Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Суолегальное действие факторов среды на микроорганизмы II
1.1. Терминология II
1.2. Повреждающие агенты 13
1.3. Факторы, влияющие на чувствительность к повреждающим агентам 14
а) условия культивирования 14
б) плотность суспензии 17
в) фаза роста культуры 17
г) состав среды инкубирования 19
д) рН среды инкубирования 21.
е) скорость действия фактора 22
1.4. Метод учета поврежденных клеток 23
1.5. Основные повреждения 25
а) нарушение клеточной оболочки 25
б) повреждение РНК и рибосом 29
в) повреждение ДНК 31
г) изменение активности ферментных систем 32
д) нарушение процессов дыхания, фотосинтеза и энергообеспечения клетки 34
1.6. Репарация повреждений 38
а) методы изучения 38
б) условия репарации 39
в) восстановление клеточного барьера проницаемости 42
г) восстановление рибосом и РНК 44
д) репарация ДНК 45
е) восстановление активности ферментных систем, процессов дыхания и фотосинтеза . 46
ж) энергообеспечение репарации 47
1.7. Белки теплового шока 50
1.8. Заключение 53
Экспериментальная часть ' 55
Глава II. Материал и методы исследования 55
2.1. Объект исследования и условия культивирования 55
2.2. Учет числа колоний на твердых питательных средах 56
2.3. Условия теплового и кислотного воздействия . 56
2.4. Количественный учет поврежденных клеток . 57
2.5. Измерение диаметра колоний 58
2.6. Определение чувствительности клеток к лизоциму 58
2.7. Измерение выделения и поглощения кислорода . 60
2.8. Регистрация спектров флуоресценции 61
2.9. Изучение УФ-инактивации и фотореакгивации 61
2.10. Опыты по изучению репарации 62
2.II.Изучение устойчивости к повторному шоку . 63
2.12.Выделение ДНК-связывающихся белков 64
Глава III. Последствия сублетального теплового воздействия у цианобакгерии Synechocystis aquatilis 66
3.1. Количественный учет клеток s.aquatiiis на твердых питательных средах 66
3.2. Условия теплового воздействия 67
3.3. Нарушение барьера проницаемости 74
3.4. Изменение интенсивности дыхания и фотосинтеза 81
3.5. Изменение УФ-инактивации и фотореактивации 90
3.6. Изменение диаметра колоний 94
Глава ІV. Репарация повреждений 98
4.1. Условия репарации 98
4.2. Метаболические процессы, необходимые для репарации 103
4.3. Сравнигельное изучение теплового и кислотного шока III
4.4. Устойчивость к повторному тепловому воздействию 115
Заключение 121
Выводы 125
Литература 127
- Повреждающие агенты
- Белки теплового шока
- Объект исследования и условия культивирования
- Количественный учет клеток s.aquatiiis на твердых питательных средах
Введение к работе
Механизм действия сублетальных температур на микроорганизмы привлекает к себе в настоящее время внимание широкого круга исследователей. Об этом свидетельствует ряд обзорных работ, касающихся различных аспектов данной проблемы (Hurst, 1977; Beuchat, 1978; Busta, 1978; Pierson et al., 1978; Stevenson, Graumlich, 1978; Witter, 1981), материалы симпозиума "The Survival of Vegetative Microbes", состоявшегося в 1976 г. в Кембридже, и симпозиума, посвященного белкам теплового шока, "Heat Shock: Prom Bacteria to Man", проведенного В мае 1982 г. в Колд Спринг Харборе.
Несмотря на го, что повышенная температура относится к числу наиболее экстремальных воздействий, которые окружающая среда может оказывать на организмы (Амелунксен, Мэдок ,1981) и длительное время используется в микробиологии при стерилизации и пастеризации, механизм ее действия до сих пор неизвестен. Этот факт тем более удивителен на фоне блестящих открытий в области молекулярной биологии и биохимии, расширивших наши знания о структуре и функциях бактериальной клетки.
Долгое время термическую инактивацию бактерий объясняли коагуляцией клеточных белков, хотя резонно предположить, что это - конечный результат воздействия, и он маскирует другие более гонкие изменения, происходящие в бактериальной клетке до коагуляции (Alivrood, Russell, 1970). Еще в 1908 г. Эйкман (Eijkman, 1908: циг.по Allwood, Russell, 1970), изучая влияние влажного жара на бактерии, установил, что при восстановлении оптимальных температурных условий после сублегального теплового воздействия клетки могут репарировать полученные повреждения и возобновить деление и рост.
Однако систематическое изучение влияния сублегальных температур на микроорганизмы началось лишь в 60-е годы. Необходимость таких исследований была продиктована не только теоретическим интересом, но и практическими задачами: консервирование продуктов, получение из вирулентных культур ослабленных, которые сохраняют при этом свои иммуногенные свойства, подбор сред для выделения чистых культур микроорганизмов из природных изолягов, совершенствование методов управляемого культивирования микроорганизмов и т.д.
В результате интенсивного изучения этой проблемы были выяснены общие механизмы повреждения (Hurst, 1977), определены условия, влияющие на устойчивость бактерий к суолегально-му прогреванию. Одновременно интересы исследователей были направлены и на изучение механизмов репарации повреждений. Поврежденные клетки представляют уникальную возможность для изучения сборки рибосом (Jandolo, 1974).
В последние годы особенно возрос интерес к проблеме теплового шока. Это связано с обнаружением синтеза в поврежденных клетках так называемых белков теплового шока, которые обусловливают устойчивость к повторным суолетальным воздействиям (Yamamori, Yura, 1982). Феномен имеет широкое проявление (от прокариот до млекопитающих) и позволяет предположить, что синтез белков теплового шока представляет собой универсальный адаптивный ответ клеток на внезапное изменение температуры в естественных условиях. Значение этого открытия трудно переоценить. Оно имеет не только теоретический инте- pec, но и первостепенное практическое значение. В настоящее время синтез белков теплового шока изучается в качестве модельной системы для анализа генной регуляции прокариот и эука-риог.
Исследование явления теплового шока на разных уровнях организации живого открывает, таким образом, интересные перспективы изучения эволюции механизмов адаптации к экстремальным факторам внешней среды.
В этом плане представляется интересным изучение теплового шока у цианобактерий. Цианобакгерии - своеобразная группа организмов, у которой наличие фотосинтеза эукариогического типа сочетается с примитивной морфологической организацией,свойственной прокариотическим организмам (Fogg et al., 1973).
Исследование теплового шока у цианобактерий связано также с перспективами их управляемого массового культивирования для получения кормового белка, аминокислот, витаминов и т.д. (Горюнова и др., 1969).
Однако до сих пор изучение температурного шока у цианобактерий ограничивалось рассмотрением влияния низких температур (Jansz, Maclean, 1973» Rao et al., 1977; Ono, Murata, 1981a, б). Литературные данные немногочисленны и совершенно не касаются репарационных процессов.
Целью настоящей работы было выяснение влияния суолеталь-ного нагревания на цианобактерию Synechocystis aquatilis -изучение повреждений, вызываемых нагреванием, и последующих репарационных процессов.
В связи с этим были сформулированы следующие задачи:
I) определить параметры сублетального воздействия и кри- терий оценки повреждения; выяснить участки повреждения в клетках; изучить условия репарации повреждений; установить специфичность теплового шока. С этой целью провести сравнительное изучение теплового и кислотного шока; определить устойчивость к повторным субдетальным воздействиям.
В процессе изучения вышеперечисленных вопросов получен фактический материал, показыващий, что тепловой шок приводит к значительным изменениям в сгруктуре и функциях клеток циано-бактерии synechocystis aquatiiis. Нарушается барьер проницаемости клеток, фотосинтез, дыхание. Впервые для цианобакгерий изучены условия репарации после теплового и кислотного шока. Установлено, что для ее прохождения не требуется синтез ДНК, но необходим синтез белка, РНК и АТФ. Впервые для цианобакте-рий показано появление устойчивости к повторным суолетальным воздействиям после кислотного и теплового шока.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II - ІУ), заключения, выводов и списка литературы, включающего 218 наименований, из которых 184- на иностранных языках. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 17 рисунками.
По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Автор приносит глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Борису Васильевичу Громову, а также сотрудникам лаборатории микробиологии Биологического НИИ Ленинградского государствен- ного университета имени А.А.Жданова за неизменную поддержку, ценные советы и помощь, оказанную при выполнении данной работы. Автор выражает искреннюю признательность зав.лаборагорией эволюционной биохимии растений сг.научн.согр. Маслову Ю.й. и завлабораторией молекулярной биологии сг.научн.согр. Козлову А.В. за любезно предоставленную возможность использовать оборудование лабораторий и благодарит сотрудников этих лабораторий Андреева В.П. и Кулыба Н.П. за помощь и дружеское содействие.
Повреждающие агенты
Множество физических и химических агентов, которые потенциально являются летальными для микроорганизмов (и применяются с этой целью для стерилизации, например) могут вызвать повреждение, если действие их недостаточно сильно. Такими суолегаль-ными воздействиями могут быть: повышение температуры (Aiiwood, Russell, 1970), понижение температуры (Strange, Ness, 1963), замораживание - оттаивание (Ray et al., І972 .), замораживание - высушивание (Sinskey, Silverman, 1970), дегидратация (Webb, 1969), облучение (Davies et al., 1973), химические антимикробные вещества (nadir, Gilbert, 1982), изменение рН среды (Minor, Marth, 1972) И Т.Д.
Чувствительность микроорганизмов к сублегальным воздействиям зависит от характера воздействия, а также условий, которые ему предшествовали. Известно, что состав питательной среды, в которой культивируют микроорганизмы, температура роста в большой степени определяют термоустойчивосгь (Tomlins, Ог-dai, 1976). В настоящее время общепризнано, что условия культивирования влияют на гермочувствигельносгь бактерий путем изменения соотношения содержания насыщенных : ненасыщенных жирных кислот в составе клеточных мембран (Beuchat, 1978). В свою очередь соотношение жирных кислот определяет точку фазового перехода мембранных липидов.
Таким образом, температурные границы оптимального функционирования мембраны определяются характером жирнокислогного состава мембранных липидов. С одной стороны, мембрана должна быть достаточно "текучей", чтобы осуществлялось движение интегральных белков, а с другой стороны - жесткой структурой для поддержания осмотического барьера (Мс Garrity, Armstrong, 1975).
В рилу этого в клетках выработались механизмы, адаптивно изменяющие состав жирных кислот в липидах. При снижении гемперагуры происходиг компенсаторное повышение процентного содержания ненасыщенных жирных кислот в составе липидов. Этим предотвращается "затвердение" жирнокислогных цепей и избыточное увеличение жесткости мембран.Если температура возрастает,клетки отвечают снижением содержания ненасыщенных жирных кислот. Этим избегается чрезмерное "разжижение" углеводородных цепей жирных кислот и выходящая за пределы нормы лабилизация мембран (Александров,1975). Повышение гемперагуры роста повышает теплоустойчивость грампояожигельных и грамогрицагельных бактерий, дрожжей (Katsui et al,,1982).
Так,повышение гемперагуры роста от 30 до 43С сопровождалось повышением теплоустойчивости Escherichia coli (Hansen,Skadhauge,1970:ЦИТ.ПО Beuchat,1978).Изучение жирнокислотного состава липидов Е.СОІІ показало,ЧТО фракция свободных жирных кислог из клеток,выращенных при 43С,содержит в 10 раз больше насыщенных жирных кислог,чем фракция,полученная ИЗ КЛЄГОК, выращенных при I5C (Cronan, Gelmann, 1975).
Теплоустойчивость повышается не только при повышении гемперагуры культивирования, но и в случае непродолжительной пред-инкубации клеток при повышенной температуре перед прогреванием. Выживаемость клеток Escherichia coli, Salmonella typhimu-rium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilisnoane прогревания была выше в случае их прединкубации в течение 30 минут при 37 по сравнению с пред инкубацией при 0 С (Katsui et al., 1982).
Влияние прединкубации более выражено для грамполо-жигельных бактерий и дрожжей, чем для грамогрицагельных бактерий. В отличие от теплового, при холодовом шоке, наоборот, более устойчивы клетки, выращенные при низких температурах. Например, цианобактерии Anacystis nidulans, выращенные при 28 С, менее чувствительны к охлаждению (0С), чем при 38С (Ono, Ми-rata, 1961а).
В настоящее время известно два механизма, посредством которых температура способна регулировать соотношение жирных кислот в мембранах. Температура либо влияет на включение жирных кислот в липиды, либо воздействует на соотношение синтезируемых насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (Иннис, Ингрэм, 1981).
Белки теплового шока
В последнее время у таких различных организмов, как Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Chlamydoraonas reinhar-dii, Kaegleria gruberi, Tetrahymena piriformis, Dictyostelium discoideum и Polysphondylium pallidum, кукуруза, табак, горох, Drosophila и даже в куриных фибробласгах и клетках млекопитающих были обнаружены белки теплового шока (Kelley, Schiessin-ger, 1978; Yamamori et al., 1978; Muller et al., 1982). Очень мало известно о том, что конкретно представляют собой белки, синтезируемые БО время теплового шока, и каковы их функции. Известно, что изменение синтеза белков происходит в ответ на различные неблагоприятные воздействия: пониженные и повышенные температуры, УФ-облучения, действие химических веществ, голодание (Cooper, Rueltinger, 1975; Choo, 1977; West, Emmerson,1977; Tanguay, 1983) и носит универсальный характер - наблюдается в клетках организмов различного эволюционного положения (от бактерий до человека).
Показано, что появление в клетках белков теплового шока обусловлено активацией "генов теплового шока". Явление активации специфического набора генов при самых различных экстремальных воздействиях открыл на дрозофиле итальянский исследователь Ф.Ригосса в 1962 г. (Ritossa, 1962). Однако систематическое изучение ответа теплового шока началось только 5 лег назад, когда параллельно в нескольких лабораториях было установлено удивигельное сходство в сгрукгуре белков и генов теплового шока прокариот и эукариог (Marx, 1983). Так, Крейг обнаружила (Craig, 1979; цит. no: Marx, 1983) 50$ сходство гена, активирующегося при синтезе белка теплового шока - 70 у Drosophila и dna к гена E.coli, который кодирует белок теплового шока с молекулярным весом 70,000 дальтон.
В середине 70-х годов группа Нейдхарда (Lemaux et ai., 1978) при изучении темперагурчувствительных мутантов E.coli обнаружила изменение синтеза белков в ответ на изменение температуры. Синтез одних белков прекращался, а 14 белков - возрастал. У температурчувствительных мутантов такого явления не отмечали. Вследствие повышения температуры до 42 С клетки мутантов погибали, в то время как контрольные клетки оставались жизнеспособными.
Изменение скорости синтеза некоторых белков в клетках Е. coli после теплового шока было показано и в других работах (Yamamori et al., 1978} Herenden et al., 1979). Синтез отдель ных белков активизировался сразу после изменения температуры, был максимальным через 10 минут, а через 25-40 минут возвра щался к исходному уровню. Быстрое изменение в скорости синтеза исследуемых белков позволило авторам предположить, что в осно ве ответа на тепловое воздействие лежат посттранскрипционные механизмы. В дальнейших работах было показано, что индукция проявляется на уровне транскрипции сразу после температурного сдвига (Yamamori, Yura, 1980). Возможно координирование регу ляции ответа, осуществляющееся на разных уровнях - транскрип ционном и посттранскрипционном (Лозовская и др., 1982). , Не исключено, что синтез различных белков теплового шока контролируется независимо. Изучение кинетики ответа показало асинхронносгь в появлении различных белков теплового шока,что указывает на различие их индивидуальной скорости синтеза, либо на некоординированную индукцию (Tanguay, Vincent, 1981). Физиологической ролью белков теплового шока считают защиту клетки от тепловой гибели. Так, клетки E.coli, испытавшие температурный сдвиг с 30 до 42С, в 10-100 раз устойчивее к последующему нагреванию. Приобретение устойчивости зависит от синтеза белка, так как хлорамфеникол, добавленный к суспензии клеток перед температурным сдвигом, полностью ингибируег устойчивость клеток (Yamamori, Yura, 1982).
Корреляция между синтезом белков теплового шока и устойчивостью к легальным температурам была обнаружена для дрожжей (McAlister, Pinkelstein, 1980),ДрозофИЛ (Mitchell et al.,1979). Белки теплового шока могут связываться с клеточными компонентами и защищать их от денатурации или деградации. В частности, они могут защищать генетический материал. Цитологические исследования показали, что многие белки теплового шока дрозофил соединяются с хромосомами или оболочкой ядра (Velazquez et al., 1980; Sinibaldi, Morris, 1981). А белки теплового шока сои, кроме того, ассоциируются с рибосомами и митохондриями. При понижении температуры до оптимальной белки теплового шока мигрируют в цитоплазму (Marx,, 1983).
Дальнейшее изучение показало, что, например, у дрозофилы 4 небольших белка теплового шока сходны по аминокислотной последовательности с -крис Таллин ом (Ingolia, Craig, 1982). tfC-крисгаллин является основным компонентом хрусталика глаза и состоит из 4 субъединиц, составляющих агрегат с молекулярным весом 800 000. Авторы предполагают, что белки теплового шока также объединяются в комплексы и стабилизируют ДНК или другие клеточные компоненты от тепловых повреждений. 1.8. Заключение Таким образом, по мере изучения сублетальных воздействий на микроорганизмы накоплен большой фактический материал, касающийся различных аспектов этого вопроса.
Усилия исследователей сосредоточены как на выяснении изменений, возникающих вследствие сублетальных воздействий, гак и на определении условий и механизмов процесса репарации. Установлено, что действие сублетальных факторов в большой степени зависит от индивидуальных особенностей организма и условий окружающей среды. Однако выявлены и общие закономерности влияния сублетальных воздействий на микроорганизмы. Как правило, у поврежденных клеток нарушается барьер проницаемости, происходит изменение метаболизма. Значительные трудности при сравнении результатов разных исследователей создает отсутствие единого критерия оценки степени повреждения. Быстротечность происходящих в клетке изменений под действием сублегальных факторов не позволяет выяснить, какие повреждения являются первичными, а какие носят производный характер.
Объект исследования и условия культивирования
Объектом исследования служила чистая культура цианобак-терии Synechocystis aquatilis Sauv. (CALU-428). Культуру выращивали в минеральной среде № б (Громов, 1965), имеющую Следующий СОСГав В г/л: КЖ 3 - 1,0; К НРО - 0,2;MgS0, - о,2; caci2 - 0,15; Нанесу - 0,2; раствор микроэлементов - I мл. Состав раствора микроэлементов (г/л): znso4 7H2o - о,022; MnS04 - 1,81; CuS04.5H20 - 0,079; NaB0y4H20 - 2,63; (НН4)6Мо7024 4Н20 - 1,0; PeS04 7H20 - 9,3; СаС12 - 1,2; Со(НО-)2 Н20 - 0,02; ГРИЛОН Б - 10,0. Цианобакгерии культивировали в сосудах ИФР (Владимирова, Семененко, 1962), содерзкащих по 300 мл среды при температуре 28-30 С и непрерывном освещении люминесцентными лампами ДС-80 (освещенность 3 тыс.лк). Среду продували воздухом со скоростью 0,5 л/мин с 0,5%-ным CQg. Посевной материал выращивали в жидкой среде того же состава в 50-мл-х колбочках с 20 мл среды в термостатированной качалке при температуре 24 -25 С и освещенности 1,5-2 тыс.лк. 2.2. Учет числа колоний на твердых питательных средах Клетки из культуры в логарифмической фазе роста высевали на чашки Петри с агаризованной (2%) средой її б или средой її I (Громов, 1965). Состав среды її I в мг/л: к РС - 66,7; Mgso4. .7НрО - 33,3; КЖ)_ - 100; раствор микроэлементов - I мл. Были испытаны среды с различным содержанием гипосульфита. Гипосульфит к среде добавляли до стерилизации в концентрации 0,1; 0,5 и 1,0%. Чашки выдерживали при температуре 24-25 С и непрерывном освещении люминесцентными лампами при силе света около 2 тыслк. Через 8-Ю суток учитывали число образовавшихся колоний; число колоний относили к числу засеянных клеток, определенному в камере Горяева. Результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа. Условия теплового и кислотного воздействия
Клетки в логарифмической фазе роста (5-6.10 клеток/мл) отделяли от кульгуральной среды центрифугированием при 3 тыс. g в течение 5-Ю минут, промывали в 0,01 М 1Та-фосфатном буфере (рН 7,0). В опытах по изучению теплового шока полученный осадок суспендировали в ца-фосфатном буфере и прогревали при 51 С в течение 5 минут следующим образом: I мл суспензии клеток добавляли к 9 мл нагретого до 51 С На-фосфатного буфера гак, чтобы плотность суспензии составляла 5-8.10 клеток/мл. После прогревания суспензию охлаждали до комнатной температуры. В некоторых опытах к суспензии нагреваемых клеток добавляли Mgci2 (то шм), Mgso, (ю пенили неї (зотм). В опытах по изучению кислотного шока осадок суспендировали в 0,05 М цитрат-фосфатном буфере (рН 2,2) при комнатной температуре. Плог 7 носгь суспензии составляла 10 клеток/мл. Через 25 минут рН буфера доводили до нейтрального значения раствором На РО .
В случае теплового шока контролем служили клетки, выдержанные 5 минут в Па-фосфатном буфере при комнатной температуре, а в случае кислотного шока - 25 минут в цитрат-фосфатном буфере при рН 7,0. Прочие условия одинаковы. Суспензию контрольных клеток и клеток после теплового и кислотного шока высевали на агаризованную (2%) среду !Ь б с 0,5% гипосульфита (неселективная среда) и ту же среду с 0,6% Пасі (селективная среда). Чашки инкубировали при температуре 24-25С и непрерывном освещении люминесцентными лампами (1,5 тыс.лк). Колонии подсчитывали через 8-Ю дней. По числу колоний, образовавшихся в посевах на неселективную среду, судили о количестве жизнеспособных клеток. Долю поврежденных клеток оценивали по солетолерантяости, т.е. способности образовывать колонии на селективной среде (с 0,6/жаСі) и подсчитывали по формуле:
Диаметр колоний определяли через 10 дней после посева клеток на чашки Петри (диаметром 10 см) с 25 мл агаризованной среды $ б. Число колоний на чашках варьировало от 30 до 60, Измерения проводили под микроскопом МБй-3 с помощью окуляр-микрометра. После измерений вторично рассевали клетки из мелких и крупных колоний на чашки Петри и через 10 дней инкубации в тех же условиях вновь определяли диаметр колоний (рис.1). Повгор-ность опыта трехкратная. В каждой повгорносги проводили не менее 60 измерений колоний, образовавшихся из контрольных и прогретых клеток. Выборку разбивали на 4 класса по размерам колоний и строили гистограмму по частоте встречаемости колоний.
Количественный учет клеток s.aquatiiis на твердых питательных средах
Одной из особенностей цианобакгерии является их относительно высокая для аэробных организмов чувствительность к окислительному действию кислорода, а также к действию перекисей (Гусев, Никитина, 1979). В частности, образование перекисей в средах с агаром считается основной причиной снижения эффективности клонирования или даже полного отсутствия развития единичных клеток в посевах на поверхности среды (Wolk, 1973).
В связи с тем, что мы предполагали использовать высев на агаризованные среды с целью количественного учета клеток после температурного воздействия, необходимо было подобрать оптимальные условия для выращивания цианобакгерии s.aquatilis на твердой питательной среде, таким образом, чтобы при Еысеве на чашки Петри большая часть клеток оставалась жизнеспособной и образовывала колонии.
Для снятия токсичного эффекта перекиси Еодорода ранее предлагали добавлять к агаризованной среде пируват яа (Baird-Parker, Davenport, 1965) или кагалазу (Martin et al., 1976). В лаборатории микробиологии БиНИИ ЛГУ для этой цели используется гипосульфит На (тиосульфат ца). Добавление гипосульфита приводило в наших опытах к значительному увеличению числа образующихся колоний (р 0,01) (рис.2). Сила влияния гипосульфита составляла 74% (р 0,01), в го время как состав питательной среды влиял незначительно - сила влияния 1% (Р 0,01). Влияние гипосульфита в зависимости от состава среды, в которую он вносится, составляло 11% ф 0,01), а сила влияния случайных факторов - 14%. Очевидно, что в наших опытах на число вырастающих колоний самое значительное влияние оказывает наличие гипосульфита в среде.
Следует отметить, что увеличение концентрации гипосульфита в среде от 0,1 до 0,5% приводило к незначительному (на 5%) увеличению числа образующихся колоний. Дальнейшее повышение содержания гипосульфита (до 1,0%) не оказывало влияния на жизнеспособность цианобактерий. Таким образом, можно заключить, что добавление к агаризованным средам гипосульфита в концентрации 0,1-1,0% существенно повышает жизнеспособность клеток: колонии образуют более 80% засеянных клеток. Вероятно при этом, как и в случае добавления каталазы, устраняется токсичное действие перекиси водорода. В дальнейшем мы использовали в работе твердые питательные среды с добавлением 0,5% гипосульфита.
Следующим этапом работы был подбор параметров температурного воздействия (его длительности и интенсивности), при которых клетки получали бы повреждения, но оставались жизнеспособными . Жизнеспособность клеток оценивали по способности образовывать колонии после высева на агаризованную минеральную ере «опони, гнтрйция гипосульфит ;/ Рис.2. Выживаемость контрольных (I) и прогретых (2) клеток S. aquatilis в зависимости от содержания гипосульфита в среде. ду с 0,5$ гипосульфита и на ту же среду cUaCi. Клетки a.aquailis выдерживали 5 мин при температуре выше температуры роста. Было установлено, что снижение жизнеспособности начинается после прогревания при температуре выше 51 С (рис.3). После прогревания при 51 С в течение 5 минут число колоний, образуемых клетками при высеве на агаризованную среду, не отличается достоверно от числа колоний, образуемых контрольными (непрогреты-ми) клетками.
Однако у прогретых клеток по сравнению с контролем повышается чувствительность к хлористому натрию (рис. 4). Различия в солетолерантносги становятся значимыми уже при 0,5$ хлористого натрия в среде. У контрольных клеток падение жизнеспособности наблюдали в интервале 0,6-0,7$ uaci (Р 0,001) и резкое - между 0,7-0,8$ пасі (Р 0,001). После температурного воздействия этот интервал смещался в сторону более низких концентраций Пасі: 0,5-0,6$ (Р 0,001). Таким образом, содержание в среде 0,6$ Касі не влияло на образование колоний клетками контроля, но значительно снижало число колоний, образующихся после прогрева клеток.
Исходя из этого, мы использовали параллельный высев клеток после нагревания на обычную агаризованную среду (неселек-гивная среда) и ту же среду с добавлением 0,6$ Пасі (селективная среда) для определения доли поврежденных клеток. Этим методом было установлено, что прогревание при 51 С в течение 5 минут вызывает повреждение 30-60$ клеток S.aquatilis, при этом все клетки остаются жизнеспособными.
