеленых нитчатых
фототрофных бактерий 35
Пурпурные бактерии 35
Зеленые нитчатые бактерии 50 Глава 4. Характеристика ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов,
окисляющих соединения серы и железа 58
Разнообразие ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов 5 8
Морфология и физиологические свойства 59
Бактерии 59
Археи 69
4.3. Метаболизм 71
Приспособление к низким значениям рН среды 71
Окисление/восстановление железа 72
Фиксация углекислоты 75
Метаболизм органических субстратов 77
Цикл трикарбоновых кислот и анаплеротические реакции 79
Метаболизм соединений серы 80
4.4. Роль в природе и практическое значение ацидофильных
микроорганизмов 81
Глава 5. Типы питания микроорганизмов и роль миксотрофии 86
Типы питания 86
Облигатная автотрофия 89
Миксотрофия 92
Метаболизм миксотрофов и его регуляция 97
Роль миксотрофии в природе 104
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 106
Глава 6. Объекты и методы исследований 106
Объекты исследований 106
Культивирование бактерий 106
Постановка опытов с целыми клетками 113
Иммобилизация клеток 114
Получение экстрактов клеток 115
Методы анализов 115
Определение морфологии клеток и биомассы 115
Определение белка 116
Определение значений рН 117
Определение ассимиляции клетками 14С-содержащих
соединений 117
6.6.5 Определение радиоактивности препаратов 119
6.6.6. Определение продуктов кратковременной ассимиляции
клетками 14СОг-содержащих соединений 120
Определение образования клетками 14СОг 121
Определение железа 121
Определение глюкозы 122
Определение летучих кислот и этанола 123
Определение активности ферментов углеводного
метаболизма 123
6.6.12. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых
кислот и глиоксилатного шунта 125
Определение активности карбоксилаз 128
Определение активности ферментов серного метаболизма 132
Определение АТФ в клетках 135
Определение скорости дыхания 136
Определение цитохромов 136
Определение сульфида 137
Определение сульфата 137
Определение тиосульфата 138
6.6.21. Молекулярно-биологические методы 13 8
6.7. Математическая обработка результатов 139
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 140
Глава 7. Исследование фототрофных бактерий 140
7.1. Углеродный метаболизм Ectothiorhodospira shaposhnikovii и E.mobilis
в разных условиях роста 140
Автотрофные условия в присутствии света. 140
Миксотрофные условия в присутствии света 149
Гетеротрофные условия в темноте 169
Миксотрофный углеродный метаболизм Chromatium minutissimum 175
Миксотрофный углеродный метаболизм зеленой нитчатой бактерии
Oscillochloris trichoides штамм DG6 181
Заключительные замечания к главе 7 188
Глава 8. Исследование хемотрофных бактерий 194
8.1. Рост бактерий 194
Рост Sulfobacillus thermosulfidooxidans штамм 1269 194
Рост S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 199
Рост S.sibiricus штамм N1 203
Рост Alicyclobacillus tolerans, штамм К1 207
Фиксация углекислоты клетками 214
Активность карбоксилаз 217
Ферменты углеводного метаболизма 225
Ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта 234
Метаболизм неорганических соединений серы 242
Содержание АТФ в клетках и интенсивность дыхания бактерий 254
Цитохромы сульфобацилл 269
Изменение таксономического статуса "S. thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans", штамм К1 285
Заключительные замечания к главе 8 295
Глава 9. Биотехнологический потенциал фототрофных и хемотрофных
бактерий, обладающих свойством миксотрофии 304
Хемотрофные бактерии 304
Фототрофные бактерии 310 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 315 ВЫВОДЫ 319 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 321
Список сокращений:
АДФ - аденозиндифосфат;
АМФ - аденозинмонофосфат;
АТФ - аденозинтрифосфат;
АФС - аденозинфосфосульфат;
Ацетил-КоА -ацетилкофермент А;
CoASH- кофермент А;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин;
DTNB - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоат);
ВНСС - восстановленные неорганические серные соединения;
КДФГ - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат;
НАД - никотинамидадениндинуклеотид;
РБФ -рибулозо-1,5-бисфосфат;
РБФК - рибулозобисфосфаткарбоксилаза;
РБФК/О - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа;
ТХУ - трихлоруксусная кислота;
ФЕП - фосфоенолпируват;
ФЕПК - фосфоенолпируваткарбоксилаза;
ФЕПКК - фосфоенолпируваткарбоксикиназа;
ФГА - фосфоглицериновый альдегид
Фд - ферредоксин;
Фн - неорганический фосфат;
Фп - флавопротеид;
ФФн - пирофосфат;
Фд - ферредоксин;
Фд-Нг- восстановленный ферредоксин;
Цит. - цитохром;
ЦПМ - цитоплазматическая мембрана;
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭТС - электронтранспортная система;
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
Qe - энергетический заряд;
HOQNO - 2-гептил-4-гидроксихинолин-Ы-оксид;
NEM - N-ethylmaleimide;
ДСН - додецилсульфат натрия;
ПААГ - полиакриламидный гель
Введение к работе
В природе рост микроорганизма происходит тогда, когда окружающая среда соответствует его физиологическим особенностям. Это обеспечивает данному виду скорость роста, достаточную для успешной конкуренции с другими организмами. Однако равновесие, которое устанавливается между организмами и средой, постоянно нарушается вследствие климатических, сезонных, суточных и других изменений, влияющих на ее физико-химические характеристики: освещенность, температуру, значение рН, наличие и концентрацию биогенных субстратов. Для того, чтобы сохранить возможность существования при изменении условий, микроорганизм должен либо изменить среду, либо сам адаптироваться к ее изменениям. Адаптация организма к изменяющимся условиям это сложный процесс, протекающий как на генотипическом, так и на фенотипическом уровнях. Результат такого приспособления на фенотипическом уровне чаще всего выражается в изменении тех или иных процессов метаболизма или типов питания.
Число видов прокариот, относящихся к группам, характеризующимся разным способом питания, не одинаково. Подавляющее число хемотрофных прокариот относится к группе с хемоорганогетеротрофным типом питания. Такая же неравномерность в распределении по типам питания присуща и фотосинтезирующим прокариотам. Большинство цианобактерий, пурпурных и зеленых серобактерий относится к группе с фотолитоавтотрофным типом обмена. Другие типы питания у бактерий представляют собой как бы "пробы" эволюции и сохранились у сравнительно небольшого числа видов, часто обитающих в весьма специфических условиях.
Многие бактерии отличает постоянство потребностей в типе питания и соответственно процессов метаболизма. Так некоторые бактерии родов Thiobacillus и Acidithiobacillus являются облигатными или строгими хемолитоавтотрофами, источником энергии для которых служат процессы окисления восстановленных соединений серы или железа, а источником углерода для построения клеточного вещества - углерод СОг. Причины облигатной автотрофии ученые пытаются объяснить уже много лет, но пока не найден однозначный ответ на этот вопрос (Zhang et al., 1998; Wood et al., 2004).
С другой стороны, давно известно, что в отношении условий обитания прокариоты более разнообразны, чем эукариоты. Это обусловлено значительной лабильностью их метаболизма, которая позволяет микроорганизмам использовать в целом гораздо больше химических веществ, прежде всего соединений углерода и серы, чем макроорганизмам. При этом для многих микроорганизмов, отличающихся широкими метаболическими
возможностями, эта лабильность выражается не только в их способности использовать большое число разных соединений, но в некоторых случаях даже переключаться с одного типа питания на другой. Так ряд цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий являются факультативными фототрофами, поскольку могут расти не только в присутствии света, но и в темноте в хемотрофных условиях. А некоторые бактерии способны в одних условиях к хемолитоавтотрофии, а в других к хемоорганогетеротрофии. Их принято называть факультативными хемолитоавтотрофами. Факультативные хемолитоавтотрофы при появлении в среде доступных органических субстратов обычно переключаются на их использование, прекращая автотрофную фиксацию СОг (Кондратьева, 1996; Tian et al., 2003).
Однако в литературе все чаще встречаются также термины "миксотрофы", "миксотрофия", "миксотрофный рост", питание "смешанного типа". Иногда миксотрофами называют микроорганизмы, способные к разным типам питания или называют так факультативные автотрофы. Но в последнее время под миксотрофией понимают такой тип питания, при котором организмом одновременно используются различные метаболические пути, например, источником энергии (или электронов у фототрофов) служат сульфид и органическое соединение и/или источником углерода - СОг и то же органическое вещество (Кондратьева, 1996; Hagen, Nelson, 1996; Fuchs, 1999; Kelly, Wood, 2000; Wood et al., 2004).
Некоторые бактерии не только способны переключаться с одного типа метаболизма на другой, например, растут в автотрофных и гетеротрофных условиях, подобно факультативным автотрофам, но могут и, более того, предпочитают расти именно в миксотрофных условиях. К таким бактериям относятся некоторые фототрофпые бактерии и хемотрофные бактерии рода Sulfobacillus, являющиеся объектами наших исследований (Головачева, Каравайко, 1978; Karavaiko et al., 1988, 2005; Кондратьева, 1989; Norris et al., 1996). Эти на первый взгляд непохожие группы бактерий, относящиеся к двум основным типам энергетического питания, объединяет способность существовать в постоянно меняющихся, часто экстремальных физико-химических условиях среды, и переключаться с одного типа метаболизма на другой вследствие их чрезвычайной метаболической гибкости.
Изучение миксотрофии у фототрофных и хемотрофных бактерий является весьма актуальным, поскольку может позволить установить:
- роль миксотрофного типа питания для выживания микроорганизмов в постоянно
изменяющихся условиях окружающей среды;
общие закономерности и различия процессов углеродного метаболизма у фототрофных и хемотрофных бактерий, растущих в разных условиях;
особенности углеродного, серного и энергетического метаболизма, позволяющие таким микроорганизмам оптимально развиваться именно в миксотрофных условиях;
- причины плохого роста некоторых миксотрофных бактерий в автотрофных и
гетеротрофных условиях;
- возможные регуляторы процессов переключения бактерий с одного типа питания на
другой.
Кроме того, актуальность изучения особенностей метаболизма фототрофпых и хемотрофных бактерий в разных условиях роста определяется необходимостью понимания роли каждой из групп этих микроорганизмов в круговороте углерода, серы, железа в природных и промышленных экосистемах, уточнения их места в общей системе организмов, познания закономерностей и путей эволюции прокариот. Очень важен и прикладной аспект таких исследований, поскольку их результаты могут быть использованы для решения задач регуляции биохимической активности фототрофных и хемотрофных бактерий в целях более эффективного их применения в биотехнологии.
Цели и задачи исследования.
Различия микроорганизмов по типам питания связаны главным образом с начальными стадиями метаболизма углерода, серы, азота. Круговорот углерода и серы в природных, а в последние годы и в промышленных системах, являются одними из важнейших геохимических циклов. В этих природных циклах значительную роль играют фототрофные и хемотрофные бактерии.
Способность прокариот к хемолитотрофии, автотрофии или миксотрофии связана с биосинтезом сравнительно небольшого числа особых ферментов. Поэтому представляло интерес изучение как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества у исследуемых представителей хемотрофных и фототрофных бактерий в разных условиях роста.
Основной целью нашей работы было сравнительное изучение начальных этапов метаболизма углерода и серы у прокариот, обладающих способностью использовать разные источники энергетического питания - фототрофных и хемолитотрофных бактерий в разных условиях культивирования для определения общих биохимических механизмов лабильности их метаболизма и оптимального развития в миксотрофных условиях.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности роста фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, в различных условиях культивирования.
Определить способность этих бактерий к ассимиляции углекислоты в различных условиях.
Провести определение в бесклеточных экстрактах миксотрофных бактерий активностей ферментов, участвующих в метаболизме углерода - ферментов метаболизма углеводов, цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта, карбоксилаз.
Выявить закономерности изменения активностей ферментов углеродного метаболизма в зависимости от условий культивирования бактерий.
Выяснить особенности метаболизма соединений серы у штаммов хемолитотрофных бактерий в сравнении с фототрофными бактериями.
Определить содержание АТФ в клетках и интенсивность дыхания культур хемолитотрофных бактерий, выросших в различных условиях.
На основании полученных данных и схем метаболизма углерода и серы найти общие свойства и особенности физиологии фототрофных и хемолитотрофных бактерий, позволяющие им оптимально развиваться в миксотрофных условиях с возможностью переключения на автотрофний и гетеротрофный типы питания.
Оценить потенциал изученных видов фототрофных и ацидофильных хемолитотрофных бактерий, обладающих свойством миксотрофии, для биотехнологии.
