Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Современное состояние рынка противогеморроидальных препаратов 13
1.2 Фармакогностическая характеристика стальника полевого и облепихи крушиновидной 16
1.2.1 Стальник полевой (Ononis arvensis) семейство Бобовые (Fabaceae) 16
1.2.2 Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides L.) семейство Лоховые (Elaeagnaceae) 18
1.3 Современные аспекты технологии суппозиториев 20
1.3.1 Суппозиторные основы 22
1.3.2 Введение лекарственных веществ в основу 25
1.3.3 Требования, предъявляемые к суппозиториям 26
1.3.4 Перспективы развития ректальных лекарственных форм 27
1.4 Современное состояние исследований в области экстрагирования лекарственного растительного сырья 28
Заключение 34
Экспериментальная часть 36
Глава 2 Объекты и методы исследования 37
2.1 Объекты исследования и вспомогательные вещества 37
2.2 Методы исследования 40
2.2.1 Общие методы исследования стальника полевого корней извлечения и экстракта густого 40
2.2.2 Общие методы исследования суппозиториев 41
2.2.3 Методика качественного и количественного определения изофлавоноидов 42
2.2.4 Методика качественного и количественного определения каротиноидов 50
2.2.5 Биофармацевтические методы 56
2.2.5.1 Метод диализа через полупроницаемую мембрану 56
2.2.5.2 Определение биодоступности каротиноидов 56
2.3 Фармакологические методы исследования суппозиториев 57
2.3.1 Методы определения безопасности применения 57
2.3.1.1 Метод оценки раздражающего действия суппозиторной массы 57
2.3.1.2 Метод изучения острой токсичности 59
2.3.2 Методы определения специфической активности суппозиториев 60
2.3.2.1 Моделирование отека лапы у крыс 60
2.3.2.2 Моделирование термического ожога кожи морских свинок 61
2.3.2.3 Определение времени капиллярного кровотечения 61
Глава 3 Разработка технологии, показателей и норм качества стальника полевого корней экстракта густого и суппозиториев на его основе 63
3.1. Товароведческая характеристика корней стальника полевого 63
3.2 Определение основных параметров экстракции 65
3.2.1. Выбор экстрагента 65
3.2.2. Определение оптимальной степени измельчения стальника полевого корней 68
3.2.3. Определение оптимально времени настаивания 69
3.3 Определение технологических параметров стальника полевого корней и обоснование выбора метода экстрагирования 70
3.3.1 Определение насыпной массы, коэффициента наполнения сухого и набухшего сырья и коэффициента вытеснения 70
3.3.2 Определение коэффициента поглощения сырья, коэффициента образования внутреннего сока и коэффициента увеличения объема при растворении экстрактивных веществ 70
3.3.3 Расчеты эффективности процесса экстрагирования 71
3.3.4 Реализация различных способов экстрагирования 73
3.5 Получение густого экстракта стальника полевого корней 78
3.6 Разработка технологии, показателей и норм качества суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым 81
3.6.1 Выбор вспомогательных веществ и основообразующей композиции...81
3.6.2 Разработка технологии суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым 86
3.6.3 Разработка показателей и норм качества суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым 92
Выводы 94
Глава 4 Разработка технологии, показателей и норм качества суппозиториев, содержащих активные компоненты облепихи крушиновидной плодов и стальника полевого корней 96
4.1 Экстракция липофильных компонентов плодов облепихи крушиновидной суппозиторной основой 96
4.1.1 Товароведческая характеристика плодов облепихи крушиновидной...96
4.1.2 Выбор экстрагента 97
4.1.3 Определение кратности экстракции 99
4.2 Получение комбинированных суппозиториев из экстрактов облепихи крушиновидной плодов и стальника полевого корней 103
4.3 Разработка показателей и норм качества суппозиториев, содержащих активные компоненты стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов 115
4.4 Разработка двухслойных суппозиториев с активными компонентами стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов 117
Выводы 120
Глава 5 Фармакологические исследования комбинированных суппозиториев с активными компонентами стальника полевого и облепихи крушиновидной 122
5.1 Определение раздражающей активности суппозиторной массы 122
5.1.1 Раздражающая активность in situ на хорион-аллантоисной оболочке.. 122
5.1.2 Раздражающая активность in vivo на переднем сегменте глаза морских свинок 123
5.1.3 Определение острой токсичности суппозиторной массы 125
5.1.3.1 Оценка выживаемости мышей 125
5.1.3.2 Расчет среднесмертельной дозы 126
5.2 Изучение специфической активности комбинированных суппозиториев с экстрактами стальника полевого и облепихи крушиновидной 127
5.2.1 Изучение противовоспалительного действия суппозиториев 127
5.2.2 Оценка регенеративной активности суппозиториев 130
5.2.3 Определение времени капиллярного кровотечения 132
Выводы 134
Общие выводы 135
Список литературы 137
Приложения 154
- Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides L.) семейство Лоховые (Elaeagnaceae)
- Методика качественного и количественного определения каротиноидов
- Разработка технологии суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым
- Получение комбинированных суппозиториев из экстрактов облепихи крушиновидной плодов и стальника полевого корней
Введение к работе
Одной из проблем медицины является лечение длительно текущих заболеваний, часто сопровождающихся рядом осложнений, приводящих к необходимости хирургического вмешательства. К таким заболеваниям относится геморрой - одно из самых распространенных колопроктологических заболеваний, которым страдают в среднем 120 человек из 1000, а его доля в общей структуре патологии прямой кишки составляет почти 40%[19,110]. Геморрой — патологическое состояние кавернозных сплетений прямой кишки, сопровождающееся застоем крови [30].
К наиболее часто применяемым компонентам местных антигеммороидальных средств относятся глюкокортикостероиды (гидрокортизон), местные анестетики (анестезин, лидокаин), М-холинолитики (экстракт красавки), венотоники и репаранты (масло облепиховое, троксерутин, настойка стальника) [20]. Препараты из лекарственного растительного сырья занимают важное место, так как комплекс биологически активных веществ, входящий в их состав, обеспечивают широту терапевтического действия (противовоспалительное, противомикробное, антиоксидантное, репаративное) [41].
В настоящее время в медицине для лечения геморроя применяют отвар корней и настойку стальника (1:5 на 70% спирте этиловом) [97]. Препараты уменьшают проницаемость и ломкость капилляров, оказывают противовоспалительное и кровоостанавливающее действие, усиливают перистальтику кишечника, повышают его тонус, облегчают акт дефекации, увеличивают диурез, уменьшают боли и уплотняют геморроидальные узлы. При этом существенно не влияют на время свертывания крови и не действуют на мускулатуру матки [84].
Однако существующие препараты стальника полевого имеют ряд недостатков. Отвар не подвергается стандартизации и имеет незначительный срок годности (до трех суток). Настойка неудобна в применении, так как требует разбавления водой (ввиду содержания спирта высокой концентрации), имеет неприятный вкус и запах [57]. Поэтому наиболее целесообразным способом для эффективного использования действующих веществ стальника полевого, возможно, является введение их в состав суппозиториев, чем достигается значительное повышение биодоступности, легкость дозирования, удобство и простота применения, а так же отсутствие необходимости в коррегировании вкуса и запаха [22].
В терапии геморроя также широко используют препараты облепихи крушиновидной - масло в виде микроклизм и ректальных суппозиториев («Облепихол-ЛХ», суппозитории с облепиховым маслом), которые стимулируют процессы заживления слизистых, проявляют антиоксидантную и цитопротекторную активность[58, 59].
Наиболее распространенной лекарственной формой антигеморроидальных препаратов являются суппозитории [118]. Технология суппозиториев с веществами растительного происхождения предполагает извлечение биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья растворителями различной полярности. При этом гидрофильные соединения экстрагируют водно-спиртовыми смесями и вводят в суппозиторную основу в виде густых или сухих экстрактов [53,
147]. Для извлечения липофильных веществ используют растительные и минеральные масла, неполярные органические растворители и сжиженные газы [62]. Но в извлечение переходит не весь комплекс биологически активных веществ, а только группа веществ определенной полярности.
Применение сжиженных газов и летучих органических растворителей связано со значительными сложностями аппаратурного оформления процесса экстракции, а высокая токсичность последних требует их полного удаления из полученных извлечений. Введение в суппозиторную массу масляных экстрактов, в количествах, обеспечивающих необходимый терапевтический эффект, затруднено, так как при этом ухудшаются структурно-механические свойства массы [63]. Так, в настоящее время масло облепиховое получают двумя способами: экстрагированием подсолнечным маслом либо экстрагирование хлористым метиленом с последующим удалением экстрагента. В связи с этим перспективной является разработка новых способов получения концентрированных извлечений из лекарственного растительного сырья с целью создания препаратов в форме суппозиториев, в частности экстракция непосредственно суппозиторной основой [145] .
Таким образом, проблема поиска новых, отечественных, эффективных комплексных средств для лечения геморроя является актуальной. Перспективным направлением является комбинация ангиопротекторов и репарантов, в частности активных компонентов стальника полевого (комплекс биологически активных веществ обеспечивает капилляроукрепляющее действие) и облепихи крушиновидной (комплекс биологически активных веществ обладает репаративным действием), с целью получения препаратов в форме суппозиториев.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка технологии, состава, а также стандартизация комбинированных и двухслойных суппозиториев, содержащих биологически активные вещества стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов.
Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Изучить факторы, влияющие на процесс экстракции стальника полевого корней. Выбрать оптимальный метод экстрагирования данного вида сырья. Разработать технологию и нормы качества стальника полевого корней экстракта густого;
Разработать состав и технологию суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым на основании технологических и биофармацевтических исследований. Провести стандартизацию полученных суппозиториев;
Изучить возможность использования суппозиторных основ для экстракции липофильных компонентов облепихи крушиновидной плодов. Разработать технологию экстракции суппозиторной основой облепихи крушиновидной плодов новым методом - репрессованием. Провести технологические исследования по получению суппозиториев с липофильным извлечением облепихи крушиновидной плодов;
Разработать оптимальный состав комбинированных суппозиториев, содержащих биологически активные вещества стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов. Провести биофармацевтические исследования разрабатываемой лекарственной формы в опытах in vitro. Провести оценку качества и исследовать стабильность комбинированных суппозиториев в процессе длительного хранения;
Провести технологические исследования по возможности создания двухслойных суппозиториев, содержащих активные компоненты стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов;
Определить безопасность разработанных лекарственных форм: установить раздражающую активность суппозиториев методом биологического тестирования in situ и in vivo, провести исследования острой и хронической токсичности;
Провести фармакологические исследования разработанных суппозиториев: изучить их капилляроукрепляющее (местное и резорбтивное), регенеративное, противоотечное (местное и резорбтивное) действие;
Разработать проект нормативной документации на полученные комбинированные суппозитории.
Научная новизна
Научная новизна исследования заключается в следующем: - решена актуальная для фармацевтической технологии проблема создания комбинированных суппозиториев, сочетающих в себе липофильные (извлечение облепихи крушиновидной плодов) и гидрофильные (стальника полевого корней экстракт густой) компоненты природного происхождения, за счет образования твердых эмульсионных композиций; -предложено сочетание в одной лекарственной форме средств для лечения геморроя, обладающих как местным и резорбтивным ангиопротекторным, так и репаративным действием; показана возможность и технологически решена задача использования суппозиторных основ в качестве экстрагентов облепихи крушиновидной плодов - с целью получения извлечения, обогащенного биологически активными веществами, которое может являться как самостоятельным лекарственным препаратом, так и служить основой для получения комбинированных суппозиториев.
Практическая значимость
Изучены факторы, влияющие на процесс экстракции биологически активных веществ из стальника полевого корней, что позволило выбрать оптимальный метод экстрагирования для данного вида сырья и получить густой экстракт методом реперколяции в батарее из трех перколяторов, при соотношение сырье: экстрагент (1:5). На основании комплекса проведенных технологических, биофармацевтических исследований разработаны состав, технология и показатели качества для суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым, что позволяет расширить ассортимент антигеммороидальных лекарственных средств. На основании изучения различных факторов, влияющих на процесс извлечения биологически активных веществ из облепихи крушиновидной плодов твердыми липофильными суппозиторными основами, разработана технология получения указанного извлечения методом репрессования, что позволяет обеспечить высокую эффективность экстракции и получить суппозиторную основу с заданным содержанием биологически активных веществ и хорошими технологическими свойствами.
Разработан оптимальный состав и технология комбинированных суппозиториев, содержащие активные компоненты стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов. На основании результатов исследований разработаны двухслойные суппозитории с разделением активных компонентов стальника полевого корней (внутренний слой) и облепихи крушиновидной плодов (внешний слой), что позволяет расширить ассортимент лекарственных форм антигеммороидальных лекарственных средств.
Внедрение результатов исследования в практику На основании проведенных исследований разработаны ТУ и ТИ, предложен проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на лекарственный препарат «суппозитории с экстрактом стальника и маслом облепихи», получен акт апробации от ООО «Бивитекс» г.Нальчик. Акт внедрения от 16.04.10г.
Основные положения, выносимые на защиту: защиту выносятся
Результаты исследований по выбору экстрагента и определению основных параметров экстракции для стальника полевого корней - при получении экстракта густого. Обоснование состава, технологии и стандартизации суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым.
Результаты исследования процесса экстрагирования облепихи крушиновидной плодов суппозиторными основами.
Обоснование состава, технологии и стандартизации комбинированных суппозиториев с активными компонентами стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов на эмульсионной основе.
Обоснование и разработка состава, технологии и стандартизации двухслойных суппозиториев с активными компонентами стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов.
5. Результаты исследования противовоспалительной, ранозаживляющеи и капилляроукрепляющеи активности суппозиториев с активными компонентами стальника полевого корней и облепихи крушиновидной плодов на эмульсионной основе.
Основные результаты диссертационной работы доложены на:
64-ой и 65-ей региональных конференциях по фармации «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, январь 2009, 2010г.),
Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, октябрь 2009 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), одной главы, посвященной материалам и методам исследований, трех глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 161 источник, 14 из них на иностранных языках.
Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides L.) семейство Лоховые (Elaeagnaceae)
Геморрой представляет собой расширение вен геморроидального сплетения, часто осложняемое воспалением, тромбозами, кровотечением. Работами Л.Л. Капуллера, В.Л. Ривкина (1976); И.Г. Дацун, Е.П. Мельман (1986); Л. Шафик, М. Мохи-эль-Дин (1995); F.Stelzner (1963), W.Thompson (1976); P. Naas и соавт. (1984) установлено, что в основе развития геморроя лежит патология кавернозных образований подслизистого слоя дистальной части прямой кишки, заложенных в процессе нормального эмбриогенеза. Под действием неблагоприятных факторов происходит увеличение размеров геморроидальных узлов, их смещение в дистальном направлении и в конечном итоге выпадение из анального канала. Под влиянием постоянного застоя крови в венозных узлах расстраивается кровообращение и питание слизистой оболочки, она истончается и находится в состоянии хронического воспаления. Самые незначительные ее повреждения способствуют кровотечению из вен, а также появлению долго не заживающих трещин выходного отдела прямой кишки [133].
Эти нарушения происходят в группах высокого риска, к которым относятся люди, занимающиеся тяжелым физическим трудом, страдающие запорами, сидячих профессий, а также женщины в последнем триместре беременности [30].
По клиническому течению геморрой подразделяется на хронический и острый, по локализации на наружный и внутренний. Для геморроя традиционно характерны два основных симптома - кровотечение (51%) и выпадение узлов из анального канала (37%). При этом заболевании также отмечаются такие симптомы, как анальный зуд (9%), чувство дискомфорта в анальном канале (5%), выделения слизи (2%)[135] .
Лекарственная терапия широко применяется в составе курсового консервативного лечения нетяжелого и средней тяжести геморроя, а также нередко оказывается методом выбора неотложной помощи при тяжелом, осложненном геморрое любой локализации при беременности или недопустимости оперативного лечения по другим причинам. Применяемая для лечения геморроя фармакотерапия (местная и системная) должна быть направлена на быстрое и эффективное обезболивание аноректальной зоны; ограничение воспаления и отека пораженных тканей; противодействие микро и макротромбозу сосудов, а также, по мере возможности, рассасывание уже возникших тромбов; расслабление внутреннего сфинктера прямой кишки, уменьшение моторики кишечника и размягчение каловых мае; восстановление нормальной резистентности венозных и лимфатических сосудов, нормализация микроциркуляции в зоне поражения [119]. Основой общего лечения служит применение флеботропных лекарственных средств. Среди них следует отметить рецептурные лекарственные средства, содержащие диосмин или его комбинацию с гесперидином - «Флебодиа» (таб., Франция), «Вазокет» (таб., Германия), «Венорус» (таб., Россия), «Детралекс» (таб., Франция), которые уменьшают венозный застой, улучшают микроциркуляцию [96,109]. Среди безрецептурных ангиопротекторов и венотоников наиболее широко применяются троксерутин («Троксевазин» капе, гель, Болгария; «Гинкор форт» капе, Франция), эсцин («Веноплант, таб., Германия; «Эскузан» таб., раствор для приема внутрь, Германия, «Венитан», гель, Словения) и настойка стальника (Украина, Россия). Так же для улучшения микроциркуляции используют антикоагулянт прямого действия — гепарин («Гепатромбин Г», супп., мазь, Россия; «Гепариновая мазь», мазь, Россия). При кровоточащем геморрое используют «Прокто-гливенол» (супп., крем, ) и альгинат натрия -«Натальсид» (супп., Россия) [123] .
Особую трудность в консервативном лечении геморроя составляют те больные, у которых геморрой сочетается с заболеваниями аноректальной области: криптитом, проктитом, анальной трещиной, парапроктитом, так как применение только ангиопротекторов в данном случае не приводит к выздоровлению. Данное обстоятельство обуславливает необходимость комбинации ангиопротекторов с репарантами — препаратами, содержащими масло печени акулы («Релиф», «Релиф Адванс», супп., мазь, США; «Релиф ультра», супп., США), масло плодов облепихи («Масло облепиховое» супп., Россия) [133]. Так же при трещинах, экземе, проктитах используют «Проктозан» (супп., мазь, Германия), «Анузол» (супп., Россия), «Простеризан форте» (супп., мазь, Германия) [47,51, 54].
Контент - анализ ассортимента лекарственных препаратов для лечения геморроя, представленных на фармацевтическом рынке России, показал, что при лечении данной патологии используют различные лекарственные формы - суппозитории (40%), мази и гели (9%), таблетки (22%), капсулы (6%), порошки (5%), масла (6%), капли (5%), суспензии и растворы (5%), а так же аэрозоли (2%) [29,118]. Из них для перорального применения используется 37% наименований, а 63% для ректального [96]. Наиболее распространенной лекарственной формой антигеморроидальных препаратов являются суппозитории [109]. Несмотря на то, что в большинстве европейских стран ассортимент ректальных лекарственных форм увеличивается, на национальном фармацевтическом производстве суппозитории изготавливаются в весьма ограниченном количестве. 20% - это доля препаратов российского производства, 68% - зарубежного, 12% - препараты, производимые как отечественными, так и зарубежными компаниями [41, 123]. Таким образом, данные контент - анализа лекарственных препаратов для лечения геморроя, представленных на фармацевтическом рынке России, свидетельствуют о необходимости разработки новых эффективных составов для лечения данной патологии. Перспективным направлением является комбинация ангиопротекторов и репарантов, например, стальника полевого и масла облепихи крушиновидной, с целью получения препаратов в форме суппозиториев.
Методика качественного и количественного определения каротиноидов
Точностью аналитических методик называется степень близости экспериментальных результатов к истинному или опорному значению во всей области измерений. Точность складывается из случайных составляющих и общей систематической погрешности. Однако главным фактором, определяющим точность, является значение систематической погрешности. Для тестирования методики на точность готовили модельный препарат с максимально возможным содержанием изофлавоноидов. Далее модель разводили спиртом этиловым 96%, получая смеси с тремя уровнями концентрации 1:2, 1:1, 1:0,5. При этом содержание изофлавоноидов принимали за опорное значение. Далее проводили все аналитические процедуры, определяли содержание компонента, вычисляли открываемость (R) по отношению к расчетным значениям, по формуле: Таким образом, проведённая валидационная оценка предлагаемой методики определения изофлавоноидов в суппозиториях, позволяет сделать заключение о том, что данная методика не отягощена систематической ошибкой, является правильной, точной.
Методика качественного и количественного определения каротиноидов в сырье (облепихи крушиновидной плодов свежих) в соответствии с ВФС42-22-7. Методика качественного и количественного определения каротиноидов и содержания масла в шроте облепихи крушиновидной плодов [75,125] Качественной характеристикой служит характерный максимум спектра поглощения анализируемого раствора при длине волны 450 нм. Для анализа использовали сырье, измельченное до размера частиц проходящих сквозь сито с диаметром 1 мм. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100мл с притертой пробкой. С помощью пипетки наливали 25мл гексана. Экстрагировали при периодическом перемешивании в течение 1,5ч. Экстракт фильтровали через бумажный фильтр. 10мл экстракта помещали в предварительно высушенную и взвешенную выпарительную чашку, упаривали на водяной бане и высушивали в сушильном шкафу при 100-105С в течение 30 мин. Чашку охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Содержание масла в сырье (в %) рассчитывали по формуле: А — навеска абсолютно сухого сырья, г. Для определения содержания суммы каротиноидов 0,2 мл гексанового экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 25мл. Доводили объем до метки тем же растворителем. Определяли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 450нм в кюветах с толщиной слоя 1 Омм. В качестве раствора сравнения использовали гексан. Параллельно определяли оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовление которого проводили в соответствии с ФС 42-1730-86 «Масло облепиховое». Содержание суммы каротиноидов (в пересчете на Р-каротин) в миллиграмм-процентах рассчитывали по формуле (таблица 5): Di-оптическая плотность исследуемого раствора; Do-оптическая плотность раствора стандартного образца дихромата калия; 0,00208-количество р-каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия. Методика количественного определения каротиноидов в облепихи крушиновидной плодов извлечении липофильном Определение проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 450 нм. Навеску около 2 г суппозиторной основы, обогащенной компонентами плодов облепихи крушиновидной, измельчали и помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 30 мл гексана, растворяли при перемешивании и доводили объем до метки гексаном. После отстаивания 5мл прозрачного верхнего слоя переносили в мерную колбу вместимостью 25мл и доводили объем до метки гексаном. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ 56 при длине волны 450 нм. Содержание суммы каротиноидов (в пересчете на р-каротин) в миллиграмм-процентах рассчитывали по формуле: Di-оптическая плотность исследуемого раствора; Do-оптическая плотность раствора стандартного образца дихромата калия; 0,00208-количество Р-каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия. Методика качественного и количественного определения каротиноидов в суппозиториях Качественной характеристикой служил характерный спектр поглощения испытуемого раствора с максимумом при длине волны 450 нм. 1 суппозиторий измельчали и помещали в мерную колбу на 50 мл, прибавляли 30 мл гексана, растворяли при перемешивании и доводили объем до метки гексаном. После отстаивания 5мл прозрачного верхнего слоя переносили в мерную колбу вместимостью 25мл и доводили объем до метки гексаном. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ 56 при длине волны 450 нм. Содержание суммы каротиноидов (в пересчете на (3-каротин) в миллиграмм-процентах рассчитывают по формуле: (2.7), где Di-оптическая плотность исследуемого раствора; Do-оптическая плотность раствора стандартного образца дихромата калия; 0,00208-количество Р-каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия. Валидационную оценку методики также проводили по показателям линейность, прецизионность, правильность (точность). Определение линейности методики Один предварительно измельчённый суппозиторий, растворяли в 25 мл гексана в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивали.
Разработка технологии суппозиториев со стальника полевого корней экстрактом густым
Работа in situ выполнялась на 12 куриных эмбрионах белых кур породы Leggron возрастом 9-10 суток, содержащихся в течение 7 дней в термостате t 37,8 С, при постоянной относительной влажности воздуха 62,5%.
Опыты in vivo проводились на 6 морских свинках, массой 350-400г, содержащихся на стандартном режиме вивария: температура окружающего воздуха 22±2 С, 12-ти часовая синхронизированная смена светового периода, комбинированный корм и воду животные получали ad libitum.
Оценку раздражающего действия суппозиторной массы проводили тестом на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона, НЕТ - САМ test. Вещество тестировали в 12 повторностях (6 - опыт, 6-контроль). По результатам наблюдения определяли, к какому классу веществ по степени раздражения относится суппозиторная масса, и может ли быть она допущена к экспериментам на животных без повреждающего воздействия на слизистые оболочки млекопитающих. Критерии оценки раздражающего действия представлены в таблице (таблица 2.5).
Результаты эксперимента наблюдали с помощью бинокулярного микроскопа и фиксировали при использовании цифрового фото на основе компьютерной программы Intel(R) Play(tm) QX3(tm) Computer Microscope.
Испытания на животных проводили по схеме, используемой в настоящее время в Германии (Spielmann и соавт., 1996). Суппозитории испытывали на слизистой оболочке глаза морских свинок, нанося на передний сегмент глаза, после чего делали окончательное заключение. Индекс раздражающего действия оценивали интегрально: суммировали степень отека и покраснения (гиперемии). Результаты раздражения конъюнктивы млекопитающих регистрировали в баллах по 5-бальной шкале, согласно рекомендациям П. Михайлова (1985 г.) [56]. Критерии оценки представлены в таблице 2.6
Препараты, вызывающие реакцию с индексом 1-2, являются слабыми раздражителями кожи и слизистой оболочки, препараты с индексом 3-5 -умеренными, а с индексом 6-8 - сильными [56]. Время оценки: 30 секунд, 2 минуты, 6 часов, 24 часа. Контролем в данном случае служил второй глаз животного.
Определение острой токсичности проводили по методу Кербера, описанному в официальном руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ под редакцией В.П.Фисенко. - Москва,- 2000г [112,116].
После нанесения суппозиторной массы на выстриженную поверхность спинки мышей в дозах 5000 мг/кг, 2500 мг/кг, 1250 мг/кг, оценивали состояние мышей. С учетом веса мыши (в среднем 20 г) мышь получала 100 мг массы (для дозы 5000 мг/кг), 50 мг (для дозы 2500 мг/кг), 25 мг (для дозы 1250 мг/кг). Критериями оценки острой токсичности служили картина интоксикации и выживаемость животных в течение 48 часов. Дальнейшее наблюдение проводили в течение 2х недель, причем в первый день после введения животные находились под непрерывным наблюдением. Для определения действия основы суппозиторной массы на кожное дыхание, теплообмен и резорбтивное действие на организм мышей, проводили параллельные исследования с использованием основы-плацебо в эквивалентном объеме. Проведено 4 серии экспериментов (3 серии на мышах - суппозиторная масса в разных дозах, 1 серия - плацебо). Рассчитывали острую токсичность, соблюдая рекомендации государственного фармакологического комитета по изучению общетоксического действия биологически активных веществ [31,68].
Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили интарплантарным введением 0,1мл 1% раствора каолина (ОАО «Фармацевтическая фабрика», г. С-Петербург, Россия) дорсовентрально в правую заднюю лапку крысы. Выраженность экссудативного воспаления оценивали онкометрически через Зч и через сутки после индукции воспаления каррагенином. Измеряли объем лапки в динамике механическим онкометром по А.С. Захаревскому .
Противовоспалительную эффективность исследуемых образцов суппозиториев рассчитывали по формуле: где: Р - процент угнетения воспаления, Vk - среднее увеличение объема отечной лапки в контроле, v0 — среднее увеличение объема отечной лапки у леченых животных. Животные были разделены на 5 групп: 1 группа (контроль) - животные с моделированным отеком, не получившие лечения — 6 крыс; 2 группа (опыт) - животные с моделированным отеком, получившие исследуемую суппозиторную массу местно- 6 крыс; 3 группа (опыт) - животные с моделированным отеком, получившие исследуемую суппозиторную массу per rectum (резорбтивно)- 6 крыс;; Все группы с профилактической целью получали вышеуказанные вещества в течение 2 недель. После чего проводилась скарификация кожи (при местном применении в месте нанесения препаратов). При ректальном применении место скарификации обрабатывали аналогично с животными с местным применением препаратов. Самопроизвольно выступающая кровь снималась каждые 30 секунд фильтровальной бумагой. После скарификации замерялось время до остановки капиллярного кровотечения [74,138].
Для этого на место капиллярного кровотечения накладывался кусок фильтровальной бумаги через равные промежутки времени: 1 раз в 30 сек до полной остановки капиллярного кровотечения. Промежуток времени от момента появления первой капли крови до прекращения окрашивания фильтровальной бумаги обозначается как продолжительность кровотечения [74].
Получение комбинированных суппозиториев из экстрактов облепихи крушиновидной плодов и стальника полевого корней
Реактор (смеситель) для приготовления суппозиторной массы перед подачей ингредиентов проверяют на исправность, проверяют на "холостом" ходу работу мешалки, исправность контрольно-измерительных приборов. Реактор должен быть изготовлен из нержавеющей стали или иметь эмалированное покрытие.
В реактор вручную подают облепихи крушиновидной плодов извлечение из емкости для взвешивания, установленной на весах. Мешалка в реакторе при этом должна быть включена. Плавление проводят при включенном электрообогреве реактора, затем подают ланолин безводный. Периодически производят перемешивание смеси со скоростью 40-50 оборотов в минуту, контролируя при этом температуру. Не допускается превышение температуры готовой смеси выше +45С. Процесс приготовления заканчивается при полном расплавлении всех компонентов. Затем расплавленную основу фильтруют через колатуру с двойным слоем марли. В смеситель вручную подают стальника полевого корней экстракт густой из емкости для взвешивания, установленной на весах. Мешалка в смесителе при этом должна быть включена. Нагрев проводят при включенном электрообогреве реактора, затем подают глицерин и воду очищенную. Периодически производят перемешивание смеси со скоростью 40 - 50 оборотов в минуту, контролируя при этом температуру. Не допускается превышение температуры готовой смеси выше +45С.
Из реактора отбирают примерно 1/4 - 1/3 часть основы которую вносят при постоянном перемешивании в смеситель, перемешивание продолжают еще 10-15 минут, после чего смесь возвращают в реактор.
Основу в реакторе выдерживают при температуре +35 +45С. Перемешивание продолжают 20 - 30 минут. Затем полученную суппозиторную массу анализируют на количественное содержание изофлавоноидов и каротиноидов; и передают на микробиологический анализ. При получении положительного результата анализа суппозиторную массу из реактора передают в сборник готовой продукции на карантинное хранение.
Часть полученной суппозиторной массы может сразу использоваться для выливания суппозиториев, другая часть или вся масса охлаждается при постоянном перемешивании до затвердевания. Формование суппозиториев проводят методом выливания. Для получения суппозиториев используют формы объемом 2 см3, состоящие из разъемных пластин имеющих по 30 гнезд из полистирола или по 300 металлических гнезд. Формы перед разливом суппозиторной массы хорошо промывают и сушат. После охлаждения форм до температуры +3 +5 С. Подготовленные формы заполняют суппозиторной массой, температура которой перед разливом не выше +28 ±2С. Залитые формы ставят для застывания на лоток на 2 - 3 минуты, затем пластмассовым ножом снимают с поверхности форм лишний слой массы. После чего формы помещают в морозильную камеру на 20 минут до полного формирования суппозиториев. Излишки массы собирают и возвращают в производство. Расходный коэффициент рассчитывали по формуле:
Охлажденные формы переносят на стол для фасовки, освобождают зажим и разнимают элементы формы, освобождая суппозитории из ячеек. Готовые суппозитории подвергают бракеражу по внешнему виду, массе, количественному содержанию действующих веществ. Некондиционные суппозитории отправляют на формование повторно. Готовые суппозитории после положительного физико-химического и микробиологического анализа, подают на фасовку. В случае использования затвердевшей суппозиторной массы ее предварительно измельчают до небольших кусочков, пластин, стружки или крошки, расплавляют при постоянном перемешивании и выливают в формы, как указано выше, при температуре +28С.
Готовые суппозитории на столе для фасовки укладывают по 5 штук в контурную ячейковую упаковку по ОСТ 64-074-91 из пленки поливинилхлоридной марки ЭП-77С по ГОСТ 25250-88. Края упаковки термосклеивают с помощью портативного станка для изготовления и сварки ячейковой упаковки.
На контурную ячейковую упаковку наносят предприятие -изготовитель и его товарный знак, название препарата на русском языке, количество действующих веществ в одном суппозитории, серию и срок годности. На пачке и этикетке для групповой упаковки указывают предприятие-изготовитель и его товарный знак, название препарата на русском языке, количество действующего вещества в одном суппозитории, количество суппозиториев, условия хранения, регистрационный номер, номер серии, срок годности, штриховой код. На этикетке для групповой упаковки дополнительно указывают количество пачек и соответствующие манипуляционные знаки по ГОСТ 14192-96. Допускается наносить на пачку адреса и телефоны предприятия-изготовителя.
Две контурные упаковки суппозиториев вместе инструкцией по применению по РД 000019106-92 помещают в пачку по ОСТ 64-071-89 из картона для потребительской тары по ГОСТ 7933-89 или из картона хром-эрзац для складских коробок по ТУ 63.151-Н-83. Допускается текст инструкции по применению наносить на пачку. Пачки упаковывают в групповую или транспортную тару в соответствии с ГОСТ 17768-90, ОСТ 64-071-89 и РД 00001910-6-92.
