Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
ГЛАВА 1. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА 14
1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья 16
организма хозяин
1.1.1. Бактерии рода Bacillus как компоненты нормальной микрофлоры 28
1.1.2. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели 33
дисбактериозов
1.2. Колонизационная резистентность вагинального биотопа и ее механиз- 43
1.2.1. Дисбиоз влагалищного биотопа 47
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПРОБИОТИКОВ 51
Композиционный состав пробиотиков 51
Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus 54
Критерии отбора культур в состав пробиотиков 58 ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМЫ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 61 ПРЕПАРАТОВ ПРОБИОТИКОВ
ЧАСТЫ1. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ . 68
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 68
Материалы 68
Методы 72
1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бакте- 72
рий p.Bacillus
1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств микроорганиз- 72
мов
1.2.2.1. Микробиологическое исследование вагинального биотопа 72
1.2.3. Микроскопический метод исследования вагинальных мазков 74
1.2. 4. Определение адгезивной активности 75
1.2. 4.1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам 75
1.2.4.2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным 76
клеткам кишечника крыс или мышей
1.2.4.3. Определение уровня адгезивной активности штаммов пробиоти- 78
ков на модели эпителиальных клеток влагалища человека
1.2.5. Определение чувствительности штаммов к антибиотикам 79
1. 2.6. Определение антагонистической активности 79
1.2.6.1. Определение антагонистической активности пробиотиков в отно- 79
шение к клиническим штаммам УПМ
1.2.7. Определение устойчивости бактерий к действию биологических 80
жидкостей
Обработка НИЛИ 80
Моделирование дисбактериоза у животных 81
1.2.10. Методы изучения безопасности 82
1.2.10.1. Изучение острой и хронической токсичности 82
1.2Л 0.2. Изучение безвредности 83
Изучение вирулентности 83
Изучение токсичности 84
Изучение токсигенности 84
Изучение дермонекротических свойств 84
Определение влияния споросодержащих препаратов на детокси- 85 цирующую функцию печени («гексеналовая проба»)
1.2.11. Оценка персистирования штаммов рода Bacillus в желудочно- 86
кишечном тракте мышей
1.2.12. Методы статистической обработки результатов исследований 86
ГЛАВА 2. МОДЕЛЬ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ ШТАММОВ 87
2.1. Моделирование дисбактериоза на мышах 87
Влияние доксициклина на фекальную микрофлору мышей 87
Влияние ампиокса на состав фекальной микрофлоры 89
Изучение адгезивной активности УПБ при экспериментальном дис- 91 бактериозе
Изучение транслокации УПБ при экспериментальном дисбактериозе 92
Использование пробиотиков для коррегирования дисбиоза 93
2.2. Моделирование инфекционного процесса вызванного E.coli 0157.Н7 96
2.2.1. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, 99
вызванной E.coli 0157:И7
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ОТБОРА ШТАММОВ 104
3.1. Изучение безопасности штаммов бактерий рода Bacillus в опытах на 105
лабораторных животных
3.2. Изучение биологических свойств штаммов пробиотиков в опытах 114
in vitro и in vivo
ГЛАВА 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ПРОБИОТИКОВ 125
Биоспорин 127
Витаспорин 132
Биспорин 134
Субтикол 135 4.5.Ирилис 139
Сравнительное изучение новых споровых пробиотиков с другими 142 коммерческими препаратами на основе бацилл
Использование пробиотиков для коррекции дисбиоза 143
4.8. Использование споровых пробиотиков для профилактики и лечения 146
инфекции, вызванной E.coli 0157:Н7
ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 150
РАЗЛИЧНЫХ ПРОБИОТИКОВ
Изучение антагонистической активности различных лекарственных 150 форм пробиотиков
Адгезивная активность различных лекарственных форм пробиотиков 153
Изучение влияния низкочастотного инфракрасного лазерного излуче- 156 ния (НИЛИ) на специфическую активность пробиотиков
5.3.1. Влияние НИЛИ на жизнеспособность бактерий 157
Воздействие НИЛИ на антагонистическую активность пробиотиков 158
Воздействие НИЛИ на уровень адгезии пробиотиков и патогенных 160 E.coli
ГЛАВА 6. КЛИНИЧЕСКАЯ АПРАБАЦИЯ БИОСПОРИНА 164
Испытание безопасности и переносимости биоспорина на доброволь- 165 цах
Государственные испытания безопасности, переносимости и клиниче- 168 ской эффективности биоспорина сухого
Результаты испытания безопасности, переносимости и юшничсской 169 эффективности биоспорина при ОКИ на ограниченном контингенте больных взрослых
Результаты испытания клинической эффективности биоспорина при 172 лечении дисбактериозов различной этиологии на взрослых больных
Изучение клинической эффективности препарата на детях 176
Изучение профилактической эффективности биоспорина сухого 187
Изучение клинической эффективности препарата биоспорин, таблетки 189 при лечении ОКИ и дисбактериозов
Расширение сферы применения биоспорина. Клиническая эффектив- 199 ность биоспорина при лечении бактериального вагиноза
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 209
ВЫВОДЫ 233
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 235
ПРИЛОЖЕНИЕ 265
Введение к работе
Проблема профилактики и коррекции дисбактериозов приобретает в последнее время все большее значение, поэтому является актуальным расширение номенклатуры средств восстанавливающих нормальную микрофлору организма, человека [4; 288; 336]. Для нормализации нарушенного микробиоценоза в практике здравоохранения все более широко применяются биопрепараты-пробиотики, изготовленные на основе микроорганизмов [29; 61; 122; 165; 247]. По данным ряда исследователей эффективность бактерийных препаратов определяется биологическими свойствами входящих в них штаммов [29; 41; 46; 138; 438; 469; 480]. При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе спо-рообразующих бактерий рода Bacillus различных видов. А также комплексные про-биотики, сочетающие бактерии разных родов, характеризующихся взаимодополняющим спектром антагонистической активности и адгезивности, и препараты для коррекции дисбиотических нарушений не только кишечного, но и влагалищного биотопов [148; 153; 154; 305].
Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus широко распространены в окружающей среде [11;13; 62; 72; 80; 95]. Бактерии рода Bacillus являются одним из основных компонентов микрофлоры почв, воды, воздуха, и человек в процессе жизнедеятельности постоянно контактирует с ними [192; 271; 313]. Бациллы характеризуются рядом свойств, обусловливающих их несомненное преимущество перед другими микроорганизмами, используемыми в качестве основы пробиотиков [225; 236; 448]. Они (кроме B.anthracis и B.cereus) безвредны для макроорганизма и характеризуются антагонистическими свойствами, спектр которых у различных штаммов может значительно отличаться [246; 301; 367; 443]. Это позволяет создавать комплексные препараты на основе отобранных культур, дополняющих друг друга по своим антимикробным свойствам.
В медицинской практике различных стран уже несколько десятилетий применяются биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus [181; 182; 191; 486; 490]. В странах Западной Европы широкое распространение получил пробиотик бактисубтил
7 (фирма "Marion Merrell» /Франция/) и его аналог флонивин БС (фирма "Galenika" /Югославия/). Основу этих препаратов составляет штамм B.cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также биопрепарат цереобиоген ("Xing Лап", Китай), действующее начало которого - штамм B.cereus DM-42S. Вьетнамский препарат биосубтил в качестве активного компонента содержит штамм B.subtilis. Препарат энтерогермин (фирма "Sanofi Winthrop", Италия) состоит из четырех штаммов B.clausii Т, N/K, О/С и SIN, устойчивых к различным антибиотикам.
Несмотря на длительный опыт применения споровых пробиотиков в мировой практике здравоохранения (Франция, Югославия, Китай, Япония), в России долгое время велась дискуссия о безопасности и возможности широкого применения таких препаратов. В настоящее время вопрос безопасности пробиотиков созданных даже на основе представителей нормофлоры стоит особенно остро. Описаны случаи инфекционных осложнений, вызываемых такими культурами, которые имеют статус GRAS (generally recognized as safe) - лактобациллами [453] и бифидобактериями [287]. Имеются сведения о регистрации у новорожденных бактериемии, вызванной бифидобактериями и лактобактериями [27]. В связи с этим вопросам комплексной оценки безопасности штаммов, предназначенных для бактериотерапии, должно уделяться особые значения. Анализ материалов доклинических исследований пробиотиков, давно используемых в практике здравоохранения, показал отсутствие стандартных критериев безопасности пробиотиков.
В нашей стране при отборе штаммов — кандидатов в пробиотики основное внимание уделяют спектру и выраженности их антагонистической активности, а также технологичности при производстве препаратов. Подобная характеристика является недостаточной, т.к. она не раскрывает механизма воздействия пробиотика, его взаимодействие с макроорганизмом и другими видами бактерий [29; 122; 124; 168]. Отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между пробиотическими и условно-патогенными бактериями приводит порой к необоснованному назначению тех или иных лечебных препаратов и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта. Кроме того, не разработаны единые принципы отбора новых перспективных штаммов для изготовления пробиотиков, а также для контроля производственных штаммов; требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств, обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность препарата, полу-
ченного на основе изучаемых штаммов. Биопрепараты должны быть стандартными и стабильными, соответствовать требованиям ФСП в течение всего срока годности. Для обеспечения соответствующего качества препаратов необходима эффективная стандартная промышленная технология, отвечающая требованиям GMP, адекватные методы контроля качества, удобная и эффективная лекарственная форма, надежная упаковка, регламентированные условия хранения.
Следовательно, для отбора пробиотических культур необходимо проведение многосторонних исследований безопасности, изучение биологических свойств in vitro и in vivo, ассоциированных с колонизационной активностью: адгезией, спектром антагонистической активности, чувствительности к бактерицидному действию биологических жидкостей и химиотерапевтических препаратов.
Цель настоящего исследования - разработка критериев безопасности споровых бактерий рода Bacillus в экспериментах in vitro и in vivo и обоснование принципов конструирования комплексных споровых пробиотиков и системы контроля их качества, обеспечивающих безопасность и клиническую эффективность бактерийных препаратов.
Основные задачи исследования:
Разработать комплексные подходы оценки пробиотической активности штаммов бактерий рода Bacillus, включающие тесты in vitro и in vivo на экспериментальных моделях дисбактериоза кишечника и острого инфекционного процесса.
С учетом биологических особенностей пробиотической активности отобранных штаммов бацилл сконструировать новые комплексные споровые пробиоти-ки.
Провести сравнительный анализ специфической активности споровых пробиотиков с коммерческими лакто- и бифидосодержащими биопрепаратами, а также оценить ее изменение под влиянием физических факторов, в частности низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ).
На примере комплексного пробиотического препарата оценить терапевтическую и профилактическую эффективность его различных лекарственных форм био-спорина на взрослых и детях при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна
Впервые обоснована целесообразность комплексного изучения биологических свойств и антагонистической активности штаммов бактерий рода Bacillus на моделях in vitro и in vivo при разработке препаратов на их основе.
Критериями отбора пробиотических штаммов бацилл являются:
отсутствие гемолитической, лецитиназной, гиалуронидазной активностей;
антибиотикоустойчивость хромосомной природы или отсутствие плазмид, обеспечивающих ее;
устойчивость к антибактериальному действию желудочного сока и желчи;
антагонистическая активность по отношению к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных от больных с дисбиоза-ми различной локализации;
отсутствие или низкий уровень адгезии и способности к персистентности;
безопасность (включающая изучение общей, «острой» и «хронической» токсичности, токсигешюсти, вирулентности, угнетение антитоксической функции печени, отсутствие дермонекротического эффекта);
биологическая совместимость штаммов при разработке комплексных препаратов;
оценка протективных пробиотических свойств на экспериментальных моделях
дисбактериоза, индуцированного введением антибиотиков, и острой инфекции,
вызванной E.coli0157:H7.
Впервые на основе аэробных спорообразующих бактерий ^.Bacillus сконструированы новые споровые пробиотики - биоспорин {B.subtilis 3 и B.licheniformis 31), ви-таспорин (B.subtilis 11В), ирилис (B.subtilis 07 и B.licheniformis 09) и субтикол (B.subtilis 3, B.licheniformis 31 и E.coli М-17). По признаку антибиотикоустойчивости проведена селекция штаммов (B.subtilis 3 и B.licheniformis 31) и разработан комплексный препарат - биспорин (B.subtilis З/Re и B.licheniformis 31/Re). Новые комплексные препараты обладали более широким спектром антагонистической активности по
10 сравнению с коммерческими препаратами: бактисубтилом, энтерогермином, ацилак-том, лактобактерином, бифидумбактерином, энтеролом.
Продемонстрировано преимущество комплексных препаратов (биоспорин, биспорин, ирилис, субтикол) перед монопрепаратами за счет проявления синергиче-ской антагонистической антимикробной активности.
Впервые установлено, что антагонистическая активность споровых комплексных пробиотиков превосходит таковую коммерческих препаратов из нормофлоры. Установлено отсутствие влияния низко-интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на споровые бактерии и его воздействие на уровень адгезивной активности. Показано, что НИЛИ статистически значимо снижает уровень адгезивной активности би-фидумбактерина и лактобактерина.
Сравнительное изучение специфической активности споровых пробиотиков и пробиотиков нормофлоры показало, что различные формы одного и того же пробио-тика не отличаются по антагонистическим свойствам, тогда как уровень адгезивной активности препаратов в свечевых формах снижается вследствие экранирования рецепторов макроорганизма и адгезинов микробных клеток жировыми основами.
Установлено, что разработанный пробиотик биоспорин в разных лекарственных формах обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при дисбиозах различной локализации.
Научная новизна работы подтверждена 11 патентами.
Теоретическое и практическое значение работы
В практику здравоохранения России и Украины внедрен споровый пробиотик биоспорин (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации N353 от 29.12.92 г. и Украины N219 от 22.10.93 г.), он внесен в Государственный реестр лекарственных средств под № 92/353/16 (патенты РФ № 1722502 и Украины № 689),
зарегистрирован в Российской Федерации (регистрационное удостоверение № 010094) и на Украине (№ 12.22.10.93). Расширена сфера применения биоспорина в гинекологии (патент РФ №2131258 и инструкция по применению).
Результаты научной работы нашли свое отражение в комплекте нормативной и научной документации: на биоспорин утверждены Фармакопейные статьи в Российской Федерации (ФС 42-3476-98 и ФСП 42-03703278-02) и на Украине (ФС 42У-200/8-142-97), инструкции по применению и регламенты производства (ЭРП №580-96).
В настоящее время промышленное производство биоспорина осуществляется в России - Центром военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, г.Екатеринбург), а на Украине ОАО "Днепрофарм". За время выпуска препарата не зарегистрированы случаи производственного брака, рекламаций не поступало.
Для производства споровых пробиотиков медицинского назначения селекционированы штаммы B.subtilis 3, З/Re (ГКПМ№263), 11В (ВКМВ-2218Д), 07 (ВКПМ В-8611) и B.licheniformis 31, 31/Re (ГКПМ№263), 09 (ВКПМВ-8610), депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина и в коллекции микроорганизмов ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Положения, выносимые на защиту
Использование комплексной оценки пробиотических свойств штаммов in vitro и in vivo позволяет обеспечить требования безопасности, предъявляемые к препаратам на основе бактерий рода Bacillus.
Антагонистическую активность штаммов бацилл и пробиотических препаратов необходимо изучать как in vitro, так и in vivo на моделях экспериментального дисбактериоза и острой инфекции.
Разработанные комплексные пробиотики превосходят препараты нормофлоры по антагонистической активности. На них не оказывает отрицательного влияния низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ).
Разработанный пробиотик биоспорин, в различных лекарственных формах, обладает высокой терапевтической и профилактической эффективностью при ОКИ и дисбиозах различной локализации у детей и взрослых.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежат: разработка концепции и направления исследований, непосредственное осуществление экспериментальных исследований, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, формулирование выводов. В работе использованы материалы, полученные в основном лично автором, а также в соавторстве с сотрудниками следующих организаций: Институтом микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, РУДН, РМАПДО, НПО «Биомед» г.Пермь, ДП «Биофаг» ГУП «Иммунопрепарат», ММА им. Сеченова.
В выполнении отдельных этапов работы принимали участие следующие научные сотрудники: д.б.н. Сорокулова И.Б., д.м.н., профессор Саркисов С.Э., к.м.н. Григорьева Л.В., к.м.н. Терешкина Н.В., к.м.н. Созаева Л.Г., н.с. Евлашкина В.Ф., к.м.н. Васильева Е.А., к.м.н. Буданова Е.В., н.с. Лукьянова 0.10, аспиранты Колганова Т.В., Тауфик Джарадат, Чумаева Т.В. и Гайдеров А.А. Автор выражает глубокую благодарность руководителю лаборатории д.м.н. Чуприниной Р.П. и всем сотрудникам лаборатории бактерийных вакцин и вивария ГИСК им.Л.А.Тарасевича за неоценимую помощь в выполнении данной работы. Всех соавторов настоящих исследований автор искренне благодарит. Особая благодарность д.м.н., проф. Бектимирову Т.А. и к.м.н. Озерецковскому Н.А.
Апробация работы и публикации
Основные результаты проведенных исследований были доложены на научно-практической конференции «Перспективы использования эубиотика «Биоспорин» в практике здравоохранения и военно-медицинской службы» (Екатеринбург, 1997); 2-ой международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 1998); международном конгрессе «Аптека-2000» (Москва, 2000), VI Российско-итальянской научной конференции (Санкт-Петербург, 2000); научно-
13 практических конференциях НПО «Биомедицинские технологии» (Москва, 2000; 2002; 2003); Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, новая эпоха» (Нью-Йорк, 2004); 4-ом Съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004); III конгрессе педиатров- инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей. Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004); V съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2005); IV конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2005).
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на заседании кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН.
По теме диссертации опубликованы 51 печатная работа, из них 1 методические рекомендации, 1 монография, 19 статей в научных журналах, 19 тезисов в сборниках конференций, 11 патентов на изобретения.
Объем и структура работы
Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 283 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 66 таблицами и 26 рисунками. Список литературы представлен 499 источниками (181 отечественных и 318 зарубежных).
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
