Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 14-49
ГЛАВА 1. Современные представления о поллинозе: аспекты этиологии, патогенеза, клиники и аэропалинологический мониторинг 14-24
ГЛАВА 2. Интерфероны и иммунитет 25-46
2.1. Краткие сведения об интерферонах 25-28
2.2. Эффекты и механизмы действия интерферонов 28-31
2.3. Понятие системы IFN 31
2.4. Интерфероновый статус 32-33
2.5. Иммунный статус и цитокины, как биологические
маркёры атопии 33-39
2.6 Слизистые и цитокины 39-40
2.7. Дисбаланс Thl\Th2 40-41
2.8. Интерфероны в практической медицине 42-46
ГЛАВА 3. Современная терапия атопических заболеваний (в частности поллиноза) и дальнейшие её перспективы 47-50
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 51-131
ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 51-69
1.1. Клиническая характеристика пациентов 51-54
1.2.Характеристика ЧРа2ИФН: схема, доза и способ его введения 55
1.3. Методы обследования 55-68
1.3.1. Методы аллергологического обследования 56-60
1.3.2. Инструментальные методы исследования 60-62
1.3.3. Методы иммунологического обследования 62-68
1.4. Методы статистической обработки данных 68-69
ГЛАВА 2. Изучение интерферонового статуса и маркёров воспаления у длительно болеющих больных поллинозом: пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом и изолированным пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитом за месяц до начала клинических проявлений 70-83
2.1. Данные анамнеза и характеристика исследуемых групп больных 70-72
2.2. Выявление маркеров аллергического воспаления у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 72-74
2.3 Оценка показателей интерферонового статуса у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 74-75
2.4. Оценка показателей иммунного статуса у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 75-80
2.5. Оценка показателей цитокинового статуса у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 80-81
2.6. Оценка маркёров воспаления верхних и нижних дыхательных путей у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 81-82
2.7. Корреляция показателей у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений 82-83
ГЛАВА 3. Изучение влияние низких доз человеческого рекомбинантного а2-интерферона на клинико-иммунологические показатели у больных с поллинозом (пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом) 84-116
3.1 .Характеристика подгрупп пациентов 84-85
3.2. Результаты клинического обследования пациентов за месяц до лечения, после 30 дней лечения ЧРа2ИФН и после окончания сезона палинации 86-88
3.3. Динамика маркёров аллергического воспаления 89-90
3.4. Особенности динамики показателей интерферонового статуса 90-93
3.5. Динамика показателей иммунного статуса 94-107
3.6. Динамика показателей цитокинового профиля 107-110
3.7. Динамика маркёров воспаления верхних и нижних дыхательных путей у пациентов с поллинозом за месяц до
начала клинических проявлений 110-113
3.8. Корреляция исследуемых показателей у пациентов до
лечения, после лечения ЧРа2ИФН и после
сезона палиниации 114-116
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 117-130
Выводы 131-132
Практические рекомендации 133
Список литературы
- Эффекты и механизмы действия интерферонов
- Интерфероны в практической медицине
- Методы аллергологического обследования
- Оценка показателей интерферонового статуса у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Поллиноз (лат. pollen - пыльца) занимает одно из ведущих мест в структуре аллергических состояний [2, 46]. В различных странах мира поллинозами по разным данным страдает от 0,2 до 39% населения [17]. Около 30-38% населения подвержены одному из самых тяжёлых клинических проявлений поллиноза -бронхиальной астме [56].
Медико-социальное значение поллиноза обусловлено его широкой распространенностью и отрицательным влиянием на качество жизни пациентов [25]. Это связано с тем, что бронхиальная астма и аллергический ринит, существенно влияя на качество жизни больного, ограничивают его физические, психические и социальные возможности. Взаимосвязь двух этих заболеваний становится предметом обсуждения многих специалистов, о чем свидетельствуют многочисленные публикации в отечественной и зарубежной печати. Актуальность проблемы подчеркивается также в документе Всемирной организации здравоохранения «Allergic rhinitis and its impact on asthma» (2006) [90].
Многочисленными исследованиями было показано, что в
результате аллергического воспаления, протекающего при
участии тучных клеток, эозинофилов, лимфоцитов, базофилов
происходит повышение секреции слизи, отёк слизистой оболочки,
угнетение функции мерцательного эпителия дыхательных путей,
спазм гладкой мускулатуры, что приводит к затруднению
дыхания [7]. Современные представления об иммунологических
аспектах патогенеза аллергических заболеваний, в том числе
поллиноза, свидетельствуют о ключевой роли в механизме
развития аллергических реакций I типа, дисбаланса в системе
субпопуляций Thl/Th2-лимфоцитов, опосредованного
цитокиновым профилем [71]. Две конкурирующие субпопуляции Т-хелперов способны противодействовать дифференцировке и активации альтернативной субпопуляции: интерферон гамма (IFN-y) ингибирует развитие ТЬ2-клеток, интерлейкин-4 (IL-4) -Thl-лимфоцитов [74]. Современные подходы к лечению аллергических заболеваний заключаются в попытке изменить соотношение между Thl и Тп2-клетками, т.е. подавить созревание Тп2-клеток, которые продуцируют цитокины, отвечающие за синтез реагинов В-лимфоцитами (IL-4 и 13) и активацию эозинофилов (IL-3, IL-5, GM-CSF, RANTES), инициировать дифференцировку ТЫ-клеток, что дало бы возможность заблокировать синтез IgE и предотвратить развитие вышеперечисленных реакций и, соответственно, симптомов аллергии [25, 71].
До настоящего времени единственной терапевтической стратегией лечения поллиноза, эффективность которой доказана, остаётся специфическая иммунотерапия с применением цельных аллергенов, однако применение этого метода лечения ограниченно из-за ассоциированного с ним высокого риска системного побочного действия [22, 91], а клиническая эффективность аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ), по данным разных авторов, достигается только в 70-90% [36].
В последнее время появились публикации о применении интерферона альфа (IFN-a) в комплексной терапии атопических заболеваниий, а также в качестве сопутствующей терапии при специфической десенсибилизации больных аллергией (т.н. форсифицированная АСИТ).
В экспериментальном исследовании на мышах, сенсибилизированных к аллергенам пыльцы амброзии, впервые было показано, что оромукозальное применение IFN-a, даже в самых высоких дозах (104 и 105 ME), не вызывало таких побочных эффектов как лейкопения или миелосупрессия,
которые возникают, как правило, при парентеральном введении той же самой дозы IFN-a.
По данным авторов Meritet J.F.at all (2001) оромукозальное введение IFN-a, в дозе 1000 ME оказалось столь же эффективным, как и его парентеральное введение, т.е. отмечалось снижение, хотя и не столь выраженное, как при парентеральном введении, продукции специфических IgE и задействованных эозинофилов, проявляющееся в подавлении воспаления и гиперреактивности дыхательных путей. Предполагается, что терапевтические эффекты оромукозального применения IFN-a связаны с активацией клеточного иммунитета в лимфоидной ткани полости рта, а не с всасыванием нативного IFN [196).
Приведенные данные об иммунологических механизмах патогенеза поллиноза и эксперементальной эффективности оромукозальных низких доз IFN-a при поллинозе, позволяют рекомендовать новый подход к патогенетическому лечению IgE-опосредованного заболевания, препятствующему развитию аллергического воспаления в дыхательных путях у больных бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом во время палинации.
При наличии достаточных доказательств клинико-иммунологической эффективности применения низких доз а2-интерферона в контролируемых исследованиях, могут быть внесены соответствующие дополнения в схемы базисной профилактической терапии поллиноза.
Цель исследования
Изучить маркёры аллергического воспаления и показатели системы IFN при бронхиальной астме и аллергическом риноконъюнкгавите и оценить эффективность иммунокоррегирующей терапии с использованием низких доз ЧРа2ИФН.
Задачи исследования
Изучить маркёры аллергического воспаления и интерфероновый статус у длительно болеющих больных пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитом за 1 месяц до начала клинических проявлений.
Исследовать маркёры аллергического воспаления и интерфероновый статус у длительно болеющих больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом в динамике (за 1 месяц до начала клинических проявлений, после лечения низкими дозами ЧРа2ИФН и после сезона цветения деревьев).
3.Оценить эффективность действия низких доз ЧРа2ИФН на клинические симптомы пыльцевой бронхиальной астмы в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом.
4. Оценить эффективность влияния низких доз ЧРа2ИФН на динамику показателей цитокинов (TFN-y, TNF-cc, IL-4, TL-5), IgE общего, IgE аллергенспецифических, ЕСР, концентрацию NO в выдыхаемом воздухе, ФВД.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Повышение показателей ЕСР и N0 в выдыхаемом воздухе, выявляемые за месяц до предполагаемого клинического обострения, свидетельствуют о субклиническом воспалении дыхательных путей у больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом.
Недостаточность а- и у- звеньев системы IFN, выявленная у длительно болеющих больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом и изолированным пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитом, определяет неэффективность АСИТ.
Применение низких доз ЧРа2ИФН (2000 ME) оромукозально стимулирует а- и у- звенья системы IFN, способствует повышению
сывороточного IFN-y, снижению EL-5, уменьшению степени воспаления в дыхательных путях, о чём свидетельствует снижение ЕСР в сыворотке крови при пыльцевой бронхиальной астме в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом.
Научная новизна
Впервые:
І.При нормальных клинико-функциональных параметрах, выявлено имеющееся субклиническое течение воспаления в нижних дыхательных путях, что подтверждается изменением маркёров воспаления и цитокинового профиля.
2. Обоснована необходимость применения препаратов
интерферонового ряда для оптимизации профилактической терапии у длительно болеющих больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом при выявлении низких показателей а- и у- звеньев системы EFN и повышенных показателях маркёров аллергического воспаления.
3.Показано, что ЧРа2ИФН, применяемый оромукозально в низких дозах, обладает системным иммунотропным действием, о чём свидетельствует повышение уровня продукции лейкоцитами IFN-a и EFN-y in vitro, увеличение содержания в крови уровня сывороточного IFN-y и уменьшение IL-5, снижение количества В-лимфоцитов и показателей ЕСР в сыворотке крови, что соответствует клиническому улучшению.
Практическая значимость
Выявление за месяц до начала клинических проявлений снижения показателей а- и у- звеньев системы IFN и повышение ЕСР у длительно болеющих больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом позволяют судить о субклиническом течении воспаления в дыхательных путях требующего соответствующей терапии.
Разработана схема профилактического применения ЧРа2ИФН у больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом, включающая дозы, способ, длительность и частоту введения препарата.
Применение в профилактических целях низких доз ЧР<х2ИФН (2000 ME) оромукозально за месяц до предполагаемого клинического обострения у длительно болеющих больных пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом, облегчает симптомы пыльцевой бронхиальной астмы в сочетании с аллергическим риноконъюнктивитом в сезон палинации.
Внедрение в практику здравоохранения
Полученные результаты позволяют рекомендовать больным, длительно страдающим поллинозом, проводить анализ маркёров аллергического воспаления и IFN-статуса, что внедрено в работу врачей аллергологов аллергокабинета и аллергоотделения 57 ГКБ г. Москвы, ИАКИ г. Москвы.
Разработан и апробирован метод профилактического лечения респираторных нарушений, обусловленный аллергенами пыльцы деревьев. Метод профилактической иммунокорекции препаратом ЧРа2ИФН, как сопутствующий в терапии поллиноза, внедрён в работу врачей аллергологов аллергокабинета и аллергоотделения 57 ГКБ г. Москвы, ИАКИ г. Москвы.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: XVII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007); Международной конференции посвященной 50-летию открытия интерферонов (Оксфорд, 2007); на итоговых научных сессиях ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (Москва 2006,2007); на совместной конференции ФГУ «НИИ
пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 2007).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 1 статья в периодическом рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 270 источников, в том числе 83 отечественных и 187 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами, 8 рисунками.
Эффекты и механизмы действия интерферонов
Действие IFN реализуется по сетевому принципу, т.е. передаваемая клеткой информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных цитокинов. Один медиатор часто вызывает секрецию мишени второго клеткой-мишенью и т.д., что получило название цитокинового каскада. Включение каскада обусловливает синэргетические или антагонистические действия медиаторов, индукцию выработки ими друг друга, а также трансмодуляцию поверхностных рецепторов к другим медиаторам.
Многообразие обнаруженных и изученных к настоящему времени физиологических функций интерферонов несомненно указывает на их контрольно-регуляторнуїо роль в сохранении гомеостаза организма. Очевидно, что участие системы IFN в поддержании гомеостаза обусловлено антигенами, подключающими эту систему к активной функциональной деятельности.
Спектр основных биологических эффектов интерферонов включает в себя: подавление размножения внутриклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие); антипролиферативную активность; противоопухолевый эффект; антимутагенный эффект; антитоксическое действие; радиопротективный эффект; подавление или усиление продукции антител; индукцию процессов дифференцировки и пролиферации лимфоцитов и макрофагов, усиление фагоцитоза; усиление формирования антигенов главного комплекса гистосовместимости; усиление или ингибиция активности ряда клеточных ферментов; усиление цитотоксического действия двухнитевых РНК (усиление цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени); активацию NK-клеток; подавление гиперчувствительности замедленного типа; многочисленные изменения клеточных мембран; стимуляцию выработки факторов и молекул адгезии [31].
Исследования последних лет открывают новые свойства системы IFN, напрямую или косвенно связанные с функционированием иммунной системы (регуляция активности трофобластов), нейроэндокринные функции (IFN подобны гормонам, оказывают действие на клетку-продуцент (аутокринное действие) и на соседние с ней клетки, а также на отдаленные от нее клетки (эндокринное действие) [72].
Антивирусный и антипролиферативный эффекты IFN связывают с их способностью ингибировать процессы транскрипции и трансляции вирусного генома, т.е. синтез вирусспецифических белков, распознавая и дискриминируя вирусные информационные РНК от клеточных с помощью 2 ,5 олигоаденилатсинтетазы —- фермента, синтезирующего 2 5 олигоадениловую кислоту, которая в конечном итоге приводит к активации латентных нуклеаз, в частности, специфической внутриклеточной рибонуклеазы, разрушающих свободные вирусные иРНК [26, 32]; индукции синтеза двухцепочечной РНК зависимой протеинкиназы (double-stranded dependent protein kinase (PKR)), фосфорилирующей один из инициирующих факторов трансляции, препятствуют образованию миксовирусоустойчивого протеина (Мх-белка) [173], что обусловливает прекращение репликации вирусов (антивирусный эффект) [61, 251] или торможение размножения клеток (антипролиферативный эффект) [102, 31].
При атопии наиболее важным являются иммуномодулирующие эффекты IFN, которые различными путями действуют на клетки иммунной системы, изменяя их клеточную поверхность, продукцию и секрецию внутриклеточных белков, функциональную активность лимфоцитов и стимулируют или ингибируют функцию эффекторных клеток.
Среди проявлений иммуномедиаторных свойств IFN разных типов (а, р и у) выделяют: увеличение числа Fc-рецепторов к IgG на мембранах макрофагов, что способствует выполнению таких важных функций, как фагоцитоз и антителозависимая цитотоксичность; усиление экспрессии на поверхности клеток антигенов МНС 1-го класса под действием IFN-a/p.; ингибиция Т-супрессоров под действием IFN-a/p и активация их с индукцией синтеза растворимого фактора супрессии иммунного ответа под действием IFN-y; усиление экспрессии антигенов МНС II класса под действием IFN-y, приводящее к увеличению функциональной активности антигенпрезентирующих клеток (моноциты, дендритные клетки), увеличению субпопуляции Thl-лимфоцитов, ответствененых за продукцию провоспалительных цитокинов, в частности, TNF и IFN-y, усиливающих экспрессию антигенов этого класса на макрофагах, активацию NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов; способствуют рекрутированию эффекторных клеток путем модулирования процессов их дифференцировки, созревания и пролиферации; становлению гуморального иммунитета; IFN-y является незаменимым фактором дифференцировки В-клеток.
Под действием IFN происходит усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности нейтрофилов без участия Fcy-рецепторов за счет активации 02-независимого пути киллинга опухолевых клеток.
Интерфероны в практической медицине
Благодаря универсальному участию цитокинов в реакциях гомеостаза, решением комиссии США «Food and Drug Administration for human use» к применению в качестве лечебных препаратов допущены такие цитокины, как IFN-oc, IFN-P и IFN-y, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин, IL-2, IL-11. В последнее время появились работы по применению ингибитора TNF-a и антител к растворимой форме его рецептора при различных аутоиммунных и некоторых других заболеваниях [141, 216].
На сегодняшний день лидирующие позиции среди используемых для иммунорегуляции препаратов, занимают IFN. Это связано с их влиянием на процессы дифференцировки, рекрутирования, а также функциональную активность эффекторных клеток иммунной системы и прежде всего Т-лимфоцитов и моноцитов/макрофагов. Под воздействием IFN повышается эффективность иммунного распознавания антигенами, усиливаются фагоцитарная и цитолитическая функции, направленные на элиминацию возбудителя или антигенно измененных клеток [44, 64].
В клинической практике используются как природные IFN, так и рекомбинантные, но использование природных IFN сильно ограниченно, так как субстрат для их получения - донорская кровь очень дефицитное и дорогое сырьё, кроме того, при использовании донорской крови возможна контаминация её такими инфекционными агентами как вирусы гепатитов, ВИЧ [31].
Природные IFN различают по типу интерферона на IFN-a (человеческий лейкоцитарный IFN, лейкинферон), IFN-P (человеческий фибробластный IFN, ферон), IFN-y (человеческий иммунный IFN), комбинированные препараты (комбинации разных типов IFN), комплексные препараты (IFN в сочетании с другими медиаторами). По источнику получения природные интерфероны подразделяют на лейкоцитарные и лимфобластойдные.
К рекомбинантным IFN относиятся реаферон, роферон А, виферон, интрон-А, риальдирон, берофор, бетаферон, ингарон, гаммаферон.
IFN-a обладает противовирусным, противоопухолевым и иммуномодулирующим эффектом. Все его препараты состоят из 165 аминокислот, но отличаются по содержанию одной или двух аминокислот, в связи с этим, выделяют а2а, а2ь «2С интерфероны, между которыми существенных различий в биологических эффектах не выявлено [64, 26].
Эффективность действия иммуномодуляторов определяется особенностями иммунной системы, в частности, взаимосвязанным и взаимозависимым функционированием клеточных элеменов, участвующих в развитии иммунного ответа, что определяет отвечаемость многих форм иммуноцитов на иммуномодулятор. В связи с этим представляется крайне важным предварительное вычленение основного пораженного звена иммунитета и адресная доставка иммуномодуляторов, так как в противном случае, применение иммуномодулирующих средств, по меньшей мере, может быть неэффективным.
Известно, что не все виды клеток, даже в пределах одной клеточной популяции, обладают одинаковой чувствительностью к IFN, а наличие нечувствительных клеток препятствует проявлению эффектов IFN [27].
Врачу, назначающему больному препарат интерферона, необходимо решить вопрос не только о целесообразности назначения препарата, его дозировке, но и выбрать оптимальный путь введения. Продолжительность лечения, дозы и лекарственная форма препарата определяются целью применения (профилактика или лечение) и тяжестью заболевания.
Считают, что индивидуальная чувствительность к действию иммуномодуляторов находится под генетичским контролем [50].
Во многих случаях целесообразно местное применение IFN, что позволяет избежать побочных явлений, наблюдающихся при неоправданном системном введении высоких доз IFN, и добиться активации органоспецифических субпопуляций эффекторных клеток иммунной системы с минимальным расходом препарата.
Заболевания, при которых показано использование рекомбинантных IFN, можно разделить на 3 большие группы: вирусные инфекции, онкологические заболевания и другие патологии [31, 235, 258, 145].
IFN оказались высокоэффективными при герпетических поражениях (кератиты и кератоконъюнктивиты, герпес гениталий, опоясывающий лишай) [77, 148, 184], острых [161], хронических вирусных гепатитах [247, 269, 237, 143, 259], гриппе [38] и других ОРВИ [229, 176, 82], СПИДе, папилломавирусных инфекциях (остроконечные кондиломы, ювенильный папилломатоз гортани, генитальных бородавках), вирусных осложнениях при пересадке органов и при примененении иммунодепрессантов, гнойно-септических заболеваниях новорожденных, постнатально приобретенной хронической цитомегаловирусной инфекции; псориазе, эпидемическом паротите, рассеянном склерозе и при различных бактериальных заболеваниях (хламидиозы, легионеллезы, листереллезы, риккетсиозы).
Методы аллергологического обследования
Аллергологические пробы проводили в ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России методом укола (prikest) на внутренней поверхности кожных покровов предплечья или на коже спины. Результаты диагностических проб оценивали через 15-20 минут (реакция немедленного типа) и повторно оценивали через 48-72 часов (реакция замедленного типа). Специфическая реакция на аллерген оценивалась только при отсутствии реакции на тест - контрольную жидкость и при наличии положительной пробы на гистамин (табл. 1). Техника постановки кожных тестов, показания и противопоказания к их проведению, а также оценка результатов тестирования проводилась согластно общепринятой методики, указанной в Методическом письме А.Д. Адо и сотр. («Применение аллергенов неинфекционного происхождения для специфической диагностики и десенсибилизации больных аллергическими заболеваниями», М., МЗ СССР, 1969) в соответствии с методическими рекомендациями Минздрава СССР №10-11/20 от 10.03.85 года. Для проведения тестирования использовался набор стандартных бытовых, эпидермальных аллергенов выпускаемых НИИ вакцин и сывороток им. Н.И. Мечникова РАМН; пыльцевых аллергенов, произведенных ФГПУ «НПО «Микроген» МЗ РФ».
Для диагностики сенсибилизации к аллергенам пыльцы деревьев больным проводили кожный prikest с аллергенами пыльцы берёзы, пыльцы орешника (лещины), пыльцы дуба, пыльцы ольхи содержащими по 10.000 PNU/мл.
Определение уровня общего IgE проводилось в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Определение уровня общего IgE проводили с использованием набора реагентов для количественного иммуноферментного определения общего IgE в сыворотке крови фирмы ООО «ЦКФФ» (Россия, Ставрополь) в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень общего IgE у взрослых брали значения ниже 100 кЕ/л. [Kjellman N-IM, Johansson. S.G.O., A. Roth. Clinical Allergy, 1976, 6 p.51.].
Определение содержания IgE-специфических антител к аллергенам пыльцы деревьев проводилось в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Определение содержания IgE-специфических антител к аллергенам пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина, ясень, дуб -фирмы ООО «ЦКФФ» (Россия, Ставрополь)) проводили с помощью метода ИФА, разработанного в лаборатории аллергодиагностики ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН. В качестве конъюгата использовали анти-IgE-MKAT, меченные пероксидазой хрена (000 «Полигност» г. С-Петербург, Россия). Содержание аллергенспецифических IgE-AT в исследуемых сыворотках определяли в классах реакции и оценивали их по значениям оптической плотности исследуемых образцов в сравнении с IgE стандартом (Dr. Fooke) (табл. 2). Определение иммунных комплексов, состоящих из IgE и анти - IgE IgG4 AT проводилось в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Определение иммунных комплексов, состоящих из IgE и анти -IgE IgG4 AT, в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, в лаборатории аллергодиагностики НИИВС им И.И. Мечникова РАМН. Методику ИФА была модифицирована, путем использования разных МкАТ (НПО «Полигност», С-Петербург) на твердой фазе и в составе конъюгата. Исследования по разработке тест-системы включали получение калибровочной кривой, отработку доз и параметров сорбции МкАТ анти - IgE, оптимального разведения aHTH-IgG4 МкАТ и сывороток. На твердую фазу сорбировали МкАТ анти - IgE (в дозе 20 мкг/мл), в течении 18 часов при 37С, вносили исследуемые образцы, в соотношении 1:19, которые были получены экспериментальным путем для определения аллергенспецифических IgG4 AT. Инкубацию проводили в течение часа при 37С. После 3-х кратного отмывания фосфатно-солевым буфером с твином, связавшиеся с анти - IgE комплексы детектировали с помощью пероксидазного конъюгата МкАТ класса IgG4 (в разведении 1:2000). Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидина (ТМБ). После остановки реакции 2N H2S04 оптическую плотность измеряли на фотометре Anthos-2010 (Австрия) при длине волны 450 нм (ОП450). Количественный учет искомых AT осуществляли по калибровочной кривой зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации IgG4-АТ к аллергенам в калибровочном реагенте (фирмы Dr. Fooke, Германия). Единицы измерения комплекса IgE-IgG4 нг/мл.
Оценка показателей интерферонового статуса у пациентов с поллинозом за месяц до начала клинических проявлений
В период ремиссии всем обследуемым были проведены кожные prikest в результате которых была выявлена в изучаемых группах аллергия к пыльцевым аллергенам деревьев (ольха, лещина, берёза, дуб). Интенсивность реакции варьировала от 1 до 4 плюсов, в среднем составив 3 плюса (табл. 5).
Уровень IgE-AT к аллергенам пыльцы деревьев (дуб, ольха, ясень, лещина, берёза) в среднем у пациентов с пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитомом составил 1.2 балла, у пациентов с пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитомом 1.3 (табл. 6).
У всех исследуемых групп уровень IgE общ. был выше нормы (норма до 100 кЕ/л). У пациентов с пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим ринокопъюнктивитом в среднем уровень IgE общ. составил 298.59±543.27 кЕ/л, что более чем в 2 раза выше чем в группе больных с изолированным пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитом, где IgE общ. составил в среднем 143.42±139.95 кЕ/л.
Во П-ой группе, в группе больных с изолированным пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитомом, отмечался более высокий показатель комплекса IgE-IgG4 в среднем равный 1693.46±1489.93 нг/мл, что практически в 2 раза выше, чем у пациентов с пыльцевой бронхиальной астмой в сочетании с пыльцевым аллергическим риноконъюнктивитомом, который составил 859.21±576.64 нг/мл за месяц до начала клинических проявлений (табл. 7). У всех пациентов определялись показатели интерферонового статуса за месяц до начала клинических проявлений. Исследовались следующие параметры: продукция IFN-a, индуцируемая вирусом болезни Ньюкасла (ВБН); продукция IFN-y, шадуцируемая фитогемагтлютинином (ФГА); уровень циркулирующего IFN в плазме крови; уровень спонтанно продуцируемого IFN.
У всех пациентов I и II групп фиксировались сниженная способность лейкоцитов к стимулированной in vitxo продукции как IFN-a, так и IFN-y. Показатели сывороточного IFN и спонтанного IFN у пациентов в группах были в пределах нормы (рис. 1).
У всех пациентов 1-ой и П-ой групп отмечен низкий уровень продукции IFN-a и IFN-y in vitro. Количество стимулированного IFN-a у пациентов 1-ой группы в среднем 126.47±88.72 Ед/мл (при норме от 640 до 1280 Ед/мл); у пациентов П-ой группы составило 123.08±74.98 Ед/мл; что является проявлением недостаточности а-звена системы EFN у исследуемых групп больных; количество стимулированного in vitro IFN-y также значительно отставало от нижней границы физиологической нормы - в среднем было 10.18±6.37 Ед/мл в 1-ой группе и 11.31±6.37 Ед/мл - во П-ой группе (норма 64 -128 Ед/мл). Таким образом, у больных 1-ой и П-ой групп, два основных показателя функциональной активности системы IFN, в среднем, оказались в 5 раз ниже нижней границы нормы.
Показатели сывороточного IFN и спонтанная продукция интерферонов лейкоцитами в 1-ой и Н-ой группах были в пределах нормы. Продукция сывороточного 1FN в норме колеблется (от 2 до 8 Ед/мл (в среднем 5±3); у пациентов 1-ой группы этот показатель в среднем составил 3.88±3.07 Ед/мл, а у пациентов П-ой группы -4.15±4.08 Ед/мл. Спонтанная продукция интерферонов лейкоцитами у пациентов 1-ой группы в среднем составила 1.29±0.97 Ед/мл (норма меньше 2 Ед/мл (в среднем 0)) у пациентов П-ой группы составил 0.54±0.90 Ед/мл.
