Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Этиологическая роль Klebsiella pneumoniae в инфекционной патологии человека 10
1.2. Факторы патогенности энтеробактерий 13
1.2.1. Факторы патогенности Klebsiella pneumoniae 13
1.2.2. Факторы патогенности других условнопатогенных энтеробактерий 21
1.3. ПЦР в идентификации патогенных бактерий и диагностике инфекционных заболеваний 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1. Используемые штаммы, среды 42
2.2. Характеристика эталонных штаммов 43
2.3. Полимеразная цепная реакция 44
2.3.1. Подготовка проб 45
2.3.2. Амплификация ДНК 48
2.3.3. Детекция результатов ПЦР 53
2.4. Биологические методы исследования 55
2.4.1. Количественная оценка адгезивной активности 55
2.4.2. Определение гемолитической активности 56
2.4.3. Определение ДНК-азной и РНК-азной активности 56
2.4.4. Определение казеинолитической активности 57
2.4.5. Определение антилизоцимной активности 57
2.4.6 Определение энтерогемолитической активности 58
2.4.7. Изучение адгезии на модели культуры клеток RH 58
2.4.8. Изучение цитотоксического некротизирующего фактора на модели клеточных линий Vero и HeLa 59
2.4.9. Изучение гемаггютинирующей способности 60
2.4.10. Определение вирулентности штаммов K.pneumoniae при внутрибрюшинном заражении белых мышей 60
2.5. Серологическое типирование K.pneumoniae 60
2.6. Определение чувствительности к антибиотикам 61
2.7. Методы статистического анализа 61
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Коллекция клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и их общая характеристика 62
3.2. Характеристика биологических свойств клинических изолятов Klebsiella pneumoniae 73
3.3. Изучение нуклеотидных последовательностей генов, обеспечивающих адгезию Klebsiella pneumoniae на эпителии 74
3.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез фимбрий S, Р и 1 типа у клинических штаммов Klebsiella pneumoniae 75
3.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей еаеА гена у клинических штаммов K.pneumoniae 77
3.4. Изучение адгезии штаммов Klebsiella pneumoniae на клеточных линиях RH 85
3.5. Изучение генетических детерминант, обеспечивающих размножение возбудителя в тканях 86
3.6. Изучение генетических детерминант токсинообразования у клинических штаммов Klebsiella pneumoniae 88
3.6.1. Обнаружение нуклеотидных последовательностей cnf-1 гена у клинических штаммов Klebsiella pneumoniae 89
3.6.2. Обнаружение нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез шигаподобных энтеротоксинов 1 и 2 типа, у штаммов Klebsiella pneumoniae 90
3.6.3. Определение генетических детерминант, контролирующих синтез гемолизинов, у клинических штаммов Klebsiella pneumoniae 91
3.7. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности у клинических изолятов K.pneumoniae 92
3.8. Фенотипическая экспрессия факторов патогенности Klebsiella pneumoniae 97
3.8.1. Энтерогемолитическая активность клебсиелл 97
3.8.2. Гемолитическая активность клебсиелл 98
3.8.3. Фенотипическая экспрессия цитотоксического некротизирующего фактора-1 98
3.8.4. Гемагглютинирующая активность K.pneumoniae 101
3.9. Оценка патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae in vivo 101
Обсуждение результатов 107
Выводы 115
Список литературы 117
- Этиологическая роль Klebsiella pneumoniae в инфекционной патологии человека
- Амплификация ДНК
- Коллекция клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и их общая характеристика
- Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности у клинических изолятов K.pneumoniae
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время отмечается значительное изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости, связанной с активизацией условнопатогенных бактерий. Наше внимание привлекли капсульные энтеробактерии, в частности клебсиеллы. Клебсиеллы обнаруживаются как при острых кишечных, так и при ряде парентеральных инфекций: урологических, менингеальных, токсикосептических и др. (24).
Клинические проявления вызываемых клебсиеллами патологических процессов многообразны. Кдебсиеллез можно охарактеризовать как заболевание, протекающее в различных клинических формах, при которых клебсиеллы являются этиологическим агентом. Клебсиеллы, как и другие условнопатогенные микроорганизмы, поражают, как правило, людей со сниженной естественной резистентностью организма (первичные и вторичные иммунодефицита). Чаще всего это новорожденные и дети первого года жизни, беременные женщины, постоперационные, посттравматические и онкологические больные, пациенты, с повреждениями кожных покровов и слизистых оболочек. В результате развивается локальный или генерализованный инфекционный процесс. В некоторых случаях клебсиеллезная инфекция протекает крайне тяжело и заканчивается сепсисом с летальностью до 60%, особенно у новорожденных и детей первого года жизни (10).
Достаточно часто клебсиеллы выступают как возбудители внутрибольничных инфекций (ВБИ), которые регистрируются с частотой 100 -180 случаев на 100 тыс. новорожденных, 60-80 случаев на 100 тыс. госпитализированных (18). Причиной этого является применение антибиотиков, использование иммунодепрессантов, широкое применение
внутривенных вливаний, хирургических вмешательств. Также возникновению внутрибольничных инфекций клебсиеллезной этиологии способствует циркуляция этих бактерий в родовспомогательных учреждениях, в отделениях для новорожденных, в отделениях соматических стационаров. Характерной особенностью ВБИ, обусловленных условнопатогенными микроорганизмами, является формирование и распространение штаммов с повышенной вирулентностью.
К настоящему времени у клебсиелл изучено небольшое число факторов патогенности. Известны фимбриальные структуры и белки наружной мембраны, сообщающие адгезивную активность Klebsiella pneumoniae. Многие штаммы обладают полисахаридной капсулой, которая защищает микробную клетку от лизирующего действия комплемента и фагоцитов хозяина, продуцируют токсины (термостабильный-ST и термолабильный-LT энтеротоксины, тиолзависимый гемолизин), вещества, инактивирующие лизоцим, бактерицидный компонент интерферона, секреторный иммуноглобулин А. Однако, информация неполная, многие патогенные свойства клебсиелл остаются малоизученными.
Исходя из того, что клинические проявления клебсиеллезов многообразны, а спектр изученных факторов патогенности клебсиелл остается узким, актуальной является проблема поиска новых патогенетических свойств у клинических штаммов K.pneumoniae, в частности факторов патогенности, известных для других энтеробактерий. Установлено, что родственные виды могут обладать сходными свойствами. Так, доказано, что энтеротоксины, продуцируемые штаммами K.pneumoniae, высоко гомологичны энтеротоксинам Е.соИ. Показана гомология фимбриальных адгезинов клебсиелл и эшерихий (10).
В свете достижений современной молекулярной биологии и генетики, которые привели к возникновению новых методов изучения генома и
диагностики инфекционных заболеваний, представляет интерес использование этих методов для исследования факторов патогенности K.pneumoniae. Одним из таких методов является метод ГТЦР. Уже имеются работы, посвященные применению молекулярно-генетических методов, в частности гибридизационных зондов, для определения термолабильного энтеротоксина (LT) у штаммов клебсиелл, выделенных при острых кишечных инфекциях (6).
Возможность появления сходных генетических структур у разных видов энтеробактерий обусловлена современными представлениями о мобильных генетических элементах, к числу которых принадлежат «острова» патогенности.
Под островами патогенности принято понимать фрагменты ДНК, размерами от 1 до 10 kb («островки») или от 10-20 до 200 kb («острова»), включающие дискретные гены вирулентности и обнаруживаемые только у патогенных микроорганизмов. Указанные фрагменты ДНК отличаются от «core genome» по содержанию % G+C, как правило, фланкированы малыми прямыми нуклеотидными повторами (DR-directly repead) и часто ассоциированы с 3' областью локусов различных транспортных РНК (тРНК). Детерминанты ОП способны распространяться среди родственных видов бактерий при конъюгации, трансдукции или трансформации. Такая мобильность ОП связана с тем, что они могут входить в состав бактериофагов, транспозонов или плазмид. Именно интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности, входящих в состав ОП, и лежит в основе формирования новых свойств, в том числе вирулентных у родственных непатогенных видов бактерий различных таксономических групп (3, 107, 129).
У условнопатогенных, в частности некоторых серотипов E.coli известны ОП, несущие гены, контролирующие синтез адгезинов, инвазинов, токсинов (гемолизина, цитотоксического некротизирующего фактора-1 (CNF-1),
шигаподобного энтеротоксина и др.), системы поглощения ионов железа, важной для размножения возбудителя в тканях.
Учитывая вышеизложенное, определение нуклеотидных
последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности различных энтеробактерий, у клинических штаммов К. pneumoniae методом полимеразной цепной реакции является актуальным.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: исследовать наличие нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности энтеробактерий, у штаммов K.pneumoniae, изолированных при урологических и острых кишечных инфекциях, токсикосептицемиях, дисбиотических состояниях.
Задачи исследования:
1. Выделить штаммы Klebsiella pneumoniae от больных с уроинфекциями,
острыми кишечными инфекциями, токсикосептицемиями, дисбиотическими
состояниями.
2. Подобрать праймеры, специфичные в отношении факторов
патогенности различных энтеробактерий и оптимизировать условия
амплификации этих праймеров.
3. С помощью набора праймеров, амплифицирующих, нуклеотидные
последовательности генов, обеспечивающих адгезию: возбудителя (фимбрии Р
типа (рарС и рарН), S типа (sfaA и sfaG) и 1 типа (fimA), бактериальный
адгезии интимин - еаеА), размножение в тканях (железорегулируемый белок -
irp2), продукцию токсических веществ (цитотоксический некротизирующий
фактор - cnfl, энтерогемолизин - ehxA, сс-гемолизин - ЫуВ, шигаподобные
энтеротоксины 1 и 2 типа - stxl и stx2), определить наличие указанных
детерминант у штаммов K.pneumoniae.
4. Дать сравнительную характеристику частоты встречаемости
нуклеотидных последовательностей некоторых генов патогенности у штаммов
клебсиелл и других энтеробактерий.
*
5. Оценить возможность экспрессии некоторых генетических
т детерминант патогенности, нуклеотидные последовательности которых были
выявлены у клинических штаммов K.pneumoniae методом ПЦР с использованием различных биологических моделей.
Научная новизна и практическая значимость работы.
У клинических изолятов Klebsiella pneumoniae впервые обнаружены нуклеотидные последовательности генов, обеспечивающих адгезию возбудителя (рарС, рарН, sfaG, sfaA, eaeA, fimA гены), размножение в тканях
(irp2 ген) и продукцию токсинов (cnf 1, ehx, hly, stx2).
Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности, у клинических штаммов Klebsiella pneumoniae составила 31,8%.
Подобраны праймеры, амплифицирующие консервативные участки генов, контролирующих синтез факторов патогенности энтеробактерий, и оптимизированы условия их амплификации.
Показана корреляция между присутствием в геноме штаммов клебсиелл нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих синтез факторов патогенности, и экспрессией адгезинов, сс-гемолизина, энтерогемолизина,
цитотоксического некротизирующего фактора 1.
Предложен набор из трех пар праймеров, для выявления нуклеотидных «
последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности,
ассоциированных с адгезивной, цитотоксической активностью и способностью
к размножению in vivo как у бактерий рода Klebsiella, так и других
представителей семейства Enterobacteriaceae. Праймеры могут быть использованы для типирования внутрибольничных штаммов клебсиелл с целью установления источника происхождения изолятов.
За неоценимую помощь при выполнении работы автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - заведующему лабораторией генетики вирулентности бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, проф., д.м.н. В.М. Бондаренко и всем сотрудникам лаборатории. Автор благодарит в.н.с. НИИ им. Д.И. Ивановского, к.б.н. Михайлову Г.Р. за консультации и помощь при выполнении экспериментов на клеточных линиях.
Этиологическая роль Klebsiella pneumoniae в инфекционной патологии человека
В настоящее время приобретают все большее медицинское значение условнопатогенные энтеробактерии, к числу которых принадлежат клебсиеллы. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, не имеют нозологической специфичности и чаще всего протекают у лиц с микроэкологическими и иммунологическими нарушениями, что и является критерием причисления бактерий рода Klebsiella к условнопатогенным микроорганизмам (9). Исследования последних лет показывают присутствие у клебсиелл факторов патогенности, участвующих в различных этапах инфекционного процесса (192, 197). Однако, лабораторная диагностика, базирующаяся на классическом способе обнаружения клебсиелл бактериологическим методом, не дает возможности судить о патогенетическом потенциале выделенных штаммов, и, соответственно, делать вывод об их этиологической роли, особенно при микст-инфекции. Необходимость анализа факторов патогенности выделенных штаммов обусловлена широким спектром острых и хронических инфекционных заболеваниях, при которых изолируются клебсиеллы. Клебсиеллы являются этиологическим агентом при пневмонии, инфекциях мочеполовой системы, острых желудочно-кишечных заболеваний, t различных гнойно-септических осложнениях, а также при менингите, эндокардите, глазных инфекциях, анкилозирующем спондилите, полиартрите,(14, 50, 53, 105, 191, 144). Клебсиеллы вызывают интерес у специалистов санитарно-гигиенической и ветеринарной службы, так как их обнаруживают при заболеваниях животных (пневмонии, маститы, септицемии), выделяют из пищевых продуктов, с поверхности овощей и семян, цветов, из воды различных водоемов (70). Штаммы, изолированные при таких инфекциях, обладают сходным набором факторов патогенности с клиническими изолятами (167, 121).
Особое место занимают клебсиеллы как возбудители внутрибольничных инфекций. Причем представители рода Klebsiella занимают одно из первых мест среди этиологических агентов. Клебсиеллы выделены при внутрибольничных инфекциях с различной клинической картиной. (112). Чаще других при госпитальных инфекциях выделяют Klebsiella pneumoniae (201, 168, 10, 24). Особенно тяжело клебсиеллезные инфекции протекают в родовспомогательных отделениях и клиниках, когда клебсиеллы длительно выделяются от рожениц и родильниц, контаминируют организм новорожденных (60, 104). В связи с этим подчеркивается необходимость контроля за развитием клебсиеллеза в родильных домах с применением компьютерных технологий (11). Чаще всего внутрибольничные инфекции вызывают полирезистентные штаммы клебсиелл (114, 95).
По данным литературы долю Klebsiella pneumoniae приходится от 48 до 53% всех случаев сепсис у новорожденных, смертность при которых достигает 44-45% (26). Так, исследования, проведенные на базе Омского городского клинического перинатального центра (ГКПЦ) по оценке гнойно-септической заболеваемости детей в неонатальном периоде за 1994-2000гг., показали значительную заболеваемость сепсисом и остеомиелитом, а в последние годы наметилась тенденция к ее росту. Наиболее часто госпитальная гнойно-септическая инфекция присоединялась к основному заболеванию на 7-12 день пребывания больных детей в стационаре. Из взятых проб у новорожденных чаще всего изолировали K.pneumoniae (35%). Так же эти микробы высеваемости из объектов окружающей среды в данном стационаре. Процент высеваемости составил - 12,3%. (34).
Причинами увеличения числа внутрибольничных, вызванных K.pneumoniae бактериемии являются: длительное применение антибиотиков, иммунодепрессантов, внутривенных вливаний, различных инструментальных манипуляций и хирургических вмешательств, появление больных с последствиями реанимационных мероприятий, с врожденными иммунодефицитными состояниями (55, 133, 145).
Клебсиеллы являются этиологическим агентом при инфекциях, мочевыводящих путей и урогенительных заболеваниях. Они могут встречаться как в ассоциации с другими микроорганизмами (E.coli, Proteus spp. и др.), что приводит к значительному утяжелению основной инфекции, так и играть самостоятельную этиологическую роль (23, 28, 160).
Частота инфекций мочеполового тракта, вызванных различными условнопатогенными микроорганизмами, включая K.pneumoniae, может варьировать в зависимости от характера и тяжести заболевания.
Так, частота инфекций, вызванных E.coli, снижается примерно до 40%, а роль клебсиелл возрастает до 15%. У пациентов отделений интенсивной терапии количество инфекций, вызванных E.coli, снижается еще в большей степени - до 24%, в то время как роль клебсиелл возрастает до 16% (31).
На первое место выходят клебсиеллы в качестве причины инфекций мочевыводящих путей у больных, страдающих сахарным диабетом (173).
Бактерии рода Klebsiella способны поражать и дыхательный тракт, где наблюдаются острые респираторные заболевания и пневмонии, иногда с деструкцией легочной ткани и развитием абсцессов. Кроме того, клебсиеллы являются этиологической причиной хронических заболеваний верхних дыхательных путей, характеризующихся длительной персистенцией возбудителя, недостаточностью иммунной реакции организма хозяина, многолетним течением процесса, медленным и сложным восстановлением нарушенных функций (33).
Наиболее часто бактерии рода Klebsiella выступают как этиологический фактор при острых кишечных инфекциях (ОКИ), особенно у детей (20, 22, 32). В этом случае изолируются токсигенные штаммами клебсиелл. По данным литературы показано, что клебсиеллы могут иметь факторы патогенности, обеспечивающие энтероагрегативную адгезию и продукцию энтеротоксинов (ST-термостабильного и LT-термолабильного) (6, 38, 155, 87). Так же в литературе описан случай кровавой диареи, вызванной K.pneumoniae. Возможно, это связано с присутствием у клебсиелл новых, еще не изученных факторов патогенности (103).
Все вышесказанное свидетельствует о широком спектре заболеваний, обусловленных K.pneumoniae, и недостаточной изученности выделенных при них штаммов клебсиелл, что предопределяет необходимость их более глубокого и детального исследования.
Амплификация ДНК
Метод полимеразной цепной реакции широко используется в различных областях медицинской микробиологии. Применение метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для идентификации микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина (16, 17, 96).
Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; В гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов (27). Нашел применение метод ПЦР для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов(69). Используется метод ПЦР для идентификации условнопатогенных микроорганизмов, выявлению у них генетических детерминант вирулентности (163, 185). Известно, что эшерихии, вызывающие острые кишечные инфекции подразделяются на 6 патотипов: энтеротоксигенные (ЕТЕС), энтерогеморрагические (ЕНЕС), энтероагрегирующие (EagEC), диффузноагрегативные (DAEC), энтеропатогенные (ЕРЕС), энтероинвазивные (EIEC) E.coli соответственно (156). Предложены ПЦР тест-системы, позволяющие определять специфические фрагменты каждого класса кишечных палочек. ЕТЕС - гены плазмидного генома cfal,2 и др. LT(elt) и ST(est) энтеротоксинов. ЕНЕС — хромосомные гены - rfb 0157 (497 bp); гены профагового генома stxl (130 bp) и stx2 (346 bp); плазмидного генома сериновой протеазы espP (246 bp). EagEC - гены плазмидного генома (630 bp). DAEC - гены плазмидного генома agg и гены токсина 107 kDa. ЕРЕС - последовательности хромосомного еаеА - гена (494 bp); плазмидного - bfpA (324 bp). EIEC — гены плазмидного генома іраН (424 bp). Для идентификации энтерогеморрагических кишечных палочек предложена мультиплексная система ПЦР, в основу которой заложена детекция видовых специфических фрагментов и оригинальных генов, связанных с патогенностью ЕНЕС (61). Комбинации праймеров в этой системе могут быть различными. Учитывая фенотипические особенности E.coli 0157:Н7, в частности, неспособность ферментировать р-глюкуронид, мультиплексная система ПЦР может включать комбинацию праймеров для мутантного глюкуронидазного гена (uidA) и для stxl и stx2 генов (157).
Известен подход, где наряду с stx и еаеА генами детектируется flaC — ген, детерминирующий Н7 антиген, хотя он может отсутствовать у ряда штаммов ЕНЕС.
Обращают внимание на перспективность использования комбинации хромосомных (stx и еаеА) генов и нуклеотидных последовательностей плазмидного (ehx) - гена для индикации E.coli 0157:Н7. Однако при постановке подобной реакции возникли трудности в подборе режима всей процедуры амплификации, так как ампликоны сильно отличались по длине (1087 п.о.фрагмента еаеА гена, 224 - stx и 166 - ehx гена); не соответствовала друг другу и температура отжига праймеров (164). Недавно описан метод мультиплексной ПЦР в реальном времени, основанный на детекции stxl, stx2, еаеА и ehx генов для ускоренной идентификации E.coli 0157:Н7 (123, 172).
Используя метод ПЦР, изучены детерминанты патогенности уропатогенных E.coli (ПРЕС). Чаще всего патогенные штаммы несут гены, контролирующие синтез фимбриальных адгезинов (типа I, Р и S фимбрий), альфа-гемолизина (Н1у), цитотоксического некротизирующего фактора 1 (CNF-1), усвоение ионов железа, а также системы секреции III типа (200), которые сгруппированы в островки патогенности. Применяя специфичные праймеры возможно обнаружить гены островков патогенности у родственных видов бактерий. Так, фрагменты рггА гена (поглощение железа), входящего в состав PAI уропатогенного штамма E.coli CFT073, обнаружены у энтерогеморрагических E.coli 0157:Н7 (73).
Таким образом, данные литературы свидетельствуют о широком использовании полимеразной цепной реакции, как для диагностики инфекционных заболеваний, так и для выявления факторов патогенности микроорганизмов. Перспективным является направление применения метода ПНР для определения генетических детерминант патогенности условнопатогенных бактерий, в частности К. pneumoniae.
Проанализировав литературу можно сделать вывод о важной роли клебсиелл в инфекционной патологии человека. Это связано с увеличением числа заболеваний клебсиеллезной этиологии, характеризующихся тяжелым течением, нередко переходящих в хроническую форму, бактерионосительство и высоким показателем летальности. В связи с этим возникает большой интерес к патогенетическим свойствам клебсиелл, которые остаются недостаточно изученными. Количество детально изученных факторов патогенности K.pneumoniae очень мало, в то время как у других условнопатогенных энтеробактерий, в том числе у E.coli, описан широкий спектр патогенетических свойств. Удобным методом для изучения новых факторов патогенности является метод ПНР, при помощи которого можно выявить консервативные участки генов, контролирующих синтез факторов патогенности у разных видов энтеробактерий с целью дальнейшего детального изучения генетических детерминант патогенности и разработки ПЦР системы для детекции факторов патогенности K.pneumoniae.
Коллекция клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и их общая характеристика
В опытах использовали модель инфицированных бактериями перевиваемых клеток линии RH, являющуюся наиболее удобной для ультраструктурного изучения взаимодействия бактерий с клеткой. В качестве объекта был выбран штамм K.pneumoniae №6723. Бактерии указанного штамма характеризовались высокой адгезивностью. Прикрепление K.pneumoniae к поверхности клеток RH приводит к быстрому появлению большого числа отростков на поверхности клеток монослоя. Последующее размножение прикрепленных бактерий вызывает округление эукариотической клетки одновременно с дальнейшим увеличением количества отростков. Бактерии, находящиеся в контакте с клетками, на поздних стадиях контакта опутаны отростками.
Наряду с этим электронно-микроскопическое исследование позволило установить, что спустя 3 ч после окончания адсорбции бактерий на клетках монослоя в межклеточном пространстве появляются мембраноподобные, а также аморфные структуры, отделяющиеся от поверхности клеток. При этом бактерии часто оказываются прикрепленными к этим структурам посредством капсулы, окрашиваемой рутениевым красным. В месте контакта неопределима граница между бактериальной капсулой и гликокаликсом эпителиальной клетки.
В результате анализа серийных ультратонких срезов было установлено, что бактерии прикреплены чаще всего к выростам цитоплазмы конической формы, напоминающим очень короткие отростки. Так как в неинфицированном монослое подобные структуры не обнаружены, вероятно, их образование является специфическим ответом эпителиальной клетки на адгезию бактерий. Сходные структуры, названные «пьедесталами», описаны при взаимодействии энтеропатогенных (ЕРЕС) и энтерогеморрагических (ЕНЕС) кишечных палочек с эпителием кишечника. В процессе адгезии указанных штаммов E.coli важную роль играет белок наружной мембраны — интимин, кодируемый хромосомным еаеА геном и входящим в состав острова патогенности LEE (locus of enterocyte effacement - локус сглаживания энтероцитов). Такой ген обнаружен у Citrobacter rodentium и Hafnia alvei (78). Однако, результаты ПЦР анализа не подтвердили наличие еаеА гена у штамма K.pneumoniae №6723, а также показали очень редкую частоту встречаемости искомых нуклеотидных последовательностей у других штаммов из коллекции, как описано выше.
Несмотря на схожесть фенотипически наблюдаемых структур в виде пьедесталов, при анализе ультратонких срезов зараженных клебсиеллами клеток, со структурами, наблюдаемыми при взаимодействии энтеропатогенных эшерихий с эпителием, генетических контроль признака может иметь разную природу.
Для роста и размножения микроорганизмов в тканях необходимо железо. Многие бактерии способны синтезировать белки сидерофоры, способные улавливать и транспортировать молекулы Fe3+ внутрь клетки. «Остров высокой патогенности» (HPI), впервые обнаруженный у патогенных Yersinia spp., содержит ряд генов, необходимых для синтеза (гены irpl-5 и irp9 - iron-repressible proteins), транспорта (гены ігрб, irp7 и fyuA - ferric yersiniabactin uptake) и регуляции (ybtA ген) сидерофора иерсинеобактина. Литературные данные свидетельствуют о широком распространении HPI среди различных видов энтеробактерий: Escherichia coli (145, 102), Citrobacter, Salmonella (66, 69, 128, 181).
В нашей работе изучалось распространение нуклеотидных последовательностей irp2 гена среди клинических изолятов Klebsiella pneumoniae различного происхождения. Все штаммы протестированы в ПЦР, используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности ігр2-гена (рис 10). В качестве контрольного использовали штамм K.planticola 190, содержащий ігр2 ген.
Положительные сигналы были получены в 51 случае (20,0%). Чаще всего фрагменты irp-2 гена выявлялись у уропатогенных (34,8%) и энтеропатогенных (22,1%) штаммов клебсиелл, несколько реже у клебсиелл, изолированных из крови больных - 11,5%. Искомые ампликоны выявлялись и при тестировании Klebsiella pneumoniae, выделенных из кишечника людей с дисбиотическими состояниями- 13,3% (рис 17).
Полученные результаты говорят о присутствии фрагментов irp-2 гена у клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных при инфекционных процессах различных мест локализации и дисбактериозах кишечника. Конечно, необходимо дальнейшее детальное изучение, с целью доказательства присутствия полноценного, экспрессирующегося irp-2 гена у клебсиелл. Однако, полученные данные уже дают возможность предположить потенциальную патогенность штаммов клебсиелл. Известно, что HPI является нестабильным генетическим элементом и спонтанная его потеря у Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica приводит к утрате способности поглощать железо и как следствие снижение вирулентности (183).
Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов патогенности у клинических изолятов K.pneumoniae
Для оценки энтерогемолитическои активности клебсиелл использовался энтерогемолизиновый агар фирмы SIFIN (Германия). После инкубации в течение 24-48 часов на чашках вокруг колоний наблюдались зоны гемолиза. Медленный лизис эритроцитов на энтерогемолизиновом агаре указывает на продукцию клебсиеллами внутриклеточного энтерогемолизина, который начинает накапливаться в логарифмической фазе роста и достигает максимального значения к концу этой фазы.
В эксперимент были взяты 25 штаммов, обладающих нуклеотидными последовательностями ehx гена, по результатам ПЦР. 21 штамм (84%) обладал энтерогемолитическои активностью, которая регистрировалась на вторые сутки.
Таким образом, частота встречаемости нуклеотидных последовательностей ehx гена у клинических штаммов K.pneumoniae по результатам ПЦР оказалась несколько выше по сравнению с количеством штаммов, продуцирующих энтерогемолизин. Некоторые штаммы, обладающие нуклеотидными последовательностями ehx гена, давали отрицательный результат на энтерогемолизиновом агаре. Гемолитическая активность клебсиелл оценивалась на кровяном агаре, содержащем 5% эритроцитов крупного рогатого скота. В эксперимент были взяты 17 штаммов K.pneumoniae, обладающие нуклеотидными последовательностями ЫуВ гена по результатам ПЦР. После инкубации в течение 24ч при температуре 37С, а затем еще 24ч при комнатной температуре на чашках был отмечен гемолиз. Результаты тестирования позволили выявить 16 гемолитическиактивных штаммов клебсиелл, что составило 94,1%. Наиболее удобной и простой моделью для изучения цитотоксического некротизирующего фактора является культура клеток (Vero, HeLa, Нер-2). CNF-1 нарушает процесс деления клеток и приводит к образованию гигантских многоядерных клеток, что является критерием оценки изменений, вызванных CNF-1. Для эксперимента было отобрано 5 штаммов K.pneumoniae, содержащих нуклеотидные последовательности cnf-І гена и один контрольный штамм уропагенной E.coli 763/К. Бактериальные клетки, выращенные на сердечно-мозговом бульоне, разрушали ультразвуком, с целью высвобождения токсина. Супернатант после центрифугирования и фильтрования вносили в культуру клеток Vero и HeLa. На монослое клеток были заметны изменения с появления многоклеточных структур. Размеры отдельных клеток сильно увеличивались за счет деления ядер, в основном посредством амитоза или прямого деления (почкования). В результате образуются более или менее значительные массы цитоплазмы, не разделенные на отдельные клетки и включающие различное число ядер. В дальнейшем происходит дегенерация клеток, начиная с агрегации ядер и ретракции цитоплазмы в центральной части многоядерной клетки. Крупные клетки деформируются и легко отделяются от стекла. В клетках использованных культур иногда наблюдаются патологические митозы (колхициноподобные митозы), а также блокировка клеток на стадии телофазы (рис.21). Полученные данные свидетельствуют о цитопатическом действии CNF-1 на культуру клеток уже через 24 часа после начала опыта. В дальнейшем, через 48ч и 72ч наблюдается интенсивный процесс дегенерации клеток. Он начинается с гиперхромности отдельных клеток (ядер и цитоплазмы). Затем быстро развиваются картины плазморексиса, кариорексиса и кариопикноза. Часть клеток при деструкции приобретают неправильной формы цитоплазмотические отростки с соседними клетками. Затем клетки округляются и отторгаются от стекла. Тотальная деструкция клеток сопровождается грануляцией и плазмотозом клеток с одновременным пикнозом ядер. Все изученные штаммы K.pneumoniae вызывали цитопатические изменения в монослое клеток Vero и HeLa с образованием многоядерных клеток. Изменения, были аналогичны изменениям, вызванным контрольным штаммом E.coli 763/К. Контрольные клетки Vero состоят из эпителиоподобных и полигональных клеток. Ядра округлые, ядрышки крупные, по 1 -2 в ядре. Контрольные клетки HeLa - культура полиморфная, состоит из эпителиоподобных клеток с ядрами различной величины и формы. Встречаются гигантские ядра и клетки. Количество, величина и форма ядрышек также варьирует (рис.22).
