Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Распространенность проктологических заболеваний. проблемы их лечения 12
1.2. Анализ номенклатуры отечественного рынка лекарственных форм для местного лечения проктологических заболеваний 14
1.3. Физико-химические свойства и биологическая роль анестезина 17
1.4. Методы идентификации и количественного определения анестезина 19
1.5. Физико-химические свойства и биологическая роль -каротина микробиологического 21
1.6. Методы идентификации и количественного определения -каротина микробиологического 25
1.7. Действие эфирных масел на организм человека 26
1.8. Результаты современных исследований по применению растений рода Monarda L. в научной медицине 29
1.9. Методы идентификации и количественного определения эфирных масел 32
Выводы 35
Экпериментальная часть 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Материалы исследования 36
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Физические и физико-химические методы 39
2.2.2. Валидация методики ГХ для определения подлинности и количественного содержания эфирного масла монарды дудчатой в суппозиториях 45
2.2.3. Биофармацевтические методы
2.2.4. Микробиологические методы 47
2.2.5. Фармакологические методы 49
2.3. Дизайн исследования 49
Глава 3. Технологические и биофармацевтические исследования по разработке состава и технологии суппозиториев с биологически активными веществами 52
3.1. Оценка качества эфирного масла монарды дудчатой 52
3.2. Скрининговые исследования антимикробных и противовоспалительных свойств эфирного масла монарды дудчатой 59
3.3. Разработка состава суппозиториев с биологически активными веществами 61
3.4 Разработка состава суппозиториев с биологически активными веществами в сочетании с местным анестетиком 71
3.5. Обоснование и разработка технологии производства суппозиториев «Монавитол» 76
3.5.1. Определение температурного режима ведения процесса получения суппозиториев «Монавитол» 76
3.5.2. Описание технологического процесса изготовления суппозиториев «Монавитол» 80
Выводы 92
Глава 4. Стандартизация и разработка норм качества суппозиториев с биологически активными веществами 93
4.1. Оценка качества суппозиториев «Монавитол» 93
4.2. Валидация методики ГХ определения подлинности и количественного содержания ЭМ монарды в препарате «Монавитол» 98
4.3. Изучение микробиологической чистоты суппозиториев. 107
4.4. Изучение стабильности суппозиториев в процессе хранения 108
Выводы 112 Заключение 113
Список сокращений 115
Список литературыq
- Физико-химические свойства и биологическая роль -каротина микробиологического
- Валидация методики ГХ для определения подлинности и количественного содержания эфирного масла монарды дудчатой в суппозиториях
- Разработка состава суппозиториев с биологически активными веществами
- Валидация методики ГХ определения подлинности и количественного содержания ЭМ монарды в препарате «Монавитол»
Физико-химические свойства и биологическая роль -каротина микробиологического
Контент-анализ официальных источников информации о зарегистрированных ЛС позволил выявить полное количество зарегистрированных препаратов, применяемых в качестве местных противовоспалительных ЛС для лечения прок-тологических заболеваний (за исключением производных 5-аминосалициловой кислоты и гормональных ЛС). Общий ассортимент зарегистрированных в России ЛС данной группы включает в себя 30 препаратов 24-х торговых наименований. Среди них доля отечественных ЛС составляет 79,2% (19 наименований), остальные 20,8% (5 наименований) – ЛС зарубежного производства [46, 102]. На рисунке 1 представлена структура ассортимента противоспалительных проктологиче-ских ЛС по видам лекарственных форм.
Как видно, в фармакотерапии проктологических заболеваний ведущая роль принадлежит суппозиториям. Доля данной группы ЛФ составляет 76,7% (23 ЛП) от общего числа ЛФ.
Среди способов введения ЛС ректальный имеет ряд преимуществ, а именно: быстрое всасывание лекарственного вещества за счет его попадания непосредст 15 венно в кровоток, минуя желудочно-кишечный тракт и печень. Это также дает возможность назначения препаратов, инактивирующихся ферментами желудочно-кишечного тракта или подвергающихся интенсивному пресистемному метаболизму, минимизирует побочные эффекты, позволяет применять ЛС как для местного, так и для общего воздействия на организм. Простота и безболезненность введения лекарственных средств делает их удобными для использования в педиатрии, гериатрии и психиатрической практике. Кроме того, ректальный способ введения не требует специального инструментария, производится без нарушения целостности кожных покровов, а соответственно, безопасен в плане инфицирования вирусами иммунодефицита человека, гепатита и др.
Немаловажным является и тот факт, что локализация ЛС непосредственно per rectum позволяет ускорить регенерацию слизистой, уменьшить воспалительные явления и болевые ощущения, что очень важно при комплексной терапии проктологических заболеваний [40, 47, 158].
При изучении состава суппозиториев отечественного производства отмечается ограниченный ассортимент тех из них, в состав которых входят вещества растительного происхождения (таблица 1).
Экстракт красавки густой – 15 мг Как видно из таблицы 1, отечественной промышленность производятся суппозитории «Тыквеол», содержащие масло семян тыквы. На основе облепихо-вого масла производятся суппозитории «Олестезин», «Облепиховое масло». На основе экстракта красавки – «Анузол», «Бетиол», «Красавки экстракт». Эффективным лекарственным средством при лечении заболеваний прямой кишки являются суппозитории «Альгиналон», в состав которых входят полисахариды растительного происхождения. Однако такой ограниченный ассортимент не удовлетворяет потребностей населения Российской Федерации.
Анализ основ, применяемых в отечественном производстве суппозиториев проктологического назначения, свидетельствует об ограниченном ассортименте. Так, в 66,7% ЛП основой является витепсол (12 наименований ЛП), полиэтиле-ноксидная основа используется для производства 3 наименований суппозиториев («Анестезол», «Красавки экстракт», «Олестезин») (16,7%), основой для суппозиториев с маслами «Тыквеол», «Облепиховое масло» является масло какао (11,1%). Твердый жир применяется лишь при производстве суппозиториев «Проктозан» (5,5%) [54, 94].
Ректальные мази, представленные на отечественном фармацевтическом рынке «Проктозан», «Ультрапрокт», «Релиф», «Релиф Адванс» и крем «Прокто-гливенол», составляют в структуре ЛС местного применения 13,3% и 3,3% соответственно и используются с целью воздействия на локальные процессы в прямой кишке. Мази как лекарственная форма, безусловно, обладают рядом преимуществ: они просты в изготовлении, имеют достаточно дешевую основу. Однако при применении ректальных мазей нередко ЛС не достигают пораженного участка аноректальной области, также возникают трудности при нанесении этих ЛФ на необходимый участок и удержании их на определенном месте. Кроме того, для применения данных ЛФ необходимо наличие медицинского персонала, специальных приборов, имеются сложности при дозировании, влияет температурный фактор. Из-за выше перечисленных недостатков ректальные мази и крема не получили массового распространения в медицинской практике [94].
В настоящее время в проктологии широко применяются аэрозоли («Сало 17 фальк», «Гипозоль»). Они содержат в своем составе анестетики, кортикостерои-ды, антисептики, нестероидные противовоспалительные средства. Однако данная лекарственная форма также недостаточно удобна для самостоятельного применения [94].
Для местного воздействия на очаг воспаления применяются теплые сидячие ванны с растворами антисептических средств (фурациллина, калия перманганата), с настоем ромашки, компрессы с мазью Вишневского и ихтиолом. В качестве лекарственных веществ в микроклизмах используют водные настои ромашки, календулы, шалфея или пустырника, колларгол, а также масла облепиховое, подсолнечное, семян тыквы, рыбий жир. Безусловно, эффективность микроклизм хорошо известна и не нуждается в доказательствах, однако приготовление настоев, способ введения недостаточно комфортен для пациента. Кроме того, микроклизмы как ЛФ часто потенцируют раздражение слизистой оболочки кишечника [69, 168].
Валидация методики ГХ для определения подлинности и количественного содержания эфирного масла монарды дудчатой в суппозиториях
Антимикробную активность ЭМ монарды проводили методом серийных разведений 1% спиртового раствора масел в МПБ. В качестве масел сравнения использовали ЭМ эвкалипта, мяты и лаванды.
В работе использовали 10 тест-культур. Посевная доза бактерий равнялась 1000 микробных клеток на 1 мл питательной среды. Посевы инкубировали в течение 24 ч при 37С, затем их высевали на МПА. Параллельно ставили все необходимые контроли (МПБ без добавок масел, контроли со спиртом). Результаты оценивали по интенсивности роста бактерий на МПА [4].
Определение микробиологической чистоты ЭМ монарды и разработанных суппозиториев проводили согласно ГФ ХII изд., ч. 1, с. 160 ОФС 42-0067-07. Испытания ЭМ монарды и образцов суппозиториев на микробиологическую чистоту проводили в отношении следующих тест-микроорганизмов: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans.
Подготовка проб для испытания ЭМ монарды. 10 мл образца ЭМ монарды эмульгировали в 90 мл фосфатного буферного раствора в присутствии 0,2 г твина-80 с помощью стеклянных бус, нагревая до температуры не более 40С и механически встряхивая до получения гомогенной эмульсии. Конечный объем раствора составлял 100 мл.
Суппозитории. Образец суппозиториев из средней пробы массой 10 г осторожно смешивали с 5 г твина-80. Полученную смесь нагревали на водяной бане до температуры не более 40С и добавляли стерильный фосфатный буферный раствор со стеклянными бусами. Смесь осторожно перемешивали для получения гомогенной эмульсии. Конечный объем раствора составлял 100 мл.
Методика определения. По 1 мл приготовленного образца вносили в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры 45-50С среды №1. Содержимое пробирки быстро перемешивали и переносили в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды №1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяли верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивали и инкубировали в течение 5 суток при температуре от 30 до 35С. Через 48 часов и окончательно через 5 суток подсчитывали число бактериальных колоний на двух чашках, находили среднее значение, и, умножая на показатель разведения, вычисляли число бактерий в 1г.
При определении общего числа грибов и использовали двухслойный агаровый метод в чашках Петри. 1 мл разведения вносили в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры 45-50С среды №2. Быстро перемешивали содержимое пробирок и переносили в чашку Петри, содержащую 20 мл застывшей питательной среды №2. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяли верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивали и инкубировали в течение 5 суток при температуре от 20 до 25С. Через 72 часа и окончательно через 5 суток, подсчитывали число грибов на двух чашках, находили среднее значение и, умножая на показатель разведения, вычисляли число грибов в 1 г.
Для выявления и идентификации семейства Enterobacteriaceae 10 г суппозиториев вносили в 100 мл питательной среды №3, тщательно перемешивали и инкубировали при температуре от 30 до 35С в течение 24-48 часов. Согласно требованиями ГФ ХII изд., ч. 1, с. 160 ОФС 42-0067-07: в 1 мл ЭМ допускается не более 104 аэробных бактерий, 102 грибов, не более 102 Энтеробактерий, отсутствие Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (категория 3.2). в 1 г суппозиториев допускается не более 103 аэробных бактерий, 102 грибов, отсутствие Escherichia coli (категория 3А). 2.2.5. Фармакологические методы Исследование противовоспалительной активности ЭМ монарды проводилось с использованием модели по В. Менкину на 16-ти обоеполых белых лабораторных мышах [74]. Были взяты две группы: опытная и контрольная. Мышам опытной группы вводили внутрикожно в подушечку задней лапы 0,08 мл 10 миллиардной суточной культуры Staphylococcus aureus 209. После инъекции микробной взвеси животным трижды через день вводили внутримышечно 0,1 мл 0,5% масляного раствора ЭМ монарды. У животных контрольной группы инфекционный очаг воспроизводили так же, как и у животных опытной группы. Мышам контрольной группы инъекции ЭМ монарды не делали. Учет интенсивности воспаления у животных обеих групп проводили путем ежедневного сравнительного измерения объема «больных» и «здоровых лап» онкометрически. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку опытов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых рядов. Изменение исследуемых показателей считали статистически значимыми при p 0,05. Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения «Microsoft Office» и «Autocad». Настоящий дизайн исследования определяет методологию и последовательность данных научных разработок и состоит из ряда основных этапов (рисунок 4). В соответствии с разработанной концепцией исследования на первом этапе проводится маркетинговый анализ российского рынка ректальных ЛФ. На данном этапе проводится сравнительная характеристика современных ректальных ЛФ. На том же уровне по значимости исследований на рисунке 4 показано обоснование выбора основных действующих компонентов ЛФ. Второй этап настоящего дизайна посвящен оценке качества ЭМ монарды, в ходе реализации которого проводится разработка методов анализа ЭМ монарды. Полученные результаты данного этапа являются базовыми при разработке методов анализа ЛФ. На данном этапе также подтверждается антимикробная и противовоспалительная активность ЭМ монарды. Третий этап представляет собой комплекс работ по непосредственному формированию состава суппозиториев с учетом данных первых двух этапов. В рамках данного этапа исследований проводится изучение физико-химических, реологических показателей модельных суппозиториев, проводятся исследования, посвященные технологическому совершенствованию выбранных суппози-торных основ. Полученные результаты позволяют дать подробную оптимальную технологию производства ЛФ с выбором и обоснованием критических точек технологического процесса. С целью обеспечения возможности исследования стабильности разработанной ЛФ при хранении и обоснования разработанного технологического процесса производства разработанных суппозиториев четвертый этап настоящего дизайна посвящен разработке методов анализа основных действующих компонентов разрабатываемой ЛФ. Для разработанных методик созданы валидацион-ные характеристики.
Разработка состава суппозиториев с биологически активными веществами
В консервативной терапии проктологических заболеваний для быстрого обезболивания аноректальной области широко используют местноанесте-зирующие препараты анестезин, лидокаин, которые могут применяться путем аппликаций, но чаще в составе комбинированных мазей, кремов и суппозиториев [70].
Дальнейшие исследования были посвящены совершенствованию состава и технологии суппозиториев с комплексом БАВ. Исходя из современных требований комплексного (обезболивающего, противовоспалительного, ранозаживляющего, антимикробного) воздействия ЛС, в состав ЛФ одним из активных компонентов, оказывающих местноанестезирующее действие, был введен анестезин. При выборе содержания анестезина в суппозиториях ориентировались на его содержание в известных суппозиториях, выпускаемых отечественной промышленностью и применяемых в проктологии [54].
Известно, что добавление вспомогательных веществ разносторонне влияет на качество разрабатываемой ЛФ. Учитывая снижение таких показателей как ВПД, температура плавления, механическая прочность при введении в суппозиторную основу комплекса БАВ, решено было ввести в качестве предполагаемого структуроформирующего агента, а также стабилизатора ПВП в количестве 1%.
Для изучения равномерности распределения действующих веществ, а также для улучшения их полноты высвобождения ЛС в состав суппозиториев были введены ПАВ: твин-80 и эмульгатор №1, взятых в общеизвестных концентрациях (1% и 5% соответственно). Модельные образцы суппозиториев на основах твердый жир типа А и витепсол W35 готовили методом выливания [10, 17, 75].
С учетом физико-химических свойств компонентов разрабатываемой ЛФ изготовление модельных образцов суппозиториев осуществляли в две стадии.
При изготовлении суппозиториев с твином-80 в расплавленную основу при тщательном перемешивании вводили комплекс БАВ (масляный раствор /2-каротина и ЭМ монарды) (полупродукт 1). В ступке измельчали анестезин, добавляли ПВП, твин-80, тщательно смешивали и частями добавляли полупродукт 1.
При изготовлении суппозиториев с эмульгатором №1 суппозиторную основу сплавляли с эмульгатором №1 на водяной бане и при тщательном перемешивании вводили комплекс БАВ (масляный раствор -каротина и ЭМ монарды) (полупродукт 1). В ступке к измельченному анестезину добавляли ПВП, смешивали и частями добавляли полупродукт 1.
Суппозиторную массу дозировали в гнезда формы объемом 3,0, предварительно смазанные мыльным спиртом. Охлаждали до полного застывания в условиях холодильника (при температуре (4±1)С в течение 60 мин.), после чего суппозитории извлекали из формы и упаковывали.
Оценку качества полученных модельных образцов суппозиториев проводили согласно требований ГФ XI изд. Результаты исследований представлены в таблице 13. Таблица 13 – Органолептические и физико-химические свойства модельных образцов суппозиториев Объект исследования Внешний вид впд Тпл, С суппозитории состава №1 Суппозитории торпедообразной формы, равномерно окрашенные, светло-оранжевые, гладкие, без трещин и сколов. На срезе однородные, без механических включений 6,45±0,02 36,12±0,02 суппозитории состава №2 Суппозитории торпедообразной формы, равномерно окрашенные, светло-оранжевые, гладкие, без трещин и сколов. На срезе однородные, без механических включений 6,72±0,02 35,92±0,02 суппозитории состава №3 Суппозитории торпедообразной формы, равномерно окрашенные, светло-оранжевые, гладкие, без трещин и сколов. На срезе однородные, без механических включений 6,56±0,02 36,14±0,02 суппозитории состава №4 Суппозитории торпедообразной формы, равномерно окрашенные, светло-оранжевые, гладкие, без трещин и сколов. На срезе однородные, без механических включений 7,05±0,02 36,25±0,02
По внешнему виду все приготовленные образцы суппозиториев торпе дообразной формы, равномерно окрашенные, светло-оранжевые, гладкие, без трещин и сколов. На срезе однородные, без механических включений.
Установлено, что средние значения температуры плавления и ВПД для модельных образцов суппозиториев с комплексом БАВ+анестетик, изготовленных на основах твердый жир типа А и витепсол W35, увеличиваются, но не превышают допустимых норм, предъявляемых ГФ XI изд.
При разработке суппозиториев в первую очередь необходимо учитывать физико-химические свойства лекарственных веществ, а также параметры суппозиторной основы, которые характеризуют ее как твердое тело. В предыдущих экспериментах установлено, что температура плавления основ снижается при повышении содержания липофильных компонентов. За счет этого уменьшается и ВПД суппозиториев.
Кроме того, необходимо учитывать реологические параметры суппози-торных масс. Знание реологических свойств разрешает регулировать процессы высвобождения, эффективности терапевтического воздействия, однородности дозирования и выбора параметров технологического процесса при разработке, производстве и применении ЛФ.
При определении реологических параметров суппозиториев с действующими веществами и суппозиторной основы (твердый жир типа А) установлено, что исследуемые объекты представляют собой системы с Ньютоновским типом течения как при температуре 37С, так и при 40С (рисунки 10 и 11).
Валидация методики ГХ определения подлинности и количественного содержания ЭМ монарды в препарате «Монавитол»
Как следует из представленных данных, требования к параметрам линейной зависимости выполняются, то есть линейность методики количест венного определения ЭМ монарды подтверждается в диапазоне концентраций от 80% до 120% от номинального значения.
Таким образом, методика характеризуется достаточной сходимостью, так как найденное значение относительного доверительного интервала величины Z (1,3393%) меньше критического значения для сходимости результатов (1,6%) (таблица 23).
Методика характеризуется достаточной правильностью, так как выполняется критерий незначимости систематической ошибки методики. Систематическая ошибка методики равна 0,07% и удовлетворяет требованиям статистической и практической незначимости: статистическая незначимость: 1,06 : 3 = 0,35% 0,07%; практическая незначимость: 0,32 х 4,8 = 1,54% 0,07%. Высокое значение коэффициента корреляции r = 0,99941 удовлетворяет требованиям критерия приемлемости (r = 0,98273) и подтверждает линейность зависимости между взятым и найденным количеством ЭМ монарды в области от 80% до 120% относительно его номинального содержания в препарате. Выполняются требования к параметрам линейной зависимости (а, RSD0/b, r) мето дики определения ЭМ монарды во всем диапазоне концентраций от 80% до 120% от номинального значения (таблица 24).
Для подтверждения корректности методики при воспроизведении в других лабораториях проведен прогноз полной неопределенности методики. Полная неопределенность методики анализа (AAS) включает в себя неопределенность пробоподготовки (ASP) и неопределенность конечной аналитической операции (AFAO): AS= 4P + 4AO, (5)
При этом прогнозируемая полная неопределенность результатов анализа не должна превышать максимально допустимую неопределенность результатов анализа для допусков содержания + 15% - max As 4,8%.
Ожидаемая неопределенность пробоподготовки складывается из неопределенности навески препарата и навески, взятой для приготовления раствора сравнения, доведения до метки растворов и разбавления. Расчет проведен из расчетных формул проекта ФСП с использованием подхода к допустимой неопределенности мерной посуды. Расчет и величины неопределенности процедуры пробоподготовки приведены в таблице 25.
Расчет неопределенности пробоподготовки для методики количественного определения ЭМ монарды дудчатой Операция пробоподготовки Параметр для расчетной формулы Неопределённость (), % Раствор сравнения Взятие навески ЭМ монарды mo=75 мг 0,27% Доведения объёма растворав мерной колбе 5,0 мл до метки 5 0,50% Суммарная неопределенность пробоподготовки SP равна: SP=[0,27 2+0,5 2+0,5 2]1/2=0,76%,
Расчет неопределенности конечной аналитической операции по количественному определению ЭМ монарды рассчитывали для испытуемого раствора и раствора сравнения по данным, приведенным в таблице 26. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) рассчитывали для среднего из 3 результатов. Полученные значения относительных стандартных отклонений для площадей пика ЭМ монарды меньше допустимого RSDmax,% (n0 = 3, В = 15%) Полученные результаты показывают, что полная прогнозируемая неопределенность результатов для теста «Количественное определение ЭМ монарды» не превышает критическое значение АЯІШХ = 4,8, то есть методика будет давать корректные результаты.
Таким образом, разработанная методика количественного определения ЭМ монарды в препарате «Монавитол» методом ГХ в диапазоне применения методики валидирована и является корректной по показателям специфичность, правильность, прецизионность (сходимость) и линейность.
Определение микробиологической чистоты проводили по методике, приведенной в п. 2.2.6. главы 2. Результаты микробиологического контроля разрботанных суппозиториев, представленные в таблице 27, показали их полное соответствие требованиям НД.
Стабильность – неотъемлемое требование, предъявляемое к фармацевтическим препаратам с точки зрения сохранения их качества. Поэтому проблема исследования стабильности и создания стабильных ЛФ является одной из актуальных проблем фармации.
Качество изготовленных суппозиториев оценивали в процессе длительного хранения с помощью химических и физико-химических методов исследования.
С этой целью готовили суппозитории на основе твердый жир типа А, выбранной в результате ранее проведенных исследований в качестве оптимальной, с добавлением 1% твина-80 и 1% ПВП. Упаковывали их в контурные упаковки из полимерных материалов (контурная ячейковая упаковка по ОСТ 64-074-91 из пленки поливинилхлоридной марки ЭП-77С по ГОСТ 25250-88).
Хранили суппозитории при температурном режиме (4±1)С, подвергая контролю через 6, 12, 18, 24 месяца (срок наблюдения). Критериями качества служили следующие показатели: внешний вид, температура плавления, ВПД, средняя масса суппозитория, подлинность, количественное содержание действующих веществ. Все показатели определяли по методикам, описанным в главе 2.
Результаты визуального контроля показали, что внешний вид суппозиториев не менялся в течение всего срока наблюдения, а суппозиторная масса оставалась однородной. Значение температуры плавления не превышало 37С, ВПД суппозиториев не превышало 15 мин. и составило в процессе хранения 4-5 мин.
Средняя масса суппозиториев оставалась стабильной. Результаты исследования суппозиториев в процессе хранения представлены в таблице 28. Данные таблицы 28 свидетельствуют о том, что количество действующих веществ в процессе хранения суппозиториев изменялось незначительно и не превышало допустимых норм содержания.
На основании проведенных исследований можно сделать заключение: предлагаемые суппозитории стабильны в течение 24 мес., что позволяет установить срок хранения суппозиториев – 2 года.
