Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Желчегонные лекарственные средства растительного происхождения (обзор литературы)
1.1 Классификация гепатотропных средств . 10
1.2 Монокомпонентные фитотерапевтические средства . 17
1.3 Поликомпонентные фитотерапевтические средства 29
Заключение по главе 1 . 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ сбора 43
2.3 Технологические методы исследования . 53
2.3.1 Методы исследования технологических свойств растительного сырья 53
2.3.2 Методы исследования твердых лекарственных форм желчегонного сбора № 2 53
2.4 Методики оценки желчегонной активности 56
2.5 Методы статистической обработки результатов 58
ГЛАВА 3. Анализ факторов, определяющих предпочтения врачей при назначении желчегонных препаратов .. 62
Заключение по главе 3 68
ГЛАВА 4. Разработка методик качественного и количественного определения биологически активных веществ в желчегонном сборе № 2
4.1 Анализ качественного состава биологически активных веществ желчегонного сбора 69
4.2 Разработка методики количественного определения фенольных соединений в желчегонном сборе 74
4.3 Изучение валидационных характеристик методики 82
Заключение по главе 4 89
ГЛАВА 5. Технология получения экстракта желчегонного сбора
5.1 Определение технологических параметров растительного сырья... 90
5.2 Обоснование дисперсности сырья и параметров экстрагирования . 91
5.2.1 Размер частиц сырья, экстрагент и время контакта фаз . 91
5.2.2 Количество ступеней экстракции и соотношение фаз 100
Заключение по главе 5 . 108
ГЛАВА 6. Разработка состава и технологии получения таблеток желчегонного сбора
6.1 Обоснование базового состава таблетируемой массы . 109
6.2 Технология гранулирования и режим таблетирования . 118
6.3 Оптимизация биофармацевтических показателей таблеток . 125
6.4 Изучение биологической доступности таблеток желчегонного сбора в условиях «in vivo» 129
6.5 Разработка параметров качества таблеток желчегонного сбора 134
Заключение по главе 6 141
Обсуждение результатов . 142
Выводы . 147
Список литературы . 148
- Монокомпонентные фитотерапевтические средства
- Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ сбора
- Разработка методики количественного определения фенольных соединений в желчегонном сборе
- Размер частиц сырья, экстрагент и время контакта фаз
Введение к работе
Актуальность темы. По данным статистики пятое место в структуре общей смертности населения РФ занимают заболевания желудочно-кишечного тракта, в ряду которых доминируют патологии печени и желчевыводящих путей: от 26,6 до 45,5 человек на 1000 населения (Белобородова Э.И. и соавт., 2009).
Особенности этиологии, патофизиологического механизма и симптоматических проявлений болезней печени и желчевыводящих путей диктуют необходимость длительного применения эффективных и безопасных лекарственных средств. К такого рода средствам можно отнести многокомпонентные растительные композиции или сборы, обладающие широким спектром действия, отсутствием, как правило, нежелательных побочных реакций, относительной простотой производства, низкой стоимостью при достаточно высоком уровне спроса.
Однако, наряду с большим количеством положительных качеств, сборы обладают рядом недостатков. Это неполное использование биологически активных веществ (БАВ) растительного сырья, низкий уровень стандартизации и стабильности, неточность дозирования и неудобство применения (Киселева Т.Л. и соавт., 2000). Термическое воздействие при получении водного извлечения может сопровождаться физико-химическими превращениями, снижающими фармакологическую активность биологически активных компонентов растений.
Перспективным подходом в решении этой проблемы является перевод желчегонных сборов в аналогичные по составу экстракционные препараты (экстракты жидкий, густой и сухой), предполагающий максимальное извлечение действующих веществ и создание на их основе твердых лекарственных форм. Использование в качестве исходных композиций официнальных прописей позволяет сократить объем проводимых исследований и сосредоточить усилия на обеспечении максимальной фармакотерапевтической активности, стабильности продукта и эффективности предлагаемой технологии.
Это определяет актуальность и целесообразность разработки рациональной лекарственной формы на основе официнального фитосбора «Желчегонный сбор № 2» (ЖС-2).
Цель исследования: разработка технологии получения рациональной лекарственной формы желчегонного сбора №2 .
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать технологию получения экстракта ЖС-2 с учетом факторов, влияющих на процесс извлечения БАВ и технологических параметров сырья;
- обосновать оптимальный состав и технологию получения твердой лекарственной формы (таблетки) на основе экстракта ЖС-2 густого;
- разработать методики качественного и количественного определения основных действующих веществ ЖС-2, экстракта густого и таблеток на его основе, определить параметры их качества;
- провести сравнительные биофармацевтические исследования водного извлечения, полученного по стандартной технологии ГФ ХI, экстракта густого и таблеток на основе ЖС-2;
- разработать лабораторный регламент и проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на предлагаемое средство (таблетки на основе экстракта ЖС-2 густого).
Научная новизна:
Впервые разработан способ получения экстракта густого на основе ЖС-2, отличающийся повышенным извлечением БАВ из лекарственного растительного сырья по сравнению с настоем, изготовленным по методике ГФ ХI.
Впервые предложены, теоретически и экспериментально обоснованы рациональный состав и оптимальная технология таблетированного лекарственного препарата ЖС-2. На основании изученных физико-химических и технологических характеристик субстанций, входящих в лекарственный препарат, определены режимы грануляции и таблетирования.
Научно обоснованы показатели качества, принцип сквозной стандартизации сбора, фитосубстанции и таблеток на основе ЖС-2 по содержанию гидроксикоричных кислот методом прямой спектрофотометрии.
Впервые проведены исследования по оценке желчегонной активности препаратов на основе ЖС-2 в опытах in vivo. Доказано преимущество предлагаемой лекарственной формы (таблетки) перед настоем, полученным по методике ГФ XI, по биофармацевтическим характеристикам.
Подана заявка на изобретение «Способ получения средства, обладающего желчегонным действием» (приоритетная справка № 2011126855 от 29.06.2011.)
Практическая значимость работы.
Разработан способ экстракции ЖС-2, отличающийся повышенным извлечением БАВ из лекарственного растительного сырья по сравнению с настоем, изготовленным по методике ГФ ХI.
На основании комплексных биофармацевтических исследований и технологических разработок предложены состав и технология таблеток на основе ЖС-2, отвечающих требованиям ГФХI и обладающих выраженной желчегонной активностью.
Разработаны технология получения таблеток на основе экстракта ЖС-2 густого, лабораторные регламенты на получение экстракта ЖС-2 густого и таблеток на его основе, составлены проекты нормативной документации (ФСП) на экстракт ЖС-2 густой и препарат (таблетки) на его основе.
Материалы диссертации апробированы в ГУ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Республики Саха (Якутия)», ОГУЗ «Центр по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области» (стандартизация препарата) и ООО «Биолит» г. Томск (технология производства) и внедрены в учебный процесс кафедр: фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, фармацевтической технологии ГБОУ ВПО СибГМУ и кафедр фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Кемеровская ГМА и Алтайский ГМУ.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической технологии СибГМУ в рамках комплексной темы «Изучение природных источников биологически активных веществ и получение на их основе новых лекарственных средств» (№ Государственной регистрации 0120.0602076).
Апробация работы
Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на 18й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (г. Томск, 2010 г.), Всероссийской научно-практической интернет-конференции «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (г. Курск, 2011 г.), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы развития фармацевтической науки и образования», посвященной
70-летию фармацевтического факультета Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск, 2011 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованный ВАК. Подана заявка на получение патента на изобретение «Способ получения средства, обладающего желчегонной активностью» (приоритетная справка № 2011126855 от 29.06.2011.)
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Обоснование целесообразности разработки твердой лекарственной формы (таблетки) на основе экстракта ЖС-2 густого.
2. Разработка технологии получения экстрактов жидкого и густого на основе ЖС-2;
3. Результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава вспомогательных веществ и рациональной технологии получения таблеток на основе экстракта ЖС-2 густого, показатели их качества;
4. Результаты экспериментальных исследований по разработке методики контроля сырья ЖС-2, фитосубстанции на его основе, стандартизации препарата, результаты аттестационных испытаний предложенной методики;
5. Результаты экспериментальных исследований желчегонной активности предлагаемого препарата;
6. Проекты нормативной документации на экстракт ЖС-2 густой и таблетки ЖС-2.
Структура и объем диссертации
Монокомпонентные фитотерапевтические средства
О.Г. Аносова, М.В. Колпакова и др. при анализе качества настоев и от-варов, изготовленных из 19 официнальных лекарственных растений, устано-вили, что более 50% действующих БАВ остается в шроте. В результате ими были сделаны выводы о целесообразности разработки других лекарственных форм, в которых растительное сырье используется с большей эффективно-стью и с меньшими потерями [140]. В целом, для настоев и отваров харак-терны незавершенность лекарственной формы (необходимость доведение до состояния, пригодного к употреблению), неполное извлечение БАВ из сырья, нестойкость при хранении, непостоянство состава, угроза микробного обсе-менения, трудности в индивидуальном дозировании, отсутствие методов их стандартизации и контроля. Термическое воздействие при получении водно-го извлечения сопровождается физико-химическими превращениями, сни-жающими фармакологическую активность БАВ растений [9, 16, 118, 140, 144]. Для повышения точности дозирования в аптечную сеть поступает бри-кетированное сырье и сырье, измельченное и расфасованное в фильтр-пакеты. Как правило, масса одного круглого брикета или плиточной дольки составляет 7,5 и 8 г, измельченного сырья в фильтр-пакетах по 1,5 или 2 г. Для всех настоев и отваров, приготовленных из брикетированного сырья, ха-рактерны мутность и ускоренное выпадение осадка при хранении, что может быть связано с наличием пылевой фракции в ЛРС и изменением структуры материала под влиянием давления (брикеты). Значения рН настоев из ЛРС, расфасованного в фильтр-пакеты, сдвинуто в щелочную среду по сравнению с соответствующим показателем извлечений, изготовленных из нативного или брикетированного сырья. Это может быть связано с недостаточно полной экстракцией всех веществ, содержащихся в растении [15, 144]. Таким образом, несмотря на положительные стороны брикетов и фильтр-пакетов, настои и отвары, изготовленные на их основе характеризу-ются низкой стабильностью, невысокой эффективностью использования БАВ и неудовлетворительными органолептическими свойствами. Более рациональными лекарственными формами, обеспечивающими максимальное извлечение БАВ, являются экстракты: жидкие, густые и сухие. По данным Самылиной И.А., Блиновой О.А. и др. (2002), на долю галеновых препаратов приходится около 11,3% от общего числа лекарственных средств, зарегистрированных в РФ [118]. При этом имеющиеся фармакопейные статьи (ФС), как правило, описывают однокомпонентные настойки и экстракты (на-стойка цветков арники, листьев барбариса, экстракт кукурузных рыльцев). В Американской фармакопее 23-го издания (USP 23, 1995) содержатся всего 3 статьи на настойки из сырья растительного происхождения и 2 статьи на жидкие экстракты (с указанием способа их изготовления), в Британской фармакопее 1998 г. – 14 статей на настойки и 5 на жидкие экстракты, в Евро-пейской фармакопее (ЕР,1997) частные статьи на настойки и экстракты пол-ностью отсутствуют [99, 129]. Возможно это связано с тем, что данные ле-карственные формы являются недозированными, имеют непродолжительный срок годности, ограничения по применению в педиатрической практике и ди-стрибуции.
Густые экстракты, являющиеся препаратами промежуточной конси-стенции между жидкими и сухими экстрактами, получают путем частичного удаления экстрагента, которым, как правило, служит вода или водно-спиртовые растворы низкой концентрации [129]. Ввиду высокой вязкости и ограниченной стабильности густые экстракты не применяются в виде само-стоятельных лекарственных препаратов и используются, преимущественно, в качестве полупродуктов для других лекарственных форм – таблеток, гранул, сиропов. Согласно многочисленным данным литературы наиболее оптимальным вариантом экстрактов являются сухие экстракты. Количество их непрерывно растет, невзирая на относительную сложность их производства. К преимуще-ствам сухих экстрактов относят удобство применения, относительную устой-чивость при хранении, возможность более точного дозирования и способ-ность трансформации в различные лекарственные формы. К недостаткам – высокую гигроскопичность, большую энергозатратность и риски критиче-ского влияния технологического процесса их получения на сохранность БАВ [6, 9, 16, 58, 65]. При переработке ЛРС в качестве экстрагентов наиболее часто приме-няют воду очищенную и спирт этиловый различной концентрации (40-70%), который извлекает вещества как липофильного, так и гидрофильного харак-тера, замедляя гидролиз и уменьшая риск микробной обсемененности [6, 9, 65, 16, 125, 157, 38]. В последнее время в качестве экстрагентов широко при-меняют сжиженные газы, жирные масла, иногда с добавлением кислот, ще-лочей, глицерина, хлороформа [59, 159, 171]. Кроме того, практический ин-терес вызывает получение полиэкстрактов, путем последовательной обра-ботки сырья разными (в т.ч. разнополярными) экстрагентами [55, 79, 87, 149, 170]. Использование интенсивных методов экстракции – противоточного, циркуляционного, вихревого, вибрационного, импульсного (механического, гидравлического, электромагнитного), ультразвукового методов, кипящего экстрагента, замороженного сырья, извлечения с помощью шаровых мель-ниц, роторно-пульсационного аппарата, с использованием сатураций (рас-творов газов под давлением), повышает выход БАВ за сравнительно короткое время [90, 38, 107, 14, 95, 48, 35, 117, 146, 7, 166]. Однако интенсификация процесса извлечения БАВ из растительного сырья может вызывать измене-ния его химического состава, что в конечном итоге может отразиться на фармакологических свойствах препарата [57].
В процессе совершенствования технологии экстрактов путем их очист-ки от балластных веществ была создана относительно новая группа –новогаленовые препараты. Они содержат преимущественно нативный ком-плекс отдельных групп действующих веществ, максимально очищенных не только от балластных, но и от сопутствующих веществ. В 70-х годах XX века было доказано, что одни из выделенных из растений в чистом виде БАВ или несколько их очищенных фракций действуют совершенно иначе, чем галено-вые препараты, извлекающие практически все группы БАВ растения, причем в более или менее нативных соотношениях [61]. Новогаленовые препараты более устойчивы при хранении и по сравнению с галеновыми обладают по-стоянством действия на основе более строгой стандартизации и не вызывают побочных эффектов, обусловленных наличием балластных веществ [90]. Производство новогаленовых препаратов характеризуется индивидуальным подходом к получению отдельных продуктов или их групп.
Методы качественного и количественного определения биологически активных веществ сбора
Для хроматографического исследования фенольных соединений (фла-воноидов и фенолкарбоновых кислот) использовали извлечения, полученные из сырья последовательно 96%, 70% и 40% этанолом. Для их получения 1,0 г воздушно-сухого сырья заливали 100 мл этанола, кипятили на водяной бане с обратным холодильником 30 минут. Извлечения фильтровали в мерную кол-бу объемом 100 мл (раствор А). Для хроматографического исследования 10 мл раствора А сгущали до объема 2 мл и анализировали методами двумер-ной и одномерной хроматографии. Экстракты наносили на хроматограммы микропипеткой по 0,01-0,02 мл. На хроматограммах соединения обнаруживали до и после обработки различными реактивами в видимом и фильтрованном УФ-свете ртутно-кварцевой лампы при = 254, 365 нм облучателя хроматографического УФС 254/365 производства «Сорбполимер» г. Краснодар: а) флавоноиды: парами аммиака, 1%-ным спиртовым раствором алю-миния хлорида, 5%-ным спиртовым раствором щелочи, аммиачным раство-ром нитрата серебра, 3%-ным раствором железа окисного хлорида; б) фенолкарбоновые кислоты: парами аммиака, спиртовым раствором щелочи (6 г едкого кали, 25 мл воды, 45 мл 96%-ного этанола), раствором диазотированной сульфаниловой кислоты, 3%-ным спиртовым раствором железа окисного хлорида; в) углеводные компоненты на хроматограммах обнаруживали ани-линфталатом (0,93 г анилина, 1,66 г фталевой кислоты в 100 мл н. бутанола, насыщенного водой) с последующим высушиванием хроматограмм при 105С в течение 3- 5 минут. Все значения Rf анализируемых соединений являются средними вели-чинами 5-6 измерений. Количественное определение суммы флавоноидов проводили спектро-фотометрическим методом с использованием комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом.
Методика. Около 2,0 г (точная навеска) сбора, выбранного методом квартования из 10 грамм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл 60% этанола. Колбу присоединяют к обратному холо-дильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Горячее извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимо-стью 100 мл. Экстракцию указанным выше способом повторяют еще раз. Из-влечения фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу и после ох-лаждения доводят объем 60% спиртом до метки и перемешивают (раствор А). 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл (раствор Б) прибавляют 2 мл 5 %-ного раствора алюминия хлорида в 95% этиловом спирте, 2-3 капли разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95 % этанолом до метки, перемешивают и через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения исполь-зуют следующий раствор: 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вме-стимостью 50 мл, прибавляют 2-3 капли разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95 % этанолом до метки. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина и абсолютно сухой сбор в процентах (Х) вычисляют по формуле:
Аскорбиновая кислота. Количественное определение проводили мето-дом титрования аликвоты водного извлечения раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия [33].
Витамин К. Количественно витамин К определяли спектрофотометри-ческим методом, основанным на способности витамина К давать окрашен-ные комплексы с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом в щелочной среде: к 2,0 г сырья (т.н.) приливали 10 мл ацетона и оставляли на холоде на 1 сутки, пе-риодически взбалтывали. Через сутки содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр синяя полоса , ацетон удаляли под вакуумом, сухой оста-ток количественно переносили в мерную колбу объемом 10 мл 95% этиловым спиртом (раствор А). 5 мл раствора А помещали в мерную колбу на 25 мл и доводили 95% этанолом до метки (раствор Б). К 2 мл раствора Б добавляли 1 мл 1% спиртового р-ра гидроксида натрия и 0,3 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята, раствор доводили 95% этиловым спиртом до метки 10 мл. Оптическую плотность полученного раствора измеряли через 10 минут при длине волны 670 нм. Максимум поглощения определяли экспериментально по спектру продукта реакции в видимой области света. Параллельно определяли оп-тическую плотность стандартного образца В3 (метинона, 2-метил-1,4-нафтохинона), приготовленного аналогичным образом.
Содержание витамина К в процентах (Х) вычисляли по формуле: оптическая плотность испытуемого раствора; D ст – оптическая плот-ность раствора стандартно образца метинона; С ст – содержание стандартно-го образца метинона в 1 мл раствора; V1 – объем раствора в мл; V2 – объем аликвоты, взятой из раствора А в мл; V3 – объем раствора В в мл; m – масса сырья граммах; W – потеря в массе при высушивании сырья в %.
Содержание суммы водорастворимых полисахаридов определяли гра-виметрическим методом. Около 10 г (т.н.) помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 100 мл воды очищенной, колбу присоединяли к обратно-му холодильнику и кипятили при перемешивании на электрической плитке в течение 30 мин. Экстракцию водой повторяли еще четыре раза по 100 мл в течение 30 мин каждый раз. Водное извлечение центрифугировали с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 мин и декантировали в мерную колбу вместимостью 500 мл через пять слоев марли, вложенной в стеклянную во-ронку диаметром 66 мм, предварительно смоченную водой. Фильтр промыва-ли водой очищенной и доводили объем раствора до метки (раствор А).
25 мл раствора А помещали в центрифужную пробирку, прибавляли 75 мл 95% этанола, перемешивали, подогревали на водяной бане при темпера-туре 60С в течение 5 мин. Через 30 мин содержимое центрифугировали с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтровали под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПА через высу-шенный до постоянной массы при 105С стеклянный фильтр ПОР 16 диамет-ром 40 мм. Затем осадок количественно переносили на тот же фильтр и про-мывали 15 мл смеси 95% этанола и воды (3:1).
Разработка методики количественного определения фенольных соединений в желчегонном сборе
При стандартизации растительного сырья наиболее важным моментом является разработка показателя «количественное содержание действующих веществ», т.к. в последующем, по методике, разработанной для сырья, будет проводиться соответствующий контроль на всех стадиях производства экс-тракционного препарата. Это гарантирует качество и постоянство состава многокомпонентных суммарных препаратов [97]. Однако, не во всех норма-тивных документах (ФС и ВФС) на лекарственную форму «сборы», выпус-каемые в настоящее время в РФ, предусмотрен такой показатель. НД на жел-чегонные сборы и сырье, входящее в состав ЖС-2, по ГФ ХI и British Pharma-copoeia (2000) приведены в таблице 4.3 [177]. Необходимо отметить различные подходы отечественных авторов к стандартизации растительного сырья, входящего в состав ЖС-2. Так, для стандартизации цветков бессмертника песчаного предложены метод диффе-ренциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина (Смирнова Л.П. и соавт., 1998; Компанцева Е.В. и соавт., 2000) и ГСО изосалипурпозида (Куркина А.В. и соавт., 2008) [73, 101,137]. Количественное определение фе-нольных соединений в траве тысячелистника обыкновенного предлагается проводить методом ВЭЖХ (Бенетис Р. и соавт., 2008) [68].
Ранее для стандартизации ЖС-2 (Смирнова Л.П. и Первых Л.Н., 1999), была предложена методика количественного определения суммы флавонои-дов методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина [138]. Вместе с тем, авторами отмечены трудности при валидации предложенной методики. Результаты наших определений флавоноидов в ис-следуемом сборе по данной методике также свидетельствовали о наличии обозначенной проблемы. При сравнении максимумов поглощения различных стандартных образцов с максимумами поглощения алюминиевых комплексов сбора, последние меняются в пределах от 390 нм до 410 нм, поскольку в сбо-ре присутствует значительное количество флавоноидов, алюминиевые ком-плексы которых имеют разные максимумы поглощения: в гораздо более ко-ротковолновой части (370-380 нм) и существенно отличающийся длинновол-новый максимум у ряда соединений (высокометилированные флавоны мяты, флавононы бессмертника и мяты), что сопровождается существенной вариа-бельностью полученных результатов и, как следствие, ограничивает возмож-ности использования вышеуказанной методики для определения точного со-держания флавоноидов в желчегонном сборе.
В ходе эксперимента, для определения флавоноидов в ЖС-2, нами так-же была проведена работа по адаптации методики прямой спектрофотомет-рии в пересчете на изосалипурпозид, предложенная Куркиной А.В. и соавт. для определения суммы флавоноидов в цветках бессмертника [73]. Однако несоответствие максимумов поглощения ЖС-2 и РСО изосалипурпозида не позволило использовать данное вещество для стандартизации исследуемого сбора [74]. Для выбора группы БАВ, по которой можно объективно оценить каче-ство сбора, был проведен спектральный анализ извлечений на 40% спирте этиловом (1:50) из ЖС-2 и его отдельных ингредиентов. Полученные данные (рис. 4.5) свидетельствуют о том, что спектры поглощения исследуемых из-влечений не идентичны, но имеют схожий характер. Наиболее близкие мак-симумы поглощения зарегистрированы в области длин волн 290 нм и 327-330 нм, характерные для фенольных соединений: ГКК и флавоноидов [83]. Электронный спектр водно-спиртового извлечения ЖС-2 совпадает со спектрами РСО известных гидроксикоричных кислот (ГКК) (= 325-330). Учитывая, что большинство компонентов сбора содержат в своем составе хлорогеновую кислоту, мы сочли целесообразным оценивать качество ЖС-2 по содержанию ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту (рис. 4.6) [68, 126, 192, 195].
При разработке методики нами были определены оптимальные усло-вия для извлечения ГКК из ЖС-2. Оценка степени влияния дисперсности сы-рья на экстракцию показала нежелательность измельчения плодов кориандра, так как это приводило к извлечению из них жирных масел и появлению опалесценции, что исключало использование спектрофотометрии. Исходя из этого, для количественного определения предлагаем использовать сбор с ис-ходным измельчением компонентов (3-5 мм). При определении основных параметров экстракции установлено (таб-лица 4.4), что максимальное извлечение ГКК достигается при двукратной экстракции с использованием в качестве экстрагента 60% спирта этилового при соотношении сырье-экстрагент 1:50. Динамическое равновесие в режиме кипения в системе наступает через 30 минут. Методика количественного определения гидроксикоричных ки-слот в желчегонном сборе № 2. Около 2,0 г (точная навеска) сбора, выбран-ного методом квартования из 10 г, помещают в колбу со шлифтом вместимо-стью 250 мл, прибавляют 50 мл 60% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Горячее извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию указанным выше способом повто-ряют еще раз. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу и после охлаждения доводят объем до метки 60% этанолом и переме-шивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимо-стью 50 мл, доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки, пере-мешивают (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спек-трофотометре СФ-2000 при длине волны 327±3 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% раствор спирта эти-лового.
Размер частиц сырья, экстрагент и время контакта фаз
Аналогично анализируя уравнение (5.4), где В11=0,1210=1,2; В22= 0,0651 =0,065; В33=0,323=0,96, находим, что влияние на выход ГКК концентрации этанола в экстрагенте также является наиболее значимым и показывает, что с ее ростом увеличивается и выход целевого продукта. Одна-ко парное взаимодействие таких факторов, как увеличения концентрации этанола и времени экстракции, сопровождается уменьшением выхода ГКК. Возможно, это связано с уменьшением растворимости этой группы БАВ за счет перехода в раствор в более поздние сроки других, экстрагируемых из растительного сырья, компонентов, а также достижения динамического рав-новесия протекающих в системе процессов (диффузии, сорбции, десорбции). Размер частиц сырья оказывает самое незначительное влияние на вы-ход ГКК (Y2), также как и на процессе извлечения общей массы ЭВ. При этом знак «–», как в уравнении (5.3), так и в уравнении (5.4), показывает, что с увеличением размеров частиц сырья содержание ЭВ и ГКК (Y1 и Y2) уменьшается. В то же время продолжительность экстракции (Х3) и концен-трация этанола (Х1) оказывают примерно одинаковое воздействие на выход ГКК (Y2). Степень влияния отдельных изучаемых факторов почти в три раза больше эффектов их парных взаимодействий. Резюмируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что концентрация этанола в экстрагенте наиболее значимо влияет на процесс экстракции БАВ из ЖС-2. При этом значительную роль в достижении полноты извлечения, как ЭВ, так и ГКК, играет время экстракции. Размер частиц сырья (Х2) ока-зывает самое незначительное влияние и на выход ЭВ, и на извлечение ГКК.
Учитывая существенную роль ГКК в обеспечении желчегонного эф-фекта ЖС-2 и адекватность уравнения (5.4) реальному процессу, было реше-но провести крутое восхождение по градиенту факторов Х1 и Х3. Фактор Х2 мы стабилизировали на нулевом уровне, принимая во внимание его незначи-тельный вклад в увеличение выхода БАВ. При оценке шага движения по градиенту масштабный коэффициент со-ставил: 1/0,32 = 3,125. Составляющие градиента, не выводящие из области определения факторов, при этом имели значения Х1 = 3,12 и Х2 = 1, соот-ветственно. При округлении получили Х1=5 % и Х2 =3 часа. Оставаясь в области определения факторов, при расчете крутого вос-хождения, мы стартовали с основного уровня, в данном случае для Х1 с 50% (в границах 20 и 80%) и для Х3 с 9 часов (в границах 3 и 15 часов). Поставив контрольные опыты, получили значения экспериментального выхода, при-ближенные к теоретическим результатам, которые рассчитывали по уравне-нию (5.4). В таблице 5.5 представлены теоретические (расчетные, мыслен-ные) результаты и контрольные (реализованные) данные. Результаты даль-нейших мысленных опытов, как подтвердили экспериментальные данные, свидетельствует лишь о незначительном увеличении выхода ГКК (на 3,5%). При этом удлиняется процесс экстракции и извлекается большое количество сопутствующих веществ. Следовательно, оптимальными условиями для про-цесса экстракции ЖС-2, по данным результатов эксперимента с использова-нием приемов математического планирования, можно считать следующие условия: экстрагент – спирт этиловый в концентрации 60%, продолжитель-ность одного цикла – 12 часов, размер частиц сырья 1 мм. При этом, содер-жание ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту составляет – 1,99%.
Однако содержание ЭВ при использовании в качестве экстрагента 60% эти-лового спирта (опыт № 3) составляет 5,17 %, что на 24,7 % меньше соответ-ствующих значений при обработке сырья 40% этанолом (опыт № 7). Разница в содержании ГКК между опытами № 3 и 7 составляет 10 %, при тех же зна-чениях факторов Х2 (размер частиц) и Х3 (время контакта фаз), что определя-ет целесообразность применения экстрагента с более низкой концентрацией спирта этилового (40%).
Факт незначительного влияния размера частиц сырья на выход ЭВ и ГКК, а также отличия анатомо-морфологических характеристик его компо-нентов, побудили нас к проведению дополнительных исследований в данном направлении. В опытах использовали сырье отдельных компонентов сбора с различным размером частиц (0,5-1мм; 2-3 мм; 5-7мм). Определение экстра-гируемости БАВ проводили методом мацерации 40% этанолом в течение 24 часов (время, достаточное для достижения динамического равновесия в сис-теме). Результаты экспериментов были сопоставлены по группам с использо-ванием критерия Ньюмена-Кейлса, т.е. все групповые средние упорядочива-ли по возрастанию и сравнивали попарно, каждый раз вычисляя значение критерия (q). Q сравнивали с критическим (табличным) значением, которое, в свою очередь, зависит от уровня значимости (), числа степеней свободы (), и интервала «стягивающего» сравнения (l). Число степеней свободы опреде-лялось как разница между численностью всех групп (N) и количеством групп (m). Если табличное значение оказалось больше вычисленного, то различия между группами признавались статистически незначимыми. Результаты экс-периментов представлены в таблице 5.6. Полученные данные подтверждают правильность ранее сделанного вы-вода о незначительной степени влияния размера частиц на выход БАВ. При сравнении результатов опытов по экстракции листьев мяты и травы тысяче-листника, измельченных в одной группе до 0,5-1 мм и в другой группе до 2-3 мм, статистически значимых различий не выявлено, (q вычисленное q кри-тического значения) [27]. Величина ЭВ значимо уменьшалась лишь при пе-реработке сырья с размерами частиц 5-7 мм. Достоверное снижение содер-жания ГКК в извлечении также наблюдалось при увеличении размеров час-тиц сырья до 5-7 мм.
