Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1.. Патогенный потенциал бактерий рода Klebsiella и их роль в патологии человека 11
1.2. Микробиоценоз кишечника и причины возникновения дисбиотических состояний 16
1.3. Значение инвазии Blastocystis hominis в нарушении микробиоценоза кишечника 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Объекты исследования 34
2.2. Методы исследования 38
2.3. Методы статистического анализа данных 48
ГЛАВА 3. Бластоцисти ая инвазия у гастроэнтероло -гических больных 49
3.1. Результаты обнаружения В. hominis у гастроэнтерологических больных 49
3.2. Морфологическая организация бластоцист 55
3.3. Вирулентность бластоцист 64
3.4. Чувствительность клинических изолятов В. hominis к антипротозойным препаратам 67
ГЛАВА 4. Особенности микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии простейших В. hominis 73
4.1. Микрофлора толстой кишки при бластоцистной инвазии в период обострения заболеваний желудочно-кишечного тракта 73
4.2. Микроценоз кишечника на фоне бластоцистной инвазии в период ремиссии заболеваний 78
4.3. Особенности микрофлоры кишечника у гастроэнтерологических больных без бластоцистной инвазии... 81
ГЛАВА 5. Характеристика клинических изолятов К. pneumoniae 87
5.1. Характеристика клинических изолятов К. pneumoniae в связи с источниками выделения 87
5.2. Характеристика адгезивной активности и цитотоксичности 90
5.3 Гемолитическая активность клинических штаммов К. pneumoniae 93
5.4. Чувствительность к антибиотикам клинических изолятов К. pneumoniae 94
5.5. Выявление вирулентности К. pneumoniae на модели кератоконъюнктивальной пробы 96
5.6. Изучение встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности К. pneumoniae 98
Обсуждение полученных результатов 106
Выводы 127
Практические рекомендации 129
Список литературы
- Микробиоценоз кишечника и причины возникновения дисбиотических состояний
- Методы статистического анализа данных
- Чувствительность клинических изолятов В. hominis к антипротозойным препаратам
- Особенности микрофлоры кишечника у гастроэнтерологических больных без бластоцистной инвазии...
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы наблюдается значительный рост инфекционных заболеваний, этиологически ассоциированных с условно-патогенными микроорганизмами, среди которых одно из ведущих мест занимают бактерии рода Klebsiella (Леванова Л.А., 2001; Фиалкина С.В., 2004; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2005; Егорова С.А., 2007). Многие исследователи признают значительную роль этих бактерий в инфекционной патологии человека и особенно в развитии госпитальных инфекций вызывают 4,5-44,0% всех внутрибольничных острых кишечных инфекций, 8,7-56,9% – госпитальных пневмоний, 6,0-86,0% – бактериемий, 7,0-42,0% – инфекций мочевыводящей системы, 4,8-12,0% – инфицирование послеоперационных ран и ожоговых поверхностей. Спектр заболеваний, вызываемых клебсиеллами, чрезвычайно широк, они являются причиной заболеваний различной локализации. Их выявляют как при острых кишечных, так и при ряде парентеральных инфекций – урологических, менингиальных, токсикосептических и др. К частым проявлениям клебсиеллезной инфекции относятся внутригоспитальные заболевания, наблюдаемые среди детей раннего периода жизни в родовспомогательных учреждениях, больных в палатах интенсивной терапии, онкологических, геронтологических стационарах, ожоговых центрах (Тришин А.В. и соавт., 2005).
Клебсиеллезы характеризуются тяжелым течением и высокой летальностью, многообразием клинических проявлений. Однако концентрация клебсиелл в различном биологическом материале, полученном у больных и контактных, колеблется в значительных пределах, нередко клебсиеллы обнаруживаются в верхних дыхательных путях, в кишечнике и у здоровых людей.
Вероятно, этим обусловлено неоднозначное суждение об этиологической роли клебсиелл в развитии инфекционного заболевания. По данным некоторых авторов, у детей раннего возраста без клинических проявлений острого кишечного заболевания в значительном количестве выделяют различные энтеробактерии. Несмотря на проведение этиотропного лечения и применение пробиотиков, длительность их выделения может продолжаться несколько лет (Коршунов В.М., 2001; Леванова Л.А., 2002).
Поскольку эти микроорганизмы являются представителями факультативной микрофлоры толстого кишечника, обоснование их этиологической значимости при патологических состояниях даже при массивности выделения является сложной задачей и требует дальнейшего изучения факторов патогенности бактерий рода Klebsiella.
Показано, что условно-патогенные энтеробактерии, относящиеся к факультативной микрофлоре кишечника, обладают различными факторами патогенности (Бондаренко В.М., 1996; Мавзютов А.Р. и соавт., 2007; Жеребцов Н.Ю. и соавт., 2007). Однако информация о них до сих пор неполная, мало изученными являются генетические детерминанты факторов патогенности клебсиелл. Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с высокой мобильностью этих нуклеотидных последовательностей, что позволяет им распространяться среди близкородственных бактерий. Именно интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности лежат в основе формирования новых свойств, в том числе патогенных.
В течение последних лет получены данные о значительном влиянии на микробиоценоз кишечника паразитарных инвазий (Торопова Н.П., Сафронова Н.А., Гордеева Л.М., 1998). Обнаружена роль паразитозов в развитии дисбиоза, сопровождающегося нарушением биоценотических взаимоотношений между патогенными бактериями и нормальной кишечной микрофлорой. В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная протозойная инвазия, обусловленная паразитированием в толстом кишечнике простейших Blastocystis hominis. Показано, что Blastocystis hominis способствуют реализации патогенного потенциала бактерий рода Proteus (Курзин А.В., 2008; Moe K.T. et al., 1998). Однако влияние бластоцист на свойства других энтеробактерий, в частности клебсиелл, до сих пор остается не изученным.
Цель исследования
Выявить факторы патогенности и их генетические детерминанты, а также чувствительность к антибактериальным препаратам у Klebsiella pneumoniae, выделенных при инвазии простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных.
Задачи исследования
-
Определить частоту встречаемости бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных в зависимости от нозологической формы, стадии и продолжительности заболевания.
-
Оценить состояние микрофлоры толстого кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии.
-
Провести сравнительное изучение факторов патогенности и чувствительности к антибактериальным препаратам клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных при наличии и отсутствии у них бластоцистной инвазии.
-
Дать сравнительную характеристику частоты встречаемости некоторых генетических детерминант патогенности клебсиелл, изолированных у гастроэнтерологических больных в условиях бластоцистной инвазии и без нее.
Научная новизна работы
Впервые обнаружено, что у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии среди условно-патогенных энтеробактерий доминируют бактерии рода Klebsiella.
Показано достоверное увеличение экспрессии в пуле штаммов клебсиелл, выделенных при бластоцистозе, генетических детерминант патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование (рар С, hly A, elt LT-1 и LT-2).
Впервые установлено, что уровень распространенности изученных ампликонов у штаммов Klebsiella pneumoniae после их сокультивирования с вирулентными бластоцистами достоверно увеличивался.
Дана характеристика особенностей микропейзажа кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии. Показаны глубокие перестройки микробиоценоза кишечника, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии групп микроорганизмов, которые зависели от периода (обострение, ремиссия) и продолжительности заболевания. Степень реализации патогенного потенциала клебсиелл усиливалась при их взаимодействии с бластоцистами.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Частота встречаемости простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных значительно превышала этот показатель у здоровых людей (62,9% и 5,8% соответственно, р<0,05). Данное различие было наиболее выражено при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хроническом гастрите и холецистите. Инвазированность больных бластоцистами нарастала в зависимости от продолжительности заболевания с 63,7% пациентов при стаже 1-5 лет до 87,4% обследованных при длительности заболевания свыше 10 лет. В период обострения заболевания, по сравнению с ремиссией, повышалась не только частота встречаемости B. hominis, но и их вирулентность, а также резистентность к антипротозойным препаратам.
-
Бластоцистная инвазия сопровождалась более выраженными дисбиотическими сдвигами микробиоценоза кишечника, чем при ее отсутствии. Эти изменения проявлялись сменой абсолютных доминант и увеличением видового разнообразия, характеризующиеся снижением уровня содержания облигатной микробиоты и увеличением представителей условно-патогенной группы. Выявленные нарушения микробиоты были характерны для всех больных в период обострения заболеваний и носили менее выраженный характер во время ремиссии.
-
Среди условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии, Klebsiella spp. являлся доминирующим микроорганизмом. Достоверных различий фенотипических признаков патогенности клебсиелл, выделенных у пациентов с бластоцистной инвазией и без нее, выявлено не было, однако, обнаружено статистически подтвержденное увеличение в пуле исследуемых штаммов экспрессии некоторых генетических детерминант патогенности, усиливающейся при совместном культивировании вирулентных Blastocystis hominis. Кроме того, у клебсиелл, выделенных у больных без бластоцистной инвазии, после сокультивирования с простейшими происходило достоверное увеличение искомых ампликонов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Данные, полученные при оценке факторов патогенности бактерий рода Klebsiella, наряду с количественной характеристикой позволяют судить об их этиологической роли в возникновении дисбиотических состояний кишечника, сопровождающих заболевания пищеварительного тракта при бластоцистной инвазии. Выраженные дисбиотические сдвиги микрофлоры кишечника диктуют необходимость проведения регулярных исследований кишечного микропейзажа при данной патологии.
Высокая выявляемость бластоцист при заболеваниях желудочно-кишечного тракта диктует необходимость паразитологического обследования больных, особенно при тяжелом течении. Для выявления бластоцист рекомендуется применять, помимо микроскопического, культуральный метод, значительно повышающий эффективность диагностики.
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости включения в программу обследования гастроэнтерологических больных проведения микробиологических и паразитологических исследований с целью прогнозирования течения заболевания для выявления дополнительных факторов, отягощающих течение основного заболевания.
Определение степени выраженности патогенных свойств и чувствительности к антимикробным препаратам отдельных представителей микробиоценоза кишечника в различные периоды гастроэнтерологических заболеваний позволяет использовать данные исследования для прогнозирования их течения, а также будет способствовать разработке наиболее оптимальной терапии данных заболеваний с учетом микроэкологических особенностей кишечника.
Получен патент на изобретение РФ № 2224465 от 27.02.2004. «Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами».
Опубликованы практические рекомендации «Проблема клебсиеллезов в неинфекционной клинике» (г. Ульяновск, 1998) и «Микрофлора кишечника при бластоцистозной инвазии» (г. Ульяновск, 2003).
Результаты исследований используются в процессе преподавания на кафедрах биологии и биоэкологи, инфекционных и кожно-венерических болезней, курса микробиологии ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет».
Апробация работы и публикации
Диссертация выполнена в соответствии с учебным планом научной работы ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет».
Результаты работы доложены на Региональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» (г. Ульяновск, 2003); XIII ежегодной научно-практической конференции студентов и аспирантов (г. Ульяновск, 2003, 2004, 2005); 11-й межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и соискателей (г. Пенза, 2004); 45-й научно-практической межрегиональной конференции врачей (г. Ульяновск, 2010).
По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, патент РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 156 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованных литературных источников. Список литературы включает 217 источников, в том числе 133 – отечественных автора и 84 – зарубежных. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 32 рисунками.
Микробиоценоз кишечника и причины возникновения дисбиотических состояний
Энтеробактерии рода Klebsiella в последние годы привлекают внимание исследователей, так как, обладая выраженной биологической и экологической пластичностью, они могут приобретать возможность к длительному существованию в организме человека, животных и широкому распространению во внешней среде (Титов Л.П., Шабан Ж.Г., Картель А.И., 2001; Фиалкина СВ., 2004; Niyogi S.K. et al., 2000; Maroncle N. et al., 2002).
Клинические проявления вызываемых клебсиеллами патологических процессов многообразны. Клебсиеллез можно охарактеризовать как заболевание, протекающее в различных клинических формах, при которых клебсиеллы являются этиологическим агентом. Они, как и другие условно-патогенные микроорганизмы, поражают, как правило, людей со сниженной естественной резистентностью организма (первичные и вторичные иммунодефицита). Чаще всего это новорожденные и дети первого года жизни, беременные женщины, постоперационные, посттравматические и онкологические больные, пациенты, с повреждениями кожных покровов и слизистых оболочек. В результате развивается локальный или генерализованный инфекционный процесс. В некоторых случаях клебсиеллезная инфекция протекает крайне тяжело и заканчивается сепсисом с летальностью до 60%, особенно у новорожденных и детей первого года жизни (Тришин А. В. и соавт., 2005).
Информация о заболеваниях, в этиологии которых принимают участие клебсиеллы, постоянно растет. Эти микроорганизмы могут играть этиологическую роль при возникновении пневмоний, инфекций мочеполовой системы, глазных болезней, полиартритов (Титов Л.П., Шабан Ж.Г., Картель А.И., 2001). В последние годы клебсиеллы считаются одним из основных возбудителей внутрибольничных инфекций различной локализации, наиболее часто поражающих новорожденных (Турчанинов Д.В., Стасенко В.Л., Николаев СВ., 2002; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2005). Доказана этиологическая роль клебсиелл при остром первичном сепсисе с явлениями менингоэнцефалита, гломерулонефрита, пневмонии и геморрагическим синдромом либо с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта (Поздеев O.K., Федоров Р.В., 2007; Кретинин СВ., 2008). При клебсиеллезном дисбактериозе изменениям подвержена энтеробактериальная составляющая нормальной микрофлоры. Это проявляется снижением общего количества эшерихий, появлением в составе ассоциаций других условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae (Аклан Набила Ш.М., 2006).
В монографии В.Н. Красноголовец и Б.С. Киселёвой (1996) подробно анализируются такие формы клибсиеллёзной инфекции, как сепсис, пневмония, пиелонефрит, острые кишечные инфекции и приводятся сведения о биологических особенностях клинических штаммов К. pneumoniae.
Клебсиеллезные инфекции имеют склонность к затяжному течению, патогенетической основой которых является персистенция возбудителя в организме хозяина (Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2006; Бухарин О.В., 2002).
По мнению В.М. Бондаренко (1996), важным направлением исследований в этой области является выявление ведущих факторов патогенности бактерий рода Klebsiella, оценка их влияния на развитие патологического процесса и выраженность клинических проявлений, а также на формирование дисбиоза толстого кишечника
Основным фактором патогенности, которым обладают практически все штаммы клебсиелл, является полисахаридная капсула. Она помогает микробу противостоять защитным реакциям организма хозяина, тем самым усиливая его вирулентность (Yeh, Caplular, 2007). Как показали исследования, степень вирулентности зависит от строения капсульного полисахарида, поэтому штаммы различных капсульных серотипов значительно различаются по вирулентности. Многие исследователи рассматривают подвиды К. ozaenae, К. rhinoscleromatis и штаммы К. pneumoniae сероваров К1 и К2 как официально признанные патогенные представители этого рода. Известно, что макрофаги распознают и поглощают клебсиеллы, которые содержат в капсульном полисахариде строго определенные маннозные последовательности. Штаммы клебсиелл, не имеющие таких последовательностей (например, высоковирулентные штаммы серовара К2) избегают фагоцитоза (Le Minor L., 1993). Отмечено, что, кроме антифагоцитарной функции, капсульные полисахариды ингибируют дифференцировку и функциональные способности макрофагов (Мавзютов А.Р. и соавт., 2007). Известно, что гипермукоидные штаммы чаще вызывают различные инвазивные процессы (абсцесс печени, менингиты, эндофтальмиты), а штаммы-мутанты, утратившие капсулу, полученные из высоковирулентного штамма, становятся авирулентными (Sechi A. etal.,2001).
Данные отечественных исследователей о частоте обнаружения различных факторов патогенности у клебсиелл, полученные на лабораторных моделях и культурах клеток, неоднозначны. Так, адгезивная активность клебсиелл описана во многих работах. Е.В. Сурикова, Л.А. Леванова (1999) отмечали, что изученные штаммы клебсиелл обладали адгезивной активностью и маннозорезистентными пилями независимо от источника выделения (больные острыми кишечными инфекциями, здоровые, окружающая среда).
По данным других авторов (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Потатуркина-Нестерова Н.И., 1996), штаммы клебсиелл, выделенные при диареях в 1,5 раза чаще вызывали гемагглютинацию (маннозорезистентную и маннозочувствительную), чем штаммы, выделенные от здоровых людей: 80-90% и 41,9-62,7% соответственно.
Н.М. Арутюнян, А.А, Лалаян, Ю.Т, Алексанян (2001) обнаружили, что факторы адгезии CFA/I, CFA/II и CFA/JII, а также К88, К99 и Vir выявлялись с высокой частотой (45-52%) у клинических штаммов К. pneumoniae, тогда как от практически здоровых детей выделение адгезивных штаммов не превышало 9-15%.
По данным Л.А. Березиной (1996), госпитальные штаммы К. pneumoniae обладали адгезивной и цитотоксической активностью на клеточных линиях НЕр-2, при этом цитотоксическая активность штаммов коррелировала с тяжестью и местом локализации инфекционного процесса. Такие же результаты получены при изучении штаммов клебсиелл, выделенных при диареях у ВИЧ-инфицированных .
Описана способность клебсиелл к адгезии на абиотических поверхностях (стекло, полипропилен и полистерол), в том числе и на различных инструментах для внутреннего пользования. Адгезивная активность в этом случае объясняется наличием пилей 3 типа, в частности их фимбриальным адгезином MrkD (Langstraat J., 2001;Martino P.D. et al., 2003).
У штаммов К. pneumoniae также могут встречаться аггрегативно-адгезивные фимбрии I, описанные у энтероаггрегативных Е. coli. Такие штаммы, имеющие ген aaf/1, вызывают диарею у ВИЧ-инфицированных пациентов (Phuong L., Nguyen Thi et al., 2003).
Практически все известные факторы персистенции энтеробактерий описаны у клебсиелл: антикомплементарная активность, антилизоцимный фактор, антиинтерфероновая активность, антитри пси новая активность, SlgA-протеазная активность, продукция сидерофоров (Бондаренко В.М., 1996, Koszura R., Kaznowski A., 2003). Широкая распространенность факторов персистенции у клебсиелл свидетельствует об их высоком потенциале колонизации. Так, было установлено наличие определенной связи между выраженностью антилизоцимной и антиинтерфероной активности (факторов персистенции) и длительностью и тяжестью дисбиотических процессов (Леванова Л.А. и соавт., 2002).
Методы статистического анализа данных
Согласно современным представлениям, организм человека и колонизирующая его микрофлора составляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии динамического равновесия (Митрохин С.Д., 2000; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). Количественный и качественный составы микрофлоры различных биотопов человека чрезвычайно разнообразны, что отражает значительную роль микробного звена в выполнении целого ряда гомеостатических функций, а также определяет участие отдельных представителей условно-патогенной флоры в развитии патологических процессов (Бухарин О.В., 2002).
Известно, что наиболее представительным как в количественном отношении, так и по видовому составу является микробное сообщество пищеварительного тракта, в частности толстой кишки (Лобзин Ю.В. с соавт., 2003). Формирование состава нормальной микрофлоры кишечника начинается с первых минут жизни новорожденного и зависит от состава микрофлоры родовых путей матери, окружающей ребенка среды, а также от вида вскармливания. Установлено определяющее значение микрофлоры толстого кишечника матери как основного источника бифидо-, лактобактерий, бактероидов, а также условно-патогенных микроорганизмов, которые формируют «пионерские» сообщества в кишечнике новорожденных. Становление микрофлоры продолжается в течение первого года жизни и в дальнейшем зависит от множества факторов (Егорова С.А., 2007). По данным А.Ю. Барановского, Э.А. Кондрашина (2000), Ю.В. Лобзина с соавт. (2003), для людей в возрасте 20-59 лет характерна стабильность в качественных и количественных взаимоотношениях между различными представителями микробиоценозов. Индивидуальность и стабильность микробиоценоза ЖКТ в физиологических условиях у человека является одной из характерных черт (Иванов В.П. с соавт., 2003).
В настоящее время накоплен большой материал о роли микрофлоры пищеварительного тракта в жизнедеятельности человека (Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М., 2002; Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липицкий Е.М., 2003). Аутофлора является одним из факторов неспецифической резистентности макроорганизма, так как обеспечивает колонизационную резистентность путем конкуренции за сайты прикрепления на слизистой оболочке различных отделов желудочно-кишечного тракта по отношению к несвойственной данному отделу кишечника микрофлоре. К факторам колонизационной резистентности, по мнению О.В. Бухарина (2002), можно отнести продукцию микроорганизмами перекиси водорода, бактериоцинов и микромицинов, мурамидаз, других веществ (например, рейтерина - антибиотика лактобацилл). Одной из основных функций нормальной микрофлоры кишечника является участие в метаболических процессах. Микроорганизмы-симбионты синтезируют витамины, гормоноподобные соединения и другие биологически активные вещества, способствующие нормальной перистальтике и подавлению гнилостных процессов в кишечнике (Коршунов В.М., 2001). При расщеплении полисахаридов и белков до структурных мономеров под действием сахаролитических и протеолитических ферментов бактерий образуются газообразные продукты, органические кислоты с короткой цепью (ацетат, пропионат) (Ефимов Б.А., Волошин Н.Н., Кафарская Н.И., 2002; Бухарин О.В., 2002).
Нормальная микрофлора кишечника человека чрезвычайно разнообразна и представлена более чем 450 видами микроорганизмов. Она включает микроорганизмы, различающиеся по типу дыхания: строгие анаэробы (бактероиды, бифидобактерии, клостридии), микроаэрофилы (лактобактерии), факультативные анаэробы (эшерихии, энтерококки, стафилококки); по морфологическим свойствам: грамотрицательные палочки (бактероиды, эшерихии, условно-патогенные энтеробактерии), грамположительные палочки (бифидо- и лактобактерии, клостридии), грамположительные кокки (энтерококки и стафилококки); по способности к спорообразованию -клостридии (Чеснокова М.Г., 2003; Егорова С.А., 2004).
Представители нормальной микрофлоры кишечника распределены в пристеночном слое слизи (мукозная микрофлора). В биопленках микробные клетки располагаются на достаточно близком расстоянии друг от друга, достигая высоких концентраций на поверхности. Патогенные и условно-патогенные микробы при развитии инфекционного процесса способны формировать биопленки. Экранизированные биопленкой бактерии характеризуются большей устойчивостью к воздействию защитных факторов макроорганизма и антимикробным препаратам. (Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Вербицкая Н.Б., 2006).
Как зарубежными, так и отечественными авторами (Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липицкий Е.М., 2003; Skotland E.I. et al., 2001), широко используется подразделение нормальной микрофлоры, населяющей толстый кишечник, на облигатную (постоянную), факультативную (временную, непостоянную) и транзиторную (случайную).
Количественное содержание и качественный состав различных представителей микрофлоры регламентирован в ряде методических руководств по диагностике дисбиоза кишечника (табл. 1).
Облигатную часть микрофлоры кишечника составляют микроорганизмы (бифидобактерии, лактобактерии, эшерихии,бактероиды), присутствующие в данном микробиоценозе на протяжении всей жизни человека, которые выполняют важнейшие функции (Бурмистрова А.Л., 1997; Бойков С.С, Мороз А.Ф., Бабаева Е.Е., 2005). Доминирующей группой, характерной для эубиоза здоровых людей, являются анаэробные бактерии, на долю которых приходится до 95% от общего количества бактерий.
В желудочно-кишечном тракте доминантную микрофлору составляют бифидобактерии {Bifidobacterium bifidum, В. infantis, В. breve), обеспечивающие устойчивость микробиоценоза к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами и выполняющие важную функцию в ассоциативном симбиозе данного биотопа (Бухарин О.В., Валышев А.В., 2006; Бондаренко В.М., 2006). Они начинают занимать доминирующее положение в микрофлоре к 5-20 дню после рождения (Иванов В.П., Бойцов А.Г., Нилова Е.А., 2003). Качественный и количественный состав бифидобактерии кишечника в зависимости от возраста, характера питания, климатической зоны проживания человека хорошо изучены (Gavini F., Cayuela С, Antoine J., 2001). Установлена роль бифидофлоры в реализации ряда защитных механизмов, метаболических реакций макроорганизма и обеспечении колонизационной
Чувствительность клинических изолятов В. hominis к антипротозойным препаратам
Следует отметить, что бластоцисты с количеством ядер от 1 до 6 преобладали в препаратах, приготовленных из фекалий (28,7%), простейшие с количеством ядер от б до 10 встречались в клетках в 59,3% случаев. Многоядерные формы (более 10) В. hominis чаще встречались в культурах и составляли 38,9%, тогда как клетки с меньшим количеством ядер выявлялись в 26,8%о наблюдений (рис. 13).
Положение ядер у бластоцист преимущественно полярное, часто в одной клетке встречаются ядра разных размеров. Все они интенсивно окрашивались железным гематоксилином по Гейденгайну в темно-синий цвет.
Гранулярные клетки бластоцист характеризовались сферической формой и содержанием большого количества гранул (рис. 14), их размеры варьировали (табл. 8).
Бластоцисты амебоидной формы обнаруживались только при культивировании на питательных средах, при хранении культуры количество амебоидных форм увеличивалось. Простейшие этой формы характеризовались наличием 1-2 псевдоподий, видимо участвующих в поступательном движении. Размеры клеток варьировали от 6 до 14 мкм, каждое из них имело одно или два ядра.
Таким образом, в препаратах из фекалий у гастроэнтерологических больных были обнаружены две морфологические формы простейших В. hominis: вакуолярная и гранулярная.
Преобладающей формой В. hominis в клиническом материале являлась вакуолярная (88,9%). Характерной морфологической особенностью вакуолярной формы бластоцист являлось наличие центрального тела, занимающего большую часть клетки.
Установлено, что размеры простейших вакуолярной формы В. hominis варьировали в широких пределах. Клетки менее 6 мкм встречались в 25,3% случаев, 6-15 мкм - в 67,47% наблюдений и более 15 мкм - в 7,2% случаев. Среди вакуолярной формы доминировали бластоцисты, в которых центральное тело занимало от 70-90% объема клетки.
Гранулярные клетки (7,2%) бластоцист имели сферическую форму, их цитоплазма содержала большое количества гранул, их размеры, также как и вакуолярных бластоцист, варьировали.
Следует отметить, что в препаратах, приготовленных из культуры, данная форма встречалась чаще. Клетки имели сферическую форму, содержали большое количество гранул.
Бластоцисты амебоидной формы были обнаружены только в культуре (5,4%), причем при хранении культуры, количество амебоидных форм увеличивалось, что, видимо, связано с изменяющимися свойствами питательной среды (изменение рН среды, окислительно-восстановительного потенциала и др.). Простейшие этой формы характеризовались наличием 1-2 псевдоподий, видимо участвующих в поступательном движении. Размеры клеток варьировали от 6 до 15 мкм, каждые из них имели одно или два ядра.
С целью аргументации этиологической значимости бластоцист в развитии патологического процесса необходимо подтверждение их вирулентности.
Проведенные исследования показали, что 71,3±4,7% штаммов бластоцист, выделенных у больных во время обострения заболевания, обладали вирулентностью, в то время как в период ремиссии доля вирулентных штаммов уменьшалась до 42,5±3,4% (х2=23,6; р 0,001) (рис. 15).
Уровень вирулентности в период обострения заболеваний варьировал от LD5o lg 3,1 ±0,4 до LD50 lg 5,6±0,6. В зависимости от величины этого показателя все вирулентные штаммы были разделены на 3 группы. 25,1%
Проведенные исследования показали, что наиболее часто у пациентов с заболеваниями органов пищеварения (рис. 16) обнаруживались бластоцисты 2-й группы (43,1%), их вирулентность составила LD5(/lg 4,6±0,5. У бластоцист 1-й группы (27,3%) показатель вирулентности был LD50/lg 3,0±0,3, у простейших 3-й группы (29,6%) - LD50/lg 5,4±0,1.
Группа I Группа II Группа III Рис.17. Уровень вирулентности бластоцист в зависимости от периода заболевания В период ремиссии показатель LD50 lg для клинических изолятов колебался от 1,7±0,2 до 4,3±0,5. Штаммов с высокими показателями вирулентности (3 группа) во время стихания клинических проявлений обнаружено не было.
Проведено изучение чувствительности к антипротозойным препаратам бластоцист, выделенных у больных с различной продолжительностью заболеваний, а также в зависимости от его стадии (обострение, ремиссия). В качестве таких препаратов были изучены метронидазол, тинидазол и орнидазол.
Результаты проведенных исследований показали, что в период обострения чувствительностью к тинидазолу обладало 76 штаммов бластоцист (49,7±4,6%), к метронидазолу - 69 клинических изолятов простейших (45,1 ±3,8%). К орнидазолу только 39 штаммов (25,5±3,2% изолятов) проявили чувствительность (рис. 18).
В период ремиссии заболевания наблюдалось увеличение количества штаммов, чувствительных к тинидазолу, метронидазолу и орнидазолу. Частота встречаемости чувствительных изолятов составила 75,8±4,5% (116 штаммов), 67,3±3,7% (103 штамма) и 26,8±3,4% (41 штамм) соответственно. При проведении частотного анализа установлено, что чувствительность к тинидазолу и метронидазолу в 2-х сравниваемых группах (периоды обострения и ремиссии) встречалась с различной частотой ("=13,91; р 0,0002 и "=15,12; р 0,0001 соответственно), а к орнидазолу - с одинаковой частотой ("=2,31; р 0,05).
Среди чувствительных к антипротозоиным препаратам штаммов бластоцист было проведено определение минимальной ингибирующей дозы. Для тинидазола она составила 10" мкг/мл, а к метронидазолу 10" мкг/мл, к орнидазолу бластоцисты были чувствительны при разведении 10" мкг/мл.
В зависимости от величины показателей минимальной ингибирующей концентрации антипротозоиных препаратов, все изученные штаммы разделили на 4 группы. Штаммы 1 группы были наиболее чувствительны к антипротозоиным препаратам. Их рост на питательной среде подавлялся при концентрации препаратов Ю МО"4 мкг/мл. У штаммов 2 группы (умеренно чувствительные), подавление роста происходило при концентрации 10" -10" мкг/мл. Рост штаммов
Анализ полученных результатов показал, что наибольшее количество штаммов, чувствительных к тинидазолу в период обострения заболеваний относились к 1-2 группам (табл. 9). Максимальное количество изолятов бластоцист, проявивших чувствительность к данному препарату, относилось ко второй группе (умеренно чувствительные).
Особенности микрофлоры кишечника у гастроэнтерологических больных без бластоцистной инвазии...
Изменение патогенности условно-патогенных энтеробактерий в настоящее время приобретает все большее медико-биологическое значение (Леванова Л.А. и соавт., 2002; Bingen-Bidous М., Clermont О., Bonacorsi S., 2002; Chinen I., Rivas M., Soriano V., 2002).
Бактерии семейства Enterobacteriaceae обладают множеством факторов патогенности, среди которых ведущую роль играет адгезивная активность, факторы персистенции и продукции энтеротоксинов, являющихся инструментом ломки защитных механизмов организма особенно на начальном этапе развития инфекционного процесса, приводящего в последующем к бурному размножению возбудителя в различных этиотопах хозяина (Бухарин О.В. и соавт., 2002; Бухарин О.В., 2005; Мавзютов А.Р., 2007). Известно, что многие условно-патогенные энтеробактерий, в том числе и Klebsiella, имеют до 10 различных факторов патогенности (Бондаренко В.М., 2006, 2007; Жеребцова Н.Ю. и соавт., 2007).
В литературных источниках нет единого мнения о клебсиеллах, хотя многие отечественные авторы полагают, что микроорганизмы этого рода способны вызывать кишечные инфекции и дисбиотические состояния ЖКТ (Бондаренко В.М., 2002, 2003; Егорова С.А., 2007).
Существует неоднозначное суждение об этиологической роли бактерий рода Klebsiella в развитии заболеваний (Basu S., Mukherjee К.К., Poddar В., 2001; Boutiba-Ben Boubaker 1., Ben Salah D., Besbes M., 2002). Ряд исследователей продолжают считать клебсиеллы условно-патогенными бактериями, в то время как многие авторы признают значительную роль этих бактерий в развитии инфекционной патологии человека. Одни авторы считают, что клебсиеллы являются причиной заболевания лишь при обнаружении их в патологическом материале в значительных концентрациях, другие признают их возбудителями независимо от концентрации. Однако многие исследователи не считают факт выделения этих бактерий аргументацией их этиологической роли.
Для подтверждения патогенности клебсиелл важна информация о свойствах культур, определяющих их способность вызывать патологический процесс и/или генетических структурах, детерминирующих факторы патогенности данных бактерий.
В последние годы в России особенно напряженной стала эпидемиологическая обстановка по паразитарным болезням (Токмалаев А.К., 2001). В стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных различными паразитозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Сергиев В.П., Лебедева М.П., Фролова А.А., 1997; Романенко Н.А., Малышева Н.С., 2002; Куропатенко М.В., Бандурина Т.Ю., Безушкина Н.А., 2003; Бельмер СВ., 2004). Однако по мнению Главного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко (2002) данные официальной статистики о паразитарной заболеваемости занижены. По его оценкам этот показатель составляет около 20 миллионов человек.
В течение последних лет получены данные о значительной роли паразитарных инвазий кишечника (гельминтоз, лямблиоз, бластоцистоз) в патогенезе атопического дерматита, являющихся запускающим механизмом для иммунопатологических изменений кожи и поддерживающих его хроническое течение (Торопова Н.П., Сафронова Н.А., Гордеева Л.М., 1998; Лысенко А.Я., Владимова М.Г., Кондрашин А.В., 2002; Бронштейн A.M., Малышев Н.А., 2004; Хардикова С.А., Белобородова Э.И., Калюжина М.И., 2004; Нестеров А.С., 2009). В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная «новая» протозойная инвазия - бластоцистоз, обусловленная паразитированием простейших Blastocystis hominis в толстом отделе кишечника (Потатуркина-Нестерова Н.И. с соавт., 2004).
Данный возбудитель длительное время не привлекал внимание специалистов как энтеропатоген. Исследованиями С.Н. Zierdt et al. (1967, 1991, 1996) впервые определена протозойная природа В. hominis, установлено их таксономическое положение, получены указания на возможную этиологическую роль этих микроорганизмов в возникновении кишечной инвазии - бластоцистоза у лиц с иммунной недостаточностью, названной болезнью Зиердта-Гаравелли (Чайка Н.А., 1992). Заболевание развивается по типу энтерита, энтероколита или колита (Garavelli P. et al., 1991; Jeddy et al., 1991; Cirioni et al., 1999). Находясь в кишечнике, бластоцисты участвуют в формировании микробиоценоза данного биотопа (Мое К.Т., Singh М., Gopalakrishnakone Р., Но L.C., Tan S.W., Chen X.Q., Yap Е.Н., 1998). Нарушая баланс микроорганизмов, данные возбудители способствуют созданию благоприятных условий для развития патологического процесса в желудочно-кишечном тракте.
До недавнего времени этот возбудитель не рассматривался как этиологический фактор патологических состояний человека. Более того, некоторые исследователи вообще сомневались в патогенных потенциях В. hominis и считали бластоцистоз не заболеванием, а безвредным транзиторным носительством непатогенных микроорганизмов (Johnson et al., 1989).
В настоящее время имеется достаточное количество эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль В.hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма (Красноперова Ю.Ю. и соавт., 2006; Garavelli P. et al., 1991).
Установлено, что системой-мишенью для В. hominis является желудочно-кишечный тракт (Suresh К. et al., 1995; Horton J., 2000). Однако при заболеваниях пищеварительной системы, таких как язвенная болезнь, гастрит, холецистит и др., роль бластоцист до сих пор остается мало изученной.
В связи с вышеизложенным были исследованы клинические изоляты клебсиелл, которые получили у 243 больных, находившихся на лечении в Областной клинической больнице г. Ульяновска с заболеваниями желудочно-кишечного тракта в период 2007-2009 гг. Из них больные язвенной болезнью желудка составили 22,2%, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки — 23,0%, хроническим гастритом - 13,2%, хроническим холециститом — 15,6%, синдромом раздраженного кишечника - 13,2%, неспецифическим язвенным колитом— 12,8% пациентов.
Паразитологические исследования выявили у обследованных широкий видовой спектр возбудителей. Среди обнаруженных паразитов доминирующее положение по частоте встречаемости занимали простейшие (85,2% обследованных), среди которых наиболее часто выявлены Blastocystis hominis (62,9%), Lamblia intestinalis (33,3%) и Entamoeba coli (29,2%).
Инвазированность В.hominis среди лиц, страдающих заболеваниями органов пищеварения, в среднем составила 62,9%, тогда как в группе сравнения данный показатель не превышал 5,8%. Наиболее высокие показатели инвазированности данными простейшими установлены при язвенной болезни желудка (88,9%), язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (81,2), хроническом гастрите (66,1%) и хроническом холецистите (50,0%о).
