Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика бактериального сообщества кишечника в условиях нормоценоза 9
1.2. Дисбиотические нарушения бактериального профиля кишечника ... 15
1.3. Простейшие Balantidium coli как дестабилизирующий фактор микробоценоза кишечника 20
2. Собственные исследования 31
2.1. Объект, материалы и методы исследований 31
2.1.1. Объект исследования 31
2.1.2 Питательные среды 32
2.1.3. Методы исследований 34
2.1.4. Оценка структуры кишечного микробоценоза 41
2.1.5. Определение межмикробных взаимодействий 42
2.1.6. Методы статистического анализа результатов 43
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 44
2.2.1. Исследование паразитоценоза кишечника свиней 44
2.2.2. Характеристика выделенных штаммов Balantidium coli 49
2.2.3. Характеристика качественного и количественного состава микробоценоза кишечника свиней 57
2.2.4. Межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli 68
Заключение 79
Выводы 93
Список использованных литературных источников 94
- Характеристика бактериального сообщества кишечника в условиях нормоценоза
- Дисбиотические нарушения бактериального профиля кишечника
- Оценка структуры кишечного микробоценоза
- Исследование паразитоценоза кишечника свиней
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время хорошо известна важная роль нормальной микробиоты пищеварительного тракта в целом, и кишечника в частности, в создании резистентности макроорганизма к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, действию токсинов, ферментов защиты и агрессии, формировании иммунного гомеостаза и витаминного баланса, участии в метаболических и ферментативных процессах, антимутагенной активности (Красноголовец, 1989; Куваева, Ладодо, 1991; Воробьев, 1997; Акбаева, 1998; Шендеров, 1998; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001; Ильина, 2008). В свою очередь, микробиота кишечника является индикатором состояния макроорганизма и целый ряд факторов приводит к изменению ее качественного и количественного состава. При снижении резистентности макроорганизма представители микробиоценоза кишечника могут проявлять свою патогенность (Шендеров, 2000; Потатуркина-Нестерова с соавт., 2004; Ильина, 2006; Красноперова, 2009).
Среди условно-патогенных микроорганизмов, способствующих возникновению и поддержанию дисбиотического процесса в кишечнике животных, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике практически всех здоровых животных (Walker, 2005). Естественным резервуаром возбудителей многих паразитарных инвазий, в том числе балантидиаза, являются домашние животные – свиньи.
В последние годы в России особенно напряженной стала эпидемиологическая обстановка по паразитарным болезням животных. В стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных различными паразитозами сельскохозяйственных животных, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Романенко, 2001). Особый интерес вызывает балантидиаз, который очень широко распространен у свиней. По данным ряда авторов зараженность свиней балантидиями составляет от 21 % до 100 % , так в Великобритании – 36 %, в Египте – 70 %, в Болгарии от 14 до 81 %, в Греции – 74,6 %, в Новой Гвинее – 100 % (Жордания, 1971; Хамцов, 1972; Рочкене, 1977). Носителями балантидий могут быть также крысы, мыши, дикие кабаны, обезьяны (Kobayashi et al., 1995; Hussain et al., 1997; Кипайкин, Рубашкина, 2002).
В настоящее время достаточно хорошо изучены вопросы биологии балантидий, пути и способы заражения ими животных, дана общая оценка инвазированности разных хозяев (Рочкене, 1977; Лаптева, 1970; Лысенко, 1993). Однако, практически отсутствуют данные о состоянии микробиоценоза кишечника животных при инвазии Balantidium coli, об особенностях межмикробных взаимодействий при формировании паразитоценоза. Малочисленность и фрагментарность работ, дающих представление о стабильности адаптационных и функциональных возможностях кишечника, не отражают характер изменения его микробного статуса при балантидиазе, а также не направлены на изучение нарушений паразитоценоза в целом. В этой связи сравнительное изучение состояния микробиоценоза кишечника свиней при инвазии балантидиями и оценка характера взаимоотношений микроорганизмов, определяющего тяжесть заболевания, представляют научный и практический интерес.
Цель работы – изучить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника свиней и оценить характер межмикробных взаимодействий при инвазии Balantidium coli.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать структуру паразитоценоза кишечника свиней города Ульяновска и Ульяновской области, оценить частоту встречаемости
B. coli. -
Изучить биологические свойства выделенных балантидий в условиях
in vivo и in vitro. -
Провести сравнительные исследования состава микробиоценоза кишечника свиней в норме и при инвазии B. coli.
-
Выявить зависимость состояния облигатной и транзиторной микрофлоры кишечника свиней от степени вирулентности балантидий.
-
Оценить характер межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней в условиях инвазии B. coli.
Научная новизна работы. Установлен широкий спектр представителей паразитоценоза кишечника свиней города Ульяновска и Ульяновской области, включающий 11 видов кишечных паразитов, из которых 8 видов представлены простейшими и 3 вида – гельминтами. Видовой спектр простейших включает инфузории (Balantidium coli), саркодовые (Blastocystis sp., E. hartmanni, E. coli, E. nana, Iodamoeba butschlii), жгутиковые (Lamblia intestinalis) и кокцидии (Cryptosporidium parvum). Показано, что инвазивность свиней простейшими составляет 81,7 %, из них балантидиями – 18,78 %.
Гельминты, представленные 1 видом трематод (Opisthorchis felineus),
1 видом цестод (Hymtnolepis nana) и 1 видом нематод (Ascaris iumbrieoides), выявлены у 12,18 % обследованных свиней.
Впервые проведен комплексный сравнительный анализ состояния микробиоценоза кишечника свиней при балантидиазной инвазии. Охарактеризован видовой состав и выявлены качественные и количественные изменения в составе микрофлоры кишечника животных, инвазированных Balantidium coli.
Впервые установлено, что балантидии обладают различной степенью вирулентности, показана зависимость дисбиотических изменений в составе микробиоценоза кишечника от степени вирулентности балантидий.
Впервые определены особенности межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli, которые сопровождаются сменой абсолютных доминант Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и появлением Escherihia coli с гемолитической активностью и грибов рода Candida.
Практическая значимость работы. Подобранная оптимальная питательная среда для культурального метода диагностики балантидиаза позволяет дополнить имеющиеся сведения о влиянии B. coli на межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней, что обоснованно указывает на необходимость широкого внедрения в ветеринарную практику методов выделения и идентификации B. coli.
По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по межмикробным взаимодействиям в кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli» для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических лабораторий, рекомендованные редакционно-издательским советом и одобренные Ученым советом естественно-географического факультета (протокол № 10 от 23 апреля 2010 г.), монография «Экологические параметры микробиоты кишечника при протозойных инвазиях» (в соавторстве с Н.А. Ильиной, Н.М. Касаткиной, Н.И. Потатуркиной – Нестеровой, Ю.Ю. Красноперовой, 2009). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, паразитологии и экологии микроорганизмов, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Ульяновском государственном педагогическом университете имени И.Н. Ульянова.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Паразитофауна кишечника свиней г. Ульяновска и Ульяновской области представлена 11 видами кишечных паразитов, из которых 8 видов – простейшие и 3 вида – гельминты. Инвазированность свиней простейшими составляет 81,7 % , балантидиями – 18,78 %.
-
Выделенные из организма животных балантидии имеют типичную морфологию, при культивировании на среде Суреша количество инфузорий с максимальными размерами увеличивается, а с минимальными – уменьшается. Уровень вирулентности балантидий значительно варьирует и является показателем их неодинаковой этиологической значимости в развитии инвазии.
-
Балантидиазная инвазия сопровождается значительными изменениями количественных показателей основных эндосимбионтов толстого кишечника животных и увеличением частоты встречаемости представителей транзиторной микрофлоры.
-
Выраженные дисбиотические изменения микрофлоры кишечника свиней регистрируются при инвазии высоковирулентными B. coli.
-
Межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней в условиях инвазии балантидиями характеризуются изменениями, проявляющимися в снижении доминирования и значимости основных симбионтов и увеличении частоты встречаемости транзиторной микрофлоры, свидетельствующие о смене абсолютных доминант микробоценоза.
Работа выполнена на кафедре зоологии и на базе научно-исследовательской лаборатории экологии микроорганизмов ГОУ «Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова».
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: Международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Италия, о. Тенерифе, 2008), III Международной научно-практической конференции «Образование и здоровье. Экономические, медицинские и социальные проблемы» (Пенза, 2008), Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2008), Всероссийской заочной электронной научной конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва, 2008), Международной научной конференции «General practitioner» (Италия, 2009), Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2009), Международном молодежном научном форуме «Университетское образование: традиции и инновации» (Ульяновск, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Экология и здоровье: проблемы и перспективы социально-экологической реабилитации территорий, профилактики заболеваемости и устойчивого развития» (Вологда, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 109 страницах, содержит 16 таблиц и 14 рисунков. Список использованных литературных источников включает 166 наименований, в том числе 33 зарубежных.
Характеристика бактериального сообщества кишечника в условиях нормоценоза
Животные, являясь обитателями биосферы Земли, контактируют с множеством разнообразных микроорганизмов и сами служат источником их поступления в окружающую среду. Заселены все поверхности макроорганизма, соприкасающиеся с внешней средой: кожные и слизистые покровы, верхние дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт на всем его протяжении, мочеполовые органы (Бочков, Овчарова, 1991; Азимов с соавт., 1991; Бухарин с соавт., 2002; Лобзин и с соавт., 2003).
Микробный пейзаж определенных биотопов макроорганизма характеризуется относительным постоянством и индивидуальными различиями, а также меняется в зависимости от возраста, пола, географических условий, характера питания и многих других факторов. Учитывая относительную стабильность нормоценоза и его высокую чувствительность к изменениям внутренней и внешней среды, нормальную микробиоту можно рассматривать как индикатор здоровья животных (Барановский, Кондрашин, 2000).
В настоящее время общепризнано, что в процессе эволюции при взаимодействии организма хозяина и микроорганизмов происходил отбор определенных их видов, способных к прикреплению и колонизации поверхностного эпителия слизистых оболочек соответствующих экологических ниш (Бондаренко, 1999; Лобзин с соавт., 2003). Вследствие этого микроорганизмы стали использовать организм хозяина как новую среду обитания, сформировав симбиотические ассоциации, составляющие нормальную микрофлору животных (Циммерман, 2000).
Известно, что нормальный микробиоценоз кишечника представляет собой сбалансированную микробиологическую систему, видовой состав которой формируется качественно и количественно (Бондаренко, Грачева, Мацулевич, 2003). Изменение одного компонента микробиоценоза влияет на всю систему в целом и зависит от характера микроэкологии в биотопах, который сложился эволюционно и приобрел устойчивость применительно к видовым особенностям макроорганизма (Добровольский, Сереброва, 2007).
Некоторые симбиотические комплексы эволюционировали до столь высокой степени сложности, что опорой их ассоциации стал обмен информацией (Корнева, 1999). Естественно, что для обмена информацией в системе макроорганизм - микробные ассоциации необходимо выполнение следующих условий: 1) обеспечение возможностей для ее существования (оральная толерантность к индигенной микрофлоре); 2) наличие механизмов взаимопользования общими инструктивными молекулами - регуляторными пептидами; 3) способность иммунной системы макроорганизма воспринимать и трансформировать поток генетической информации, представленной микроорганизмами. С участием вышеперечисленных механизмов в процессе эволюции возник симбиоценоз - интеграция микробных ассоциаций с макроорганизмом (Бельмер, Расилина, 1998). Как следствие всех этих эволюционных преобразований возникли сложные микробные ассоциации на коже и слизистых оболочках полостей и органов, имеющих сообщение с внешней средой. Эволюция отобрала и определила круг видов микробов, заселивших макроорганизм, привела к физиологическому равновесию (Воробьев; 1997; Воробьев, Лыкова, 1999).
Установлено, что биомасса микроорганизмов, заселяющих кишечник, включает в себя: 17 семейств, 45 родов и около 500 видов бактерий (Барановский, Кондрашин, 2000). В любом микроценозе всегда имеются постоянно обитающие виды бактерий (главная, облигатная, индигенная, резидентная микрофлора), а также добавочные (сопутствующая, факультативная) и транзиторные (случайные виды микрофлоры). Среди облигатной микрофлоры преобладают неспорообразующие анаэробы: бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, которые составляют 90-98 % микрофлоры кишечника (Куваева, Ладодо, 1991; Шендеров, 1998; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001). Состав нормальной кишечной микрофлоры характеризуется определенными соотношениями между отдельными ее представителями и доминированием анаэробных бактерий при незначительной аэробной микрофлоре. Соотношение анаэробов к аэробам равно 1000:1 (Красноголовец, 1989; Бондаренко с соавт., 1998; Барановский, Кондрашин, 2000; Ефимов, Волошин, Кафарская, 2002).
Бактерии, находящиеся во взаимосвязи с макроорганизмом, представляют собой сложную ассоциацию микроорганизмов, влияющих на жизнедеятельность друг друга (Крамарь с соавт., 1993).
Ряд исследователей (Бондаренко с соавт., 1998; Бухарин с соавт., 2002) рассматривают кишечный микробиоценоз как своеобразный экстракорпоральный орган макроорганизма, который имеет свои функции и s показатели функционального состояния. Нормальный микробиоценоз кишечника выполняет и регулирует различные функции организма. К одной из важных функций нормальной микрофлоры относят колонизационную резистентность организма, заключающуюся в подавлении облигатно-анаэробными бактериями роста и размножения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Лопатина, Бляхер, Николаенко, 1997). Бифидо - и лактобактерии обладают выраженным антагонизмом, регулируют количественный и качественный состав микрофлоры кишечника (Бухарина, 2002).
Кроме того, кишечные бактерии активно участвуют в пищеварении, синтезе гормонов, витаминов (группы В, К), незаменимых аминокислот, способствуют лучшему усвоению солей кальция, витамина D, препятствуют декарбоксилированию пищевого гистидина, оказывая тем самым антиаллергическое действие (Красноголовец, 1989; Воробьев, Лыкова, 1999).
В многочисленных исследованиях (Воробьев, 1997; Коршунов, Володин, Ефимов, 1999) показано, что именно микробиота кишечника стимулирует образование плазматических клеток, синтез иммуноглобулинов, интерферона, цитокининов, увеличивает уровень пропердина и комплемента. Кроме этого, аутофлора кишечника повышает активность лизоцима, способствует снижению проницаемости сосудов для токсических метаболитов (продуктов) патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, препятствует транслокации бактерий во внутренние органы и кровь (Бутурова, Калинин, 2001; Несвижский с соавт., 2002).
Установлено, что от бактерий в значительной мере зависят организация и созревание ретикулоэндотелиальной системы. У животных гнотобиотов наблюдается резкое недоразвитие лимфоидного аппарата, особенно лимфатической ткани пищеварительного тракта: пластинчатых телец, мезентериальных и илеоцекальных лимфатических узлов, почти полностью отсутствуют клетки, продуцирующие иммуноглобулины. Антигены резидентной микрофлоры стимулируют иммунную систему (Чахава, 1987). Известно, что у безмикробных лабораторных животных иммунитет не просто подавлен; у них происходит инволюция иммунокомпетентных органов (Шендеров, 1998; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001).
Представители микробиоценоза кишечника способствуют снижению проницаемости сосудов для токсических метаболитов микробов, препятствуя развитию бактериемии и сепсиса, а также вырабатывают биологически активные вещества, регулирующие многие функцииюрганизма хозяина - работу желудочно-кишечного тракта, обменные процессы, работу печени, сердечно-, сосудистой системы, кроветворения (Гаврилова, 1987).
Известно, что микробиота способствует детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов (аминов, фенолов, мутагенных стероидов и др.), с одной стороны, представляя собой массивный сорбент, выводя из организма токсические продукты с кишечным содержимым, с другой стороны, утилизируя их в реакциях метаболизма для своих нужд (Бондаренко с соавт., 1995; Леванова, Алешкин, 2002).
Микробиота кишечника представляет собой хранилище микробных плазмидных и хромосомных генов, обменивающаяся генетическим материалом с клетками макроорганизма. При внутриклеточных взаимодействиях происходит обмен клеточным материалом, которые реализуются путем эндоцитоза, фагоцитоза и др. Вследствие этого эпителиальные ткани приобретают бактериальные антигены (Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001).
Дисбиотические нарушения бактериального профиля кишечника
При воздействии дестабилизирующих факторов экзогенной и эндогенной природы микроорганизмы кишечника реагируют количественными и качественными сдвигами. Это сопровождается нарушением функции нормальной микробиоты кишечника — развивается дисбактериоз (Гончарик, 1994; Бондаренко, Боев, Лыкова, 1998; Шептулин, 1999).
Дисбактериоз характеризуется исчезновением или снижением числа ее облигатных представителей и повышением популяционного уровня условно-патогенных микроорганизмов, отсутствующих или редко встречающихся в норме (Красноголовец, 1989; Крамарь с соавт., 1993; Багрянцева, 1999). Дисбиозные ассоциации не способны выполнить физиологические и защитные функции кишечника. Ведущая роль в формировании дисбактериоза принадлежит нарушению популяционного уровня анаэробов, таких как бифидо-, лактобактерии, пропионокислые бактерии, бактероиды и др. (Шендеров, 1998; Малов, 2000; Несвежский с соавт., 2002).
Нарушение колонизационной резистентности кишечника, связанное с изменением состава микробиоты кишечника, способствует адгезии и колонизации слизистой оболочки патогенными (шигеллы, сальмонеллы) и условно-патогенными бактериями, обусловливает поступление их токсинов в кровоток, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции различной локализации (Крамарь с соавт., 1988; Aucott et al., 1993; Леванова, Алешкин, 2002).
В поддержании динамического равновесия между макроорганизмом и микробиотой важная роль принадлежит макроорганизму, контролирующему и регулирующему состав микрофлоры с помощью химических, механических и иммунных факторов (Мельникова, 1997; Обгольц, 1992; Бухарин, 1994). При дисбактериозе отношения в системе микробиота-хозяин приобретают агрессивный характер, возрастает степень вирулентности микроорганизмов, что осложняет течение основного патологического процесса (Коршунов, 1995; Коршунов, Володин, Ефимов, 1999; Жерлов с соавт., 2001).
Изучению микробоценоза кишечника посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей (Комаров, Раппорт, 2000; Буторова, Калинин, 2001). На количественное и качественное состояние микробоценоза кишечника влияют: 1) экзогенные факторы - длительное бессистемное применение антибактериальных средств, длительное лечение гормональными препаратами, иммунодепрессантами, цитостатиками, радиоактивное и солнечное облучение, изменение привычного образа жизни, длительные стрессы; 2) эндогенные- факторы - ферментная недостаточность, недостаточная секреция желчи с нарушением функции печени, сенсибилизация организма, протекающая с аллергическими реакциями или болезнями, хронические и острые заболевания желудочно-кишечного тракта, злокачественные новообразования, заболевания кроветворных органов, инфекционные заболевания, хирургические вмешательства, особенно в брюшной полости.
Снижение популяционного уровня облигатной микрофлоры, в первую очередь, бифидобактерий и лактобактерий, обладающих антагонистической активностью, создает условия для развития тех родов и видов энтеробактерий, размножение которых в нормальных условиях подавлено конкуренцией активных симбионтов. Чаще всего в этих условиях развиваются условно-патогенные бактерии — представители родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Staphylococcus, Clostridium, Acinetobacter, Pseudomonas, грибы рода Candida (Бухарин, Усвяцов, 1982; Бондаренко, Яблочков, 1987; Бухарин, 1990; 1992; Бухарин, Соколов, 1993; Бухарин, 1994; Дерябин, 1997; Билимова, 2000; Несвижский с соавт., 2002; Леванова, Алешкин, 2002).
Изучение микробоценоза кишечника инвазированных кишечными паразитами показало, что у 30 % дисбактериоз кишечника был обусловлен микробными ассоциациями: по 4 вида представителей условно — патогенной флоры (УПФ) обнаружено у 4 % больных, по 3 вида - у 6 %, по 2 вида - у 20 %, по 1 виду УПФ в больших количествах - еще у 36 %. St. aureus в количестве 10 выявлен у 32 % детей, энтерококк в количестве 10 — у 8 %, энтеробактер - у 12 %, клебсиелла обнаружена у 14 %, гемолизирующая Е. coli - 20 % (Arienti, 2000).
Таким образом, в процессе взаимодействия макро- и микроорганизма формируется уникальная система, находящаяся в состоянии динамического равновесия. Факторы экзогенной и эндогенной природы приводят к нарушению микроэкологического постоянства; что играет, несомненно, важную роль в развитии, как заболеваний желудочно-кишечного тракта, так и широкого спектра патологических состояний других органов и систем. В связи с этим, при изучении механизмов развития, многих заболеваний необходимо учитывать качественный и количественный состав резидентных и транзиторных представителей микробиоты кишечника.
При снижении колонизационной резистентности происходит увеличение числа и видового спектра потенциально-патогенных микробов, их транслокации через стенку кишечника или других полостей, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции различной локализации (Завгородняя, Зубова, Медведева, 1983; Дерябин, Курлаев, Брудастов, 1996; Григорьев, Яковенко, 2000).
Установлено, что бактерии могут угнетать рост других видов за счет более высокого биологического потенциала, например, более высокой скорости размножения, конкуренции за источник питания, путем изменения рН, продукции токсичных метаболитов - спиртов, перекиси водорода, молочной кислоты и т.д. (Воробьев с соавт., 1995; Златкина, Исаков, Иваников, 2001).
Оценка структуры кишечного микробоценоза
Оценку микробиоценоза проводили с использованием метода количественного выделения видов и вариантов микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза (Куваева, Ладодо, 1991).
Результаты исследований сопоставляли с данными нормального состава биотопа. При этом исходили из следующих критериев: 1) резкого (на несколько порядков) снижения численности основных для биотопа видов или вариантов; 2) значительного (на несколько порядков) увеличения численности популяций видов, которые в нормальном биоценозе встречаются в небольших количествах; 3) появления в микрофлоре большого количества атипичных штаммов основных видов. Для постановки диагноза достаточно было одного из перечисленных критериев, выявленного при анализе микробиоценоза. Диагноз кишечного дисбактериоза устанавливался только в случае резкого снижения в испражнениях популяции Bifidobacterium spp. до 10 КОЕ/г и меньше, Lactobacillus spp. до 105 КОЕ/г и меньше, Escherichia spp. до 10 и меньше при одновременном увеличении численности популяции одного и более условно-патогенных микробов: Staphylococcus spp., Proteus spp., Klebsiella spp. и др. до 104 КОЕ/г и больше, Candida spp. до 104 КОЕ/г и больше, а также по появлению атипичных форм эшерихий до 10 % и более.
Определение межмикробных взаимодействий в кишечнике с последующим изучением связей со средой и функциональной характеристикой проводили путем определения следующих показателей: индекса контагиозно сти, индекса значимости, индекса постоянства. Характер пространственного распределения экологических групп в биотопе изучали с помощью индекса контагиозно сти (Уиттекер, 1980) по формуле: UK=— где UK — индекс контагиозности; S — выборочная дисперсия; X X — среднея арифметическая плотность. Для определения значимости экологических групп микробоценоза пользовались индексом, предложенным М.П. Наткевичайте-Иванаускене (1985), и вычисляли по формуле: V = . где V - индекс значимости; g - сумма встречаемости видов n-vm-z данной группы; п — число описанных пробных площадок; m — среднее число видов на пробной площадке; z — число видов в данной группе. Видовое разнообразие сообществ микроорганизмов, населяющих толстый отдел кишечника, рассчитывали по формуле Р.Уиттекера (1980): ? N - общая плотность бактерий.
Статистическая обработка результатов исследований выполнена на персональном ЭВМ типа IBM «Pentium IV», графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel-2000. При математической обработке данных использовали пакет CSS3.1 «Компьютерная биометрия» (Лакин, 1990) с определением средних арифметических и ошибки средних арифметических. Достоверными считались различия при уровне вероятности менее 5 % (р 0,05).
Паразитирование простейших сопровождается развитием в организме животных и человека вторичных иммунодефицитных состояний и, как следствие, изменением поведения некоторых комменсальных членов протозойной фауны кишечника (Малышева, Романенко, 2006). В этой ситуации проведение комплексного обследования и получение достоверных данных о пораженности макроорганизма паразитами имеет исключительную важность.
В связи с этим, целью исследования на первом этапе работы явилось изучение паразитофауны и паразитоценотических отношений паразитов кишечника для установления доминирующих видов или ассоциаций возбудителей у свиней — одних из главных хозяев балантидий.
Для выбора программы мониторинга паразитоценоза кишечника животных на основе собственного опыта и с учетом данных литературы был проведен анализ эффективности известных диагностических методов по критериювыявления стадий развития кишечных паразитов (табл. 5).
В итоге была выбрана диагностическая система КТ-ФЭО-МЦН как наиболее информативная программа мониторинга. Метод применения данной системы заключается в том, что фекалии животных, предназначенные для исследования, собирают в консервант Турдыева (КТ), который позволяет длительное время сохранять морфологию всех стадий развития кишечных паразитов. При хранении в консерванте вегетативные формы и цисты простейших сохраняют внешний вид и блеск, присущие им в свежем состоянии; спорозоиты в ооцистах криптоспоридий визуализируются, что позволяет более корректно диагностировать криптоспоридиоз.
Исследование паразитоценоза кишечника свиней
МЦН — модифицированный метод окраски Циля — Нильсена позволяет эффективно выявлять весь спектр кишечных паразитов, в том числе и редко диагностируемых простейших (диентамеба, изоспора), яиц и личинок гельминтов. Использование этого метода повышает выявляемость сочетанных инвазий.
Впервые проведено обследование свиней в г. Ульяновске и Ульяновской области на кишечные паразитозы с применением диагностической системы КТ-ФЭО-МЦН. Получены новые данные, отражающие богатое видовое разнообразие паразитофауны кишечника обследованных животных. Выявлено 11 видов кишечных паразитов, из них 8 видов - простейшие. Они были представлены саркодовыми: Blastocystis sp, Е. hartmanni, Е. coli, Е. nana, lodamoeba butschlii, жгутиковые: Lamb Ha intestinalis, инфузориями: Balantidium coli и кокцидиями: Cryptosporidium parvum. Из 4 видов гельминтов обнаружены 1 вид трематод: Opisthorchis felineus, 1 вид цестод: Hymtnolepis папа, 1 вид нематод: Ascaris lumbricoides (табл. 6).
Таким образом, в исследуемом материале обследованных выявлены представители кишечного протоценоза трех семейств: саркодовые (73,60 %), жгутиковые (24,87 %) и инфузории (18,78 %).
Инфузории Balantidium coli также занимают значительное место в паразитоценозе свиней, они были выявлены у 18,78 % обследованных животных.
При оценке паразитоценоза кишечника обследованных в ряде случаев выявлены- ассоциации разных видов паразитов: двухчленные ассоциации -Blastocystis sp. — Lamblia intestinalis, Balantidium coli — Blastocystis sp., Balantidium coli — Candida spp. Следовательно, чаще всего паразитоценоз был представлен сочетанием простейших с инфузориями (17,21 %), простейшими-(17,67 %), Candida spp. (21,27 %) и гельминтами (13,41 %), реже сочетанием гельминтов с гельминтами (0,42 %). Кроме того, встречались трехчленные ассоциации: Lamblia intestinalis — Balantidium coli — Candida spp. (7,39 %), протозойно-гельминто-грибковыми (7,81 %).
Обращает на себя внимание высокая встречаемость дрожжеподобных грибов. Достоверно возрастает зараженность грибами в сочетании с одним и двумя видами паразитов, чаще с простейшими (р 0,0001; р=0,005).
Таким образом, впервые в г. Ульяновске и Ульяновской области проведено массовое обследование поголовья свиней с целью изучения у них паразитоценоза с применением диагностической системы КТ-ФЭО-МЦН. В результате установлена высокая их зараженность кишечными паразитами, в том числе простейшими - 81,7 % и гельминтами - 12,2 %. 2.2.2. Характеристика выделенных штаммов Balantidium coli
Морфология балантидий В ходе работы была изучена морфология выделенных культур Balantidium coli. Исследования показали, что в препаратах, приготовленных из фекалий свиней, размеры обнаруженных балантидий имели значительные различия (табл. 7). Таблица 7 - Размеры балантидий выделенных из исследуемого материала и после культивирования на питательной среде Размеры инфузорий из исследуемого материала (мкм) 40,6±19,7х51,3±12,3 67,4±10,6х81,2±14,6 99,6±23,ЗхЦ4,2±17,5 16,7% 71,8% 11,5% после культивирования 11,3% 62,4 % 26,3 %
Из таблицы видно, что среди выделенных из нативного материала балантидий преобладали клетки размером 67,4=Ы0,6х81,2±14,6 мкм (71,8 %) (рис. 5 а).
Интересным представляется тот факт, что после культивирования на питательных средах размеры инфузорий изменялись. Так, количество балантидий с минимальными размерами уменьшилось до 11,3 %, с максимальными - увеличилось до 26,3 %.
Количество простейших со средними значениями размеров после культивирования составило 62,4 % (рис. 5 б).
В нативном мазке обнаруживались вегетативные формы балантидий, которые быстро передвигались, вращаясь вокруг продольной оси. Тело данных инфузорий имело яйцевидную форму, передний конец более узкий, несколько сплющенный. Вся поверхность тела покрыта продольными рядами ресничек, мерцание которых хорошо заметно по краям клетки. На переднем конце имеется воронкообразное углубление — перистом. Цитоплазма разграничена на тонкий поверхностный слой — эктоплазму и внутреннюю мутную зернистую непрозрачную массу - эндоплазму. На ее фоне в центре тела или ближе к одному из его концов в ряде случаев определяется бобовидной формы ядро — макронуклеус.
В эндоплазме видны также сократительные вакуоли, локализованные на переднем и заднем концах тела и заглоченные пищевые частицы.
При окраске по Гейденгайну балантидии легко обнаруживались при малом увеличении микроскопа, которое позволяло видеть характерную овальную форму тела и крупный, окрашенный в темный цвет, макронуклеус, который располагался внутри цитоплазмы в поперечном, косом или продольном направлении.
Большое увеличение (10x40) позволяло кроме макронуклеуса в цитоплазме определять прилежащий к нему микронуклеус, а также сократительные вакуоли в виде светлых неокрашенных пузырьков в передней и задней частях тела, пищеварительные вакуоли.
При окраске по Романовскому-Гимзе ядра балантидии приобретали насыщенный красный цвет, а цитоплазма - голубой. Окрашивание раствором Люголя придавало цитоплазме легкий желтый" оттенок, на фоне- которого ядра имели более интенсивную окраску.
Микроскопические исследования фекалий после формалин-эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли показали наличие цист. Они имели округлую форму, 40-60 мкм в диаметре, имели двухконтурную оболочку и хорошо определяемое ядро бобовидной формы. При окраске раствором Люголя цисты окрашивались в светло-коричневый цвет.
Таким образом, проведенные исследования показали, что во всех случаях балантидии имели типичное для них строение. Изучение морфологических особенностей балантидии, обнаруженных в нативном материале и в культуре, выращенной на искусственных питательных средах, выявило отличия в размере инфузорий. П Клетки размером 40-70 мкм
Изменения размеров балантидий (а) в фекалиях и (б) культуре После культивирования увеличилось количество крупных клеток и уменьшилось количество мелких. Нередко в препаратах, приготовленных из культуры, наблюдались формы делящихся простейших. Они имели овальную или гантелевидную форму. Микроскопия клинических изолятов редко выявляла клетки в процессе деления.
