Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на патогенез воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза 17
1.1. Иммунные механизмы внутриглазного воспаления: уроки исследований на релевантных моделях увеоретинита и ретинопатии 17
1.1.1. Экспериментальные модели увеоретинита и аутоиммунной ретинопатии 18
1.1.2. Эффекторные и регуляторные клетки при экспериментальном увеоретините 23
1.2. Цитокины, ассоциированные с развитием внутриглазного воспаления 29
Глава 2. Современные средства иммуномодуляции в офтальмологии 35
2.1. Средства неспецифической иммуномодуляции при увеитах 35
2.2. Специфические ингибиторы провоспалительных медиаторов при увеитах 38
2.3. Аминодигидрофталазиндион натрия – модулятор функций макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов 43
Глава 3. Гипербарическая оксигенация в лечении воспалительных заболеваний: механизмы лечебного действия, перспективы использования в офтальмологии 51
Резюме обзора литературы 59
Материалы и методы исследования 61
1. Клиническая характеристика больных и принципы разделения больных на группы в зависимости от варианта консервативного лечения 61
1.1. Больные острыми и хроническими эндогенными увеитами 61
1.2. Больные с проникающими травмами глаза 63
1.3. Больные с экссудативно-воспалительными реакциями после экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы 66
2. Методы исследования 69
2.1. Клинико-инструментальные методы 69
2.2. Иммунологические методы 70
3. Статистические методы анализа полученных данных 76
Результаты собственных исследований 77
Глава 1. Поиск надежных и информативных молекулярных маркеров воспаления при различных формах увеита 77
1.1. Частота выявления и концентрации неоптерина и провоспалительных цитокинов в слезной жидкости при эндогенном увеите 78
1.2. Частота выявления и концентрации неоптерина и провоспалительных цитокинов в слезной жидкости при посттравматическом увеите 84
1.3. Неоптерин и провоспалительные цитокины как критерий выраженности внутриглазного воспаления после экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы 94
Глава 2. Системные расстройства клеточного иммунитета при увеитах различной этиологии 101
2.1. Расстройства клеточного иммунитета при эндогенном увеите 101
2.2. Динамика показателей клеточного иммунитета при посттравматическом увеите 110
2.3. Изменения функциональной активности нейтрофилов и субпопуляционного состава лимфоцитов после экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы 120
Глава 3. Аминодигидрофталазиндион натрия и гипербарическая оксигенация в лечении увеитов различной этиологии: клиническая эффективность, местное противовоспалительное и системное иммуномодулирующее действие 130
3.1. Патогенетическая терапия острых и хронических эндогенных увеитов 131
3.1.1. Влияние АФГ и его комбинации с ГБО на течение и клинические исходы острых и обострения хронических форм эндогенных увеитов 131
3.1.2. Влияние АФГ и его комбинации с ГБО на системные показатели клеточного иммунитета и динамику маркеров воспаления в СЖ у больных эндогенными увеитами 138
3.2. АФГ и ГБО в лечении посттравматического увеита 150
3.2.1. Патогенетическая терапия посттравматического увеита у больных без явных инфекционных осложнений 150
3.2.2. Патогенетическая терапия проникающей травмы глаза с инфекционными осложнениями 162
3.3. АФГ и ГБО в лечении увеита, вызванного экстракцией катаракты с имплантацией интраокулярной линзы 175
Заключение 185
Выводы 197
Практические рекомендации 200
Список литературы
- Экспериментальные модели увеоретинита и аутоиммунной ретинопатии
- Аминодигидрофталазиндион натрия – модулятор функций макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов
- Иммунологические методы
- Частота выявления и концентрации неоптерина и провоспалительных цитокинов в слезной жидкости при посттравматическом увеите
Экспериментальные модели увеоретинита и аутоиммунной ретинопатии
Медико-социальная значимость воспалительных заболеваний увеального тракта и сетчатки определяется в первую очередь тем, что их исходом нередко является нарушение зрения вплоть до его полной потери [42, 95]. Попытки совершенствования традиционных схем лечения инфекционных и аутоиммунных увеоретинитов, применявшихся многие десятилетия, не привели к ожидаемым результатам и снижению числа указанных болезней. Практическая востребованность поиска новых, в том числе основанных на целенаправленной иммунорегуляции, методов терапии увеоретинитов делает крайне актуальными исследования, направленные на раскрытие и уточнение ключевых патогенетических звеньев развития воспалительных заболеваний глаза [148]. С 80-х годов XX века по настоящее время в различных станах мира интенсивно изучаются иммунные механизмы патогенеза этой гетерогенной группы заболеваний [71]. В указанный период развитие иммунологии и смежных дисциплин характеризуется сменой научных парадигм, открытием новых морфофункциональных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, иммунных медиаторов и их рецепторов [23, 63, 87, 156], что закономерно отражается на эволюции представлений о патогенезе увеоретинитов.
Успехи в раскрытии защитной и патогенетической роли различных звеньев иммунной системы при воспалительных заболеваниях сосудистой оболочки глаза и сетчатки в значительной степени связаны с экспериментальными исследованиями на животных. В этой связи, ниже мы охарактеризуем основные экспериментальные модели увеоретинита и аутоиммунной ретинопатии, а также проанализируем полученные с их помощью данные по иммунным механизмам интраокулярного воспаления.
Разработан целый ряд экспериментальных моделей, воспроизводящих различные клинические формы увеоретинитов, для изучения иммунопатогенеза и разработки стратегий лечения этой группы заболеваний. В большей части опубликованных в этой области экспериментальных работ использованы крысиные и мышиные модели воспаления увеального тракта, вызванного эндотоксином [150], и экспериментального аутоиммунного увеоретинита, индуцированного антигенами сетчатки, in vivo [72].
Первая модель воспроизводит передний увеит, возникающий в результате локального воспалительного ответа на системно введенный компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий – липополисахарид (ЛПС). ЛПС вызывает быструю и стойкую воспалительную реакцию в передних отделах сосудистой оболочки глаза глаза [159], однако точные механизмы, за счет которых эндотоксин при подкожном или внутрибрюшинном введении индуцирует интраокулярное воспаление, до сих пор не раскрыты. Несмотря на то, что некоторые авторы, опираясь на косвенные свидетельства участия ЛПС в патогенезе воспалительных заболеваний глаза, выдвигают эндотоксиновую теорию патогенеза переднего увеита и эндофтальмита у человека [9], до сих пор точно не установлено, имеется ли человеческий эквивалент локального воспалительного ответа в передней камере глаза на системную циркуляцию ЛПС. Также нет единого мнения, какую именно форму увеита у человека воспроизводит эта модель. Тем не менее, индуцированный эндотоксином экспериментальный увеит широко используется для изучения воспалительного процесса в глазе, в частности для исследования патогенетической роли компонентов врожденного иммунитета.
Несомненными преимуществами данной модели является быстрота и относительная простота индукции, а также хорошая воспроизводимость на инбредных и беспородных мышах и крысах. Кроме того, уроки, полученные в этой модели, оказались полезными и в свете целенаправленного поиска эффективных средств патогенетической терапии увеита среди фармакологических субстанций, которые уже зарекомендовали себя как действенные блокаторы каскада эндотоксин-индуцированных патологических событий, о чем будет сказано ниже.
Считается, что модели аутоиммунного увеита гораздо ближе к неинфекционным воспалительным заболеваниям сосудистой оболочки глаза человека как по клиническим проявлениям, так и по раскрытым механизмам развития [71].
Типичным методом индукции экспериментального аутоиммунного увеита является иммунизация чувствительных животных, обычно мышей или крыс, одним из ретинальных антигенов, чаще всего аррестином (S антигеном) или межфоторецепторным ретинол-связывающим белком (IRBP) совместно с бактериальными адъювантами, такими как токсин Bordetella pertussis или полный адъювант Фрейнда, содержащий убитые нагреванием клетки Mycobacterium bovis. Эти адъюванты, стимулируя образраспознающие рецепторы, активируют клетки врожденного иммунитета (моноциты/макрофаги, дендритные клетки, NK- и NKT-клетки, -лимфоциты) и тем самым в присутствии аутоантигенов направляют адаптивный иммунный ответ по аутореактивному пути. В действительности, стимуляция врожденного иммунного ответа сама по себе вызывает воспаление сосудистой оболочки глаза на моделях in vivo (что происходит, например, при переднем увеите, индуцированном эндотоксином [115] и, возможно, у человека. Тем не менее, именно аррестин и IRBP индуцируют аутоиммунное воспаление, преимущественно локализованное в задних отделах сосудистой оболочки глаза.
В качестве модели для доклинических исследований иногда используют модель индуцированного аррестином воспаления увеального тракта на обезьянах. При этом клинические и гистологические проявления увеита наиболее адекватно воспроизводят таковые у человека [90]. В отличие от мышиных и крысиных моделей, увеит у приматов характеризуется, помимо привлечения в очаг воспаления Т-клеток, притоком В-лимфоцитов и субретинальным фиброзом. Эти особенности сближают указанную модель с синдромом Фогта-Коянаги-Харады, а также с субретинальным фиброзом и увеальным синдромом у человека.
Достаточно хорошо охарактеризована модель переднего аутоиммунного увеита, в которой как триггер интраокулярного воспаления применяют увеальный меланин [66]. Инъекция бычьего увеального меланина некоторым инбредным и беспородным крысам вызывает воспаление главным образом в передней камере глаза и инфильтрацию лимфоцитами радужки и цилиарного тела, что в значительной степени имитирует события, разворачивающиеся при остром переднем увеите (иридоциклите) у человека [160]. В этой связи многие исследовательские группы используют меланин-индуцированный аутоиммунный увеит для изучения различных аспектов патогенеза острого переднего увеального воспаления, в том числе роли разных субпопуляций лейкоцитов, молекул адгезии, цитокинов, хемокинов, оксида азота, системы комплемента и апоптоза.
Аминодигидрофталазиндион натрия – модулятор функций макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов
В условиях экспериментального увеоретинита установлены не только клетки-эффекторы аутоиммунного воспаления, но и механизмы контроля над ним. В частности, выявлена иммуносупрессорная роль некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов, эпителиальных и миелоидных клеток.
Выше уже говорилось об иммуносупрессивном значение CD8+Foxp3+ Т-клеток, пиковое увеличение числа которых в сосудистой оболочке глаза совпадает с началом регресса воспалительных проявлений увеоретинита. Другой важной субпопуляцией, чья роль в предотвращении/подавлении аутоиммунного увеита доказана, являются CD4+CD25+ естественные Т-регуляторные клетки (nTreg). Истощение этих клеток с использованием моноклональных антител значительно усиливает выраженность экспериментального увеита [94]. Так же, как и эффекторные CD4+ и CD8+ клетки, CD4+CD25+ nTreg активируются после связывания их TCR с ретинальными антигенами. При этом подавляется функция не только T-эффекторов, несущих TCR к тем же аутоантигенам, но и T-клеток других специфичностей [151]. Это увеличивает эффективность контроля над аутоиммунным воспалением, так как во многих случаях мишенями аутоиммунной атаки при увеоретините как в эксперименте, так и в клинике, являются сразу несколько антигенов сетчатки.
Пигментные эпителиальные клетки сетчатки и радужки, формирующие гематоофтальмический барьер, также участвуют в защите от инфильтрирующих воспалительных клеток [125]. Пигментные эпителиальные клетки различной локализации подавляют активированные CD4+ T-лимфоциты разными путями. Клетки радужки оказывают иммуносупрессорный эффект при непосредственном контакте с клеткой эффектором, в котором ключевое значение имеют молекулы B7-2 на эпителиальных клетках и CTLA-4 на T-лимфоцитах. Иммуносупрессивный сигнал в данном случае опосредован мембранной формой трансформирующего ростового фактора- (ТРФ-). В сетчатке пигментные эпителиальные клетки оказывают иммунорегуляторное действие за счет растворимых медиаторов: ТРФ- и тромбоспондина-1 [125]. Кроме того, пигментные клетки обеих локализаций индуцируют генерацию Тreg. Указанные иммуносупрессивные эффекты пигментных эпителиальных клеток являются одним из механизмов поддержания иммунной привилегированности глаза [161].
В последние годы большое внимание уделяется супрессорным клеткам миелоидного происхождения (MDSC), которые при опухолевых заболеваниях отвечают за системные и локальные механизмы иммунодепрессии [135]. Также установлена гомеостатическая роль MDSC, в частности их способность поддерживать толерантность к собственным антигенам. В условиях экспериментального аутоиммунного увеоретинита существенная часть CD11b+Gr1+-миелоидных клеток, инфильтрирующих ткани глаза, способна подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов и является аналогами MDSC, выявляемых при неопластических заболеваниях [136]. Вероятно, интраокулярные MDSC при увеоретините, также как их аналоги при опухолевых заболеваниях, используют разнообразные механизмы прямого подавления активности эффекторных клеток врожденного и адаптивного иммунитета, кроме того, они индуцируют генерацию Тreg, вырабатывая аргиназу или ИЛ-10 и ТРФ- [136].
Отметим, что полученные в условиях экспериментального увеоретинита данные позволили существенно приблизиться к пониманию не только сути инфекционного и аутоиммунного интраокулярного воспаления, но и механизмов поддержания иммунной привилегированности глаза и толерантности к аутоантигенам в целом. Кроме того, вышеописанные экспериментальные модели служат незаменимым инструментом для разработки новых методов лечения различных форм увеоретинита. С использованием этих моделей разрабатываются различные биотерапевтические подходы, в частности, основанные на специфическом и неспецифическом подавлении активности аутоантиген-специфических клонов T-лимфоцитов, индукции толерантности к антигенам сетчатки, нейтрализации ФНО и ИЛ-17, блокировке молекул адгезии, хемокинов и хемокиновых рецепторов [71]. Некоторые экспериментальные разработки уже находятся на этапах клинических испытаний, положительные результаты которых являются свидетельством того, что многие модели интраокулярного воспаления in vivo и in vitro достаточно точно воспроизводят различные формы увеоретинита и ретинопатии человека.
Иммунологические методы
Результаты настоящего фрагмента работы говорят о целесообразности определения неоптерина в СЖ как дополнительного, но при этом надежного критерия оценки выраженности внутриглазного воспаления и эффективности проводимого лечения при эндогенных увеитах.
ИЛ-1 и ФНО, обладая коротким периодом жизни, далеко не у каждого пациента с острыми и хроническими формами заболевания адекватно отражали тяжесть воспалительного процесса, а у многих больных их концентрация в СЖ были ниже уровня обнаружения даже на высоте клинических проявлений заболевания.
Полученные данные определяют вектор поиска действенных методов коррекции избыточной продукции провоспалительных медиаторов, играющих ключевую роль в развитии различных форм эндогенного увеита. Выявленное существенное увеличение уровня триггеров и маркеров воспаления на высоте клинических проявлений эндогенного увеита говорит о целесообразности включения в комплексное лечение этого заболевания эффективных средств, способных регулировать продукцию провоспалительных медиаторов в крови и тканях [2, 4]. Для этих целей предложено использование, например, ингибиторов ФНО, в частности инфликсимаба и адалимумаба [147]. На наш взгляд, альтернативой этим средствам может стать АФГ [1], который обладает меньшим числом побочных эффектов и при этом известен как модулятор продукции ИЛ-1 и ФНО [16, 32]. Уже получены предварительные данные о его высокой эффективности в лечении увеитов вирусной, хламидийной, токсоплазменной этиологии [5].
Прогресс в совершенствовании методов микрохирургии глаза определяет достаточно высокую эффективность лечения больных с проникающими травмами этого органа (ПТГ). Вместе с тем ранения глаза характеризуются частым развитием увеита, связанного либо с прямым заносом инфекции внутрь глазного яблока, либо с аутоиммунными процессами вследствие нарушения гематоофтальмического барьера. Подчеркнем, что аутоиммунные реакции играют существенную роль в поражении сосудистой оболочки глаза и при инфекционном генезе посттравматического увеита. Воспаление увеального тракта в свою очередь является основной причиной субатрофии и атрофии глазного яблока и посттравматической энуклеации.
В этой связи актуальной задачей является поиск простых и наиболее информативных молекулярных маркеров, которые отражают выраженность внутриглазного воспаления, с целью своевременной и адекватной терапии развивающегося увеита. Определение молекулярных маркеров воспаления в СЖ проводили в 1-3-е сутки после первичной хирургической обработки (ПХО) раны, затем на 8-10-е сутки, 14-16-е сутки, через 1 месяц и через 3 месяца.
У большинства больных (89%) отмечалось резкое снижение зрения, что свидетельствовало о тяжести травмы и развитии осложнений. Внутриглазные инородные тела обнаружены у 62 больных (67%), повреждение хрусталика – у 60 (65%), выпадение и ущемление внутренних оболочек глаза – у 52 (56%), гифема различной степени выраженности – у 48 (52%), гемофтальм – у 26 (28%), отслойка сетчатки – у 6 (6,5%). У 35 (38%) пациентов при поступлении были обнаружены признаки раневой инфекции: инфильтрация краев раны, опалесценция влаги передней камеры, гипопион, экссудат на радужке и передней камере, стекловидном теле.
Всем больным с ПТГ в экстренном порядке проводили ПХО, после чего проводили консервативное лечение, как описано в параграфе 1.2 раздела «Материалы и методы». Повторные оперативные вмешательства в ранние сроки после ПХО выполнены 28 пациентам. Чаще всего это были операции по поводу набухающего хрусталика (16 пациентов), вымывание гипопиона и введение антибиотиков в переднюю камеру (8 пациентов), рассечение синехий или базальная иридэктомия (3 пациента), пломбировка склеры (1 пациент).
Воспалительный процесс в сосудистой оболочке достигал максимума к 7-10-м суткам после ПХО, хотя степень выраженности была различной в зависимости от характера течения посттравматического периода. У пациентов с неосложненным течением активность воспалительного процесса была наиболее выражена на 7-8-е сутки наблюдения и составляла в среднем 6,17 баллов. При осложненном течении острого посттравматического увеита наиболее выраженные воспалительные признаки (в среднем 10,35 баллов) проявлялись к 8-10-м суткам после ПХО.
ФНО и ИЛ-1, которые обнаруживались в СЖ здоровых доноров примерно в половине случаев, в первые дни после ПХО выявлялись несколько чаще, а пиковая частота их детекции зарегистрирована на 8-10-е сутки наблюдения (Рис. 6). К этому сроку ФНО определялся в СЖ у 70 больных (75%), ИЛ-1 – у 60 больных (65%). По мере стихания явлений посттравматического увеита частота определения ФНО и ИЛ-1 в СЖ снижалась. Через 3 месяца после травмы ФНО выявлялся лишь у 47 пациентов (50%), ИЛ-1 – у 33 больных (35%).
Концентрация неоптерина в СЖ была выше уровня детекции (20 пг/мл) у 100% обследованных больных в течение всего периода наблюдения, также как у всех здоровых доноров. У больных с неосложненным течением посттравматического периода между уровнями ФНО, ИЛ-1 и неоптерина в СЖ выявлена прямая корреляционная связь.
Частота выявления и концентрации неоптерина и провоспалительных цитокинов в слезной жидкости при посттравматическом увеите
Характерным для группы больных со стандартной терапией было длительное снижение соотношения основных субпопуляций Т лимфоцитов, которое сохранялось и через 1 (ИРИ=1,4), и через 3 месяца (ИРИ=1,6) от начала лечения при близком к норме уровне В-клеток.
Основные иммунологические сдвиги мы связываем не только с патогенезом/саногенезом заболевания, но и с длительным местным применением стероидных препаратов, оказывающих за счет системной резорбции супрессивное действие на ключевые звенья иммунитета.
К 7-8-му дню заболевания/обострения у пациентов, получавших традиционное лечение в сочетании с АФГ, абсолютные и относительные показатели СD3+-лимфоцитов значительно увеличились, а через 2 недели практически не отличались от соответствующих значений у здоровых людей. Под действием иммуномодулятора к концу 2-й недели нормализовался и ЛТИ, и соотношение основных субпопуляций Т-лимфоцитов (ИРИ), что также свидетельствует о ликвидации Т-клеточного иммунодефицита. У пациентов, получавших в комплексном лечении АФГ, относительное количество и абсолютное число СD4+- и СD8+-клеток достигали нормального уровня уже через 1 месяц наблюдения.
В целом можно отметить, что включение АФГ в схему комплексного лечения острых увеитов имело положительный эффект у подавляющего большинства больных.
Таким образом, применение АФГ способствовало нормализации функциональных и количественных показателей иммунной системы, что проявлялось: - снижением гиперактивности макрофагов и подавлением продукции ими провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО) и других маркеров функциональной активности этих клеток (неоптерин), отражающими клинически ускоренное купирование основных симптомов внутриглазного воспаления (боли, покраснения глазного яблока, отека роговицы и радужки и т.д.); - стимуляцией фагоцитарной и микробицидной активности НФ, подтвержденной статистически значимым увеличением показателей спонтанного НСТ-теста и активности миелопероксидазы; - стимуляцией активности и пролиферации Т-лимфоцитов с нормализацией соотношения основных субпопуляций этих клеток и нивелированием развивающейся при увеитах Т-лимфопении. Очевидно, что все это способствовало сокращению сроков и более полному обратному развитию признаков локального воспаления, рассасыванию преципитатов на роговице, регрессии экссудата в передней камер и т.д.
В III группе больных («Стандарт+АФГ+ГБО») абсолютное число и относительное содержание лимфоцитов достигали референсных значений нормы уже к концу 1-й недели лечения. К 14-16-м суткам наблюдения у всех больных, получавших сеансы ГБО в сочетании с внутримышечными инъекциями АФГ, отмечали полную ликвидацию Т-лимфопении, выявляемую в первые дни заболевания, что свидетельствует о положительном влиянии сеансов ГБО на пролиферацию Т-лимфоцитов. К концу 2-й недели ЛТИ и ИРИ у больных этой группы практически не отличались от показателей здоровых людей.
Результаты настоящего блока исследований позволяют предположить, что одним из основных механизмов противовоспалительного действия комбинации ГБО и АФГ при остром увеите является стимуляция подавленной активности НФ. Реактивация фагоцитарной и микробицидной функции НФ гипербарическим кислородом в сочетании с отмеченным выше иммуномодулирующими эффектами АФГ значительно ускоряла лечение больных с острыми
Из 93 включенных в исследование больных с ПТГ, осложнившейся острым увеитом, у 47 пациентов (47 глаз) посттравматический период протекал без выраженных признаков внутриглазной инфекции. Эти больные подразделялись на группы в зависимости от варианта консервативного лечения, следовавшего после первичной хирургической обработки (ПХО), как описано в параграфе 1.2. раздела «Материалы и методы».
Оценку клинических признаков активности воспалительного процесса и определение молекулярных маркеров в СЖ и системных иммунологических показателей проводили в 1-3-е сутки после первичной хирургической обработки (ПХО) раны, затем на 8-10-е сутки, 14-16-е сутки, через 1 месяц и через 3 месяца.
У пациентов с неосложненным течением посттравматического периода, получавших традиционное лечение, активность воспалительного процесса возрастала до пиковых значений к 8-10-му дню после ПХО, затем постепенно снижалась (Табл. 16).
