Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр. 15
1.1. Современные представления об этиопатогенезе и лекарственной терапии бронхиальной астмы стр. 15
1.1.1. Определение и эпидемиология бронхиальной астмы стр. 15
1.1.2. Основные аспекты этиологии и патогенеза бронхиальной астмы стр. 16
1.1.3. Современная фармакотерапия бронхиальной астмы стр.23
1.1.4. Перспективы создания новых лекарственных средств для терапии бронхиальной астмы стр. 32
1.2. Фосфолипиды: структурно-функциональные особенности и применение в клинике внутренних болезней стр.33
1.2.1. Структурно-функциональные свойства фосфолипидов стр.33
1.2.2. Повреждение биологических мембран и их репарация с помощью фосфолипидов стр.37
1.2.3. Лекарственные средства на основе фосфолипидов стр.41
1.2.4. «Фосфоглив» - лекарственная композиция на основе соевого фосфатидилхолина и глицирризиновой кислоты ...стр.43
1.2.5. Применение фосфолипидных препаратов в пульмонологии стр.47
Глава 2. Материалы и методы исследования стр.48
2.1. Общая характеристика пациентов стр.48
2.2. Дизайн и протокол проведения исследования стр.53
2.3. Характеристика исследуемых групп стр.57
2.4. Методы обследования стр.59
Глава 3. Результаты собственных исследований стр.67
3.1. Методика ингаляционного введения препарата «Фосфоглив» стр.67
3.2. Клинико-функциональные данные стр.70
3.3. Клинико-лабораторные данные стр. 80
3.4. Оценка безопасности ингаляционного введения препарата «Фосфоглив» стр.96
3.5. Клинический пример стр.96
Глава 4. Обсуждение полученных результатов стр.103
Выводы стр.120
Практические рекомендации стр.121
Список литературы стр.122
- Основные аспекты этиологии и патогенеза бронхиальной астмы
- Повреждение биологических мембран и их репарация с помощью фосфолипидов
- «Фосфоглив» - лекарственная композиция на основе соевого фосфатидилхолина и глицирризиновой кислоты
- Методика ингаляционного введения препарата «Фосфоглив»
Введение к работе
Актуальность проблемы
Бронхиальная астма (БА) в настоящее время относится к числу
наиболее распространенных заболеваний дыхательных путей (GINA, 2002;
Чучалин А.Г., 2002). Так, среди взрослого населения болезнь регистрируется
более чем в 5% случаев (Chinn S., et al., 1997); у детей - до 10% (ISAAC,
1998). Согласно официальным статистическим данным
Минздравсоцразвития РФ, в России БА страдают не более нескольких сотых долей процента населения. Однако проведенные независимые эпидемиологические исследования (Т.Н. Биличенко, 1997; Емельянов А.В., Федосеев Г.Б., 2002; Можина Л.Н., 2005) показывают, что распространенность Б А в РФ составляет 5-9%, то есть находится на том же уровне, что и в странах Западной Европы. Таким образом, общее число больных БА в стране приближается к 7 млн. человек, и далеко не все из них получают достаточно эффективное лечение, как в период обострения, так и в период ремиссии.
Во многих руководствах по лечению и профилактике БА, основным из которых является GINA, приводится схема ступенчатой терапии БА с использованием следующих основных препаратов: ИГКС, ингаляционных р2-агонистов (в том числе и ДДБА), теофиллинов, антилейкотриеновых препаратов и пероральных ГКС и р2-агонистов. При этом, однако, признается недостаточная эффективность вышеперечисленных лекарственных средств для достижения полного контроля над симптомами БА у всех пациентов (Barnes P.J. et al., 1998), а также отмечается возможность развития нежелательных побочных реакций (Toogood J.H., 1990; Brown Р.Н. et al.,1993; Robinson D.S. et al., 1996; Lipworth B.J., 1999).
Это, безусловно, не означает, что следует полностью отказаться от применения хорошо зарекомендовавших себя лекарственных средств, чья эффективность подтверждена крупномасштабными рандомизированными
плацебо-контролируемыми испытаниями (уровень доказательности А), однако заставляет задуматься о возможности создания новых лекарственных средств, применение которых в сочетании с традиционной терапией, в достаточной мере подавляло бы аллергическое воспаление при БА, обеспечивая тем самым максимальный контроль симптомов заболевания.
Базисные противовоспалительные препараты, способны эффективно контролировать воспаление при БА, однако не в состоянии восстановить поврежденные ранее клетки. Это могут сделать лекарственные средства на основе фосфолипидов (Ипатова О.М., 2005), поэтому изучение их эффективности и безопасности в клинике является чрезвычайно актуальным.
Одним из перспективных направлений разработок в этой области стало создание лекарственных средств, не только влияющих на генерацию АФК при бронхиальной астме, но и имеющих высокую местную биодоступность. Общеизвестно, что такие высокоэффективные препараты, как ИГКС, имеют достаточно низкую липофильность, и, как следствие, низкую биодоступность - при ингаляционном пути введения препаратов в легких откладывается приблизительно 10—30% номинальной дозы (Wurthwein G., 1992; Derendorf Н., 1997; Цой А.Н., 1999). Это обуславливает особенности их фармакокинетики и заставляет практикующих врачей использовать ИГКС в более высоких дозировках, чем это в действительности необходимо. Указанное обстоятельство послужило обоснованием идеи применения фосфолипидных препаратов в пульмонологии, в частности, для лечения БА.
Молекулы фосфолипидов сами по себе не только обладают высоким сродством к мембране клеток, выстилающих дыхательные пути, но и, помимо этого, способны нейтрализовать образующиеся в процессе воспаления свободные радикалы, превращая их в неактивные молекулы. Помимо этого, включение в состав лекарственного средства противовоспалительного компонента, обладающего противовирусной и иммуномодулирующей активностью, безусловно, повысило бы эффективность комбинированного лекарственного препарата при лечении
обострения БА, особенно если они вызваны патогенными микроорганизмами.
В НИИ Биологической и медицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН с начала 1980-х годов проводились исследования в области структуры и функции фосфолипидов (Арчаков А.И., 1983), и была создана и запатентована лекарственная композиция на основе соевого фосфатидилхолина (репарирующий эффект) и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты (противовирусный и иммуномодулирующий эффекты). Комбинированный лекарственный препарат получил название «Фосфоглив» (Патенты РФ №2043110 от 10.09.1995 и №2133122 от 14.10.98; регистрационный номер Р №002528/02, сертификат соответствия № РОСС ІШ.ФМ02.А23589 от 29.12.2004), поскольку изначально планировалось его применение для лечения только заболеваний печени.
Растительный фосфатидилхолин, входящий в состав «Фосфоглива», отличается высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, в частности, линолевой и линоленовой. Это делает его более жидким, чем обычный мембранный фосфатидилхолин, позволяя выполнять роль «мембранного клея», способного репарировать дефекты поврежденных клеточных мембран (Арчаков А.И., 1986; Bachmanova G.I., 1989). Восстановление структуры мембраны ведет к восстановлению ее функции, что, в конечном итоге, положительно отражается на метаболизме клетки в целом (Арчаков А.И., 1986; Bachmanova G.I., 1989; Ипатова О.М., 2005). Особое значение это свойство фосфатидилхолина приобретает в условиях перекисного окисления липидов (ПОЛ), обусловленного генерацией АФК, образующихся в ходе воспалительной реакции и оксидативного стресса (Буеверов А.О., 2002; Salvemini D. et al., 2002).
Другой компонент «Фосфоглива» - глицирризиновая кислота - обладает широким спектром биологической активности, не все механизмы которой выяснены достаточно подробно. Основным в ее действии является иммуномодулирующий эффект, заключающийся в повышении фагоцитоза
нейтрофилов и активности естественных киллеров, а также способности продуцировать гамма-интерферон (Abe N. et al., 1982). Также показано антиоксидантное действие глицирризиновой кислоты (Dragland S. et al., 2003).
В доклинических испытаниях «Фосфоглива», проведенных в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию в лаборатории лекарственной токсикологии под руководством профессора Е.В. Арзамасцева, была показана его высокая эффективность на моделях острого и хронического гепатита у крыс, а также отсутствие острой и хронической токсичности, мутагенности, канцерогенности и эмбриотоксичности (Ипатова О.М., 2005). Полученные результаты по мембран-репарирующему действию «Фосфоглива» при экспериментальных гепатитах, а также отсутствию токсичности и негативных воздействий на клетки, послужили основанием для получения разрешения Фармакологического Государственного Комитета РФ на его клинические испытания (протокол №11 от 04.07.96).
В ходе пилотных клинических исследований, выполненных на базе ФГУ «НИИ пульмонологии РОСЗДРАВА», было выявлено, что ингаляционное введение «Фосфоглива» снижает уровень выдыхаемого оксида азота у больных бронхиальной астмой в период ремиссии (Лисица А.В., Соодаева С.К., 2004), что свидетельствует о влиянии этого препарата на процессы аллергического воспаления при БА. В связи с этим чрезвычайно интересной и актуальной является проблема углубленного изучения клинико-функционального статуса пациентов с БА, получающих «Фосфоглив» путем ингаляционного введения. Еще более перспективной представляется оценка оксидантно-антиоксидантного статуса больных БА с помощью как неинвазивных методов (измерение NO в выдыхаемом воздухе, сбор КВВ), так и в крови (нитраты/нитриты, АОА и др.).
Исследование влияния препарата «Фосфоглив» на клинические проявления БА у пациентов, а также его противовоспалительного действия
на основании оценки оксидантно-антиоксидантного статуса больных БА, разработка методов ингаляционного введения препарата, внедрение методики в повседневную клиническую практику являются актуальными проблемами современной медицинской науки и здравоохранения, имеют высокую социальную значимость и обуславливают цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Оценить эффективность и безопасность ингаляционного введения липосомальных лекарственных средств как противовоспалительных препаратов у больных бронхиальной астмой в период обострения в сравнении с больными, получающими традиционную терапию.
Задачи исследования
Разработать методику ингаляционного введения липосомальных препаратов с использованием ингаляторов типа небулайзер и провести титрование дозы.
Оценить в динамике влияние ингаляционного введения липосом на клинические и клинико-функциональные показатели обострения бронхиальной астмы в сравнении с группой плацебо.
Дать сравнительную оценку динамики содержания маркеров воспаления в выдыхаемом воздухе и в конденсате выдыхаемого воздуха, а также показателей состояния оксидантно-антиоксидантной активности в крови у пациентов с обострением бронхиальной астмы, получающих традиционную и традиционную+липосомальную терапию.
Оценить, в сравнении с плацебо, безопасность и переносимость курса лечения липосомальными препаратами у больных бронхиальной астмой среднетяжелого течения в период обострения.
Научная новизна
В представленной работе впервые:
предложена методика лечения больных, переносящих обострение бронхиальной астмы, с помощью ингаляционного введения лекарственных средств, содержащих фосфолипиды и глицирризиновую кислоту;
проведено проспективное, рандомизированное, простое слепое, плацебо-контролируемое исследование в параллельных группах с целью оценки эффективности и безопасности применения указанной методики у данной группы пациентов;
получены данные о влиянии ингаляционного введения липосом на клинико-функциональные показатели у больных, переносящих обострение бронхиальной астмы;
получены данные о выраженном положительном влиянии ингаляционного введения липосомальных препаратов на маркеры воспаления и показатели оксидантно-антиоксидантной активности при обострении бронхиальной астмы;
- получены данные о безопасности и переносимости курса лечения
липосомальными препаратами у больных, переносящих обострение
бронхиальной астмы.
Практическая значимость
Полученная в ходе выполнения работы информация об эффективности и безопасности ингаляционного применения липосомальных препаратов в комплексной терапии пациентов с бронхиальной астмой в период обострения позволяет расширить спектр лекарственных препаратов, применяемых в настоящее время для лечения этого состояния, за счет добавления ингаляций «Фосфоглива» к курсу традиционной терапии.
Внедрение в клиническую практику методики ингаляционного введения липосомальных препаратов позволит уменьшить дозы применяемых глюкокортикостероидных препаратов (как системных, так и
ингаляционных) за счет более быстрого и эффективного подавления аллергического воспаления в стенке респираторного тракта.
Практическое использование предлагаемой методики будет способствовать оптимизации лечения среднетяжелой бронхиальной астмы, а также позволит эффективнее контролировать симптомы аллергического воспаления и уменьшить объем симптоматической терапии.
Внедрение в практику
Разработана и апробирована методика комбинированного лечения обострения бронхиальной астмы с использованием ингаляционного введения липосомальных препаратов. Предложенный метод лечения бронхиальной астмы, результаты и выводы данной работы используются в лечебной работе ФГУ «НИИ пульмонологии РОСЗДРАВА» и кафедры госпитальной терапии п/ф ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА. Метод (на фоне базисного лечения обострения БА) внедрен в работу отделений терапевтического профиля ГКБ№ 57 г. Москвы, в частности, аллергологического, пульмонологического, и 2-го терапевтического отделений. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры пульмонологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА, научно-исследовательской работе ФГУ «НИИ пульмонологии РОСЗДРАВА».
Апробаиия работы
Основные положения данной работы, а также материалы исследования были представлены и обсуждены на:
- XIII, XIV, XV Национальных конгрессах по болезням органов
дыхания (Санкт-Петербург, 2003; Москва, 2004, 2005);
Ежегодных конгрессах Европейского Респираторного общества ERS Annual Congress (Glasgow, 2004, Copenhagen 2005);
3-ем Конгрессе Европейского региона Международного Союза по борьбе с туберкулезом и легочными заболеваниями (Москва, 2004);
«Национальной Школе по свободнорадикальным механизмам» (Суздаль, 2005);
Совместной конференции сотрудников кафедры госпитальной терапии п/ф ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА, ФГУ «НИИ пульмонологии РОСЗДРАВА» и практикующих врачей ГКБ № 57 (Москва, 2006).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 5 журнальных статей (3 - в ведущих рецензируемых журналах согласно перечню ВАК Минобразования и науки РФ), 9 тезисов национальных и европейских конгрессов, из них 5 - в зарубежной печати (European Respiratory Journal).
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 143 страницах печатного текста, состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 46 отечественных и 167 зарубежных источников. В работу включено 10 таблиц и 23 рисунка. Диссертация изложена на русском языке.
Основные положения, выносимые на защиту
Ингаляционное введение липосомальных препаратов является патогенетически обоснованным методом лечения обострения бронхиальной астмы, о чем свидетельствует статистически значимое снижение маркеров оксидативного стресса по сравнению с плацебо.
Использование ингаляционного введения липосомальных препаратов в дополнение к традиционной терапии обострения бронхиальной астмы является более эффективной методикой лечения, чем
существующая стандартная терапия, что подтверждается более значимым подавлением воспалительных процессов в стенке респираторного тракта.
Разработанная методика ингаляционного введения липосомальных препаратов является безопасной, о чем свидетельствует отсутствие клинически значимых побочных эффектов при ее использовании.
Разработанная методика ингаляционного введения липосомальных препаратов может быть рекомендована для применения в комплексной терапии больных бронхиальной астмой средней степени тяжести течения в период обострения.
Основные аспекты этиологии и патогенеза бронхиальной астмы
Гиперреактивность бронхиальной системы, обусловленная предсуществующими факторами, проявляется в бронхоконстриктивной реакции. Непосредственно на гладкомышечные клетки бронхов влияют: гистамин, ацетилхолин, метахолин, карбахол, лейкотриены и простагландины (Wenzel S.E. et al., 1989). Опосредованно - аллергены и физические раздражители - озон, фармакологические субстанции - PAF, брадикинин, капсаицин, аденозин, а также физические раздражители -холодный воздух, туман, пыль, табачный дым, дистиллированная вода, гипертонический раствор соли и физические нагрузки.
Бронхиальная гиперреактивность вызывается и химическим раздражением. Это SO2 (диоксид серы), N02 (диоксид азота), и 03 (озон). У человека доказана связь развития бронхиальной гиперреактивности с острым и хроническим вдыханием раздражающих паров и газов, дымов и пыли (Chan-Yeung М. et al, 1995; Krishna М.Т. et al, 1995; Humbert M. et al., 1999).
Сегодня лучше всего изучен фактор аллергии, как одна из причин БА. Как минимум 20% населения земного шара реагируют на аллергены окружающей среды выраженной воспалительной реакцией (Burrows В. et al., 1989; Pearce N. et al., 1999), причем эта особенность часто имеет наследственную предрасположенность (Holgate S.T., 1999; Holloway J.W. et al, 1999; Wiesch D.G. et al., 1999).
Среди провоцирующих факторов и факторов риска развития аллергии особое значение имеют: резкое ухудшение экологии, в том числе за счет экологических катастроф планетарного масштаба (например, аварии на Чернобыльской атомной электростанции (Аммосова СП, Чучалин А.Г. 1997); острый и хронический стресс; интенсивное развитие всех видов промышленности без достаточного соблюдения природоохранительных мер; бесконтрольное широкое применение медикаментов, особенно обладающих аллергенными свойствами и способных депонироваться в организме; широкое использование косметики и синтетических изделий; прочное внедрение в быт средств для дезинфекции и дезинсекции и пр.; изменение характера питания; появление новых аллергенов. Все это способствует широкому распространению аллергических заболеваний и в том числе БА.
Вне зависимости от этиологии и степени тяжести, бронхиальная астма является болезнью, развитие которой связано с механизмами аллергии, Т-клеточного иммунитета и воспаления дыхательных путей (Del Prete G. et al, 1992; Абросимов B.H., Порядин Г.В, 1994; Vignola A.M. et al, 1998). Это означает, что клинические симптомы БА могут не проявляться постоянно или периодически, однако воспалительные процессы в слизистой оболочке дыхательных путей протекают непрерывно в течение длительного времени (Кау А.В, 1991; Wooley K.L. et al, 1996; Holgate S.T. et al, 2000). Морфологические исследования у больных с бронхиальной астмой свидетельствуют о том, что даже в период стойкой ремиссии в воспалительном процессе в слизистой оболочке бронхов участвуют многие клетки и клеточные элементы, особенно тучные клетки, эозинофилы и Т-лимфоциты (Bradley B.L. et al, 1991; Vignola A.M. et al., 1999). Отмечается выраженная активация эозинофилов - клеток-маркеров бронхиальной астмы (Адо А.Д., 1978; Kroegel С. et al., 1990; Redington А.Е. et al., 1997). В участках воспаления эозинофилы приобретают отличительные воспалительные черты: увеличиваются их размеры, повышается степень дегрануляции и происходит активный синтез пептидов (Kay А.В., 1991; Lampinen М. et al., 1999).
Степень активности воспалительного процесса в бронхах оценивается по плотности эозинофильного инфильтрата, выявляемогоморфометрическими методами (Bousquet J. et al., 1990, 2000; Holgate S.T., 1993). Воспалительный процесс затрагивает все структуры бронха: эпителиальный слой, базальную мембрану, лимфоидные узелки, сосуды и гладкие мышцы. Происходит десквамация эпителия, дезорганизация базальной мембраны, гипертрофия гладких мышц и слизистых желез, расширение сосудов, расположенных над базальной мембраной (Адо А.Д., 1978; Laitinen L.A. et al., 1994; Low R.B., 1999). Стенки бронхов инфильтрируются эозинофилами, тучными клетками и Т-лимфоцитами (Bradley B.L. et al., 1991; Vignola A.M. et al., 1999). Активность воспаления при бронхиальной астме характеризуется также высоким уровнем содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе (Barnes P.J. et al., 1993; Hamid Q. et al., 1993; Kharitonov S.A. et al., 1994).
Понимание бронхиальной астмы как воспалительного заболевания подтверждают многие морфологические исследования (Carroll N. et al., 1993; Laitinen L.A. et al., 1994; Pare P.D. et al., 1997). Морфологическое изучение бронхобиопсий при бронхиальной астме показало увеличение количества эффекторных клеток, развитие отека и клеточной деструкции в слизистой оболочке бронхов у больных бронхиальной астмой, а также полнокровие сосудов и увеличение проницаемости сосудистой стенки (Kroegel С. et al., 1990; Pare P.D. et al, 1997). Структурные изменения в бронхах вызывают прежде всего поллютанты и вирусные респираторные инфекции (Fraenkel D.J. et al., 1995; Chan-Yeung M. et al., 1995; Johnston S.L., 1998), приводящие к выраженной десквамации эпителия, гиперплазии железистых клеток и появлению участков метаплазии эпителия (Chan-Yeung М. et al., 1995; Corne J.M. et al., 1997). Об активности воспаления свидетельствует также дегрануляция тучных клеток и активация Т-лимфоцитов, число которых резко возрастает в лаважной жидкости (Bradley B.L. et al., 1991; Ying S. et al., 1995). Дегрануляция тучных клеток сопровождается высвобождением факторов хемотаксиса эозинофилов и анафилаксии (Denburg J.А., 1998; Lampinen М. et al, 1999).
Наряду с увеличением числа эозинофилов, в их гранулах обнаруживается эозинофильный нейротоксин, эозинофильный катионный белок и эозинофильная пероксидаза, которые участвуют в повреждении эпителия бронхов (Kay А.В., 1991; Neeley S.P. et al., 1994; Chung K.F. et al., 1999; Holgate S.T., 2000). Экспозиция аллергена ведет к увеличению эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже в поздней стадии бронхиальной астмы. Эозинофилия и увеличение содержания катионного белка - важные свидетельства активности воспаления при бронхиальной астме (Busse W.W., 1992; Redington А.Е. et al., 1997).
Повреждение биологических мембран и их репарация с помощью фосфолипидов
В настоящее время все большее внимание исследователей привлекает проблема применения фосфолипидных препаратов в клинике внутренних болезней. В конце 70-х - начале 80-х годов XX века была изучена роль фосфолипидов в организме человека, а также их метаболизм на субклеточном, клеточном и органном уровнях, выявлены основные функции этих соединений, показаны пути их метаболизма и утилизации (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Арчаков А.И., Лопухин Ю.М., 1985; Murphy et al., 1992).
Фосфолипиды (ФЛ) представляют собой основной класс мембранных соединений, содержание которых в плазматической мембране и внутренних биомембранах эукариотических клеток составляет от 40 до 90% общего количества липидов. В состав ФЛ входят насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, сопряженные через глицерин (глицерофосфолипиды) или сфингозин (сфингофосфолипиды) с фосфат-содержащей полярной группой (этаноламин, холин, серии, инозит). Отдельные классы ФЛ отличаются друг от друга по полярным группам, длине цепей жирных кислот и степени их насыщенности. Сочетание полярного и гидрофобного фрагментов в молекуле обуславливает основное свойство ФЛ - амфифильность, т.е. сродство как к водной, так и к жировой среде. Это определяет уникальность их свойств и особенности биологического функционирования. В водной среде ФЛ образуют везикулярные или мицеллярные дисперсии, состоящие из ламеллярных (бислойных) структур (Бергельсон Л.Д., 1982; Ивков В.Г., 1982). Подобные «липидные везикулы», образующиеся при диспергировании взвеси ФЛ в воде, получили название липосом. При механическом диспергировании образуются липосомы большого размера (до 50 мкм), состоящие из нескольких десятков липидных бислоев, разделенных водными промежутками. Применение специальных технологий (ультразвук, детергенты и др.) позволяет получить моноламеллярные липосомы диаметром 100-200 нм. Наиболее мелкие частицы (диаметром менее 100 нм), с полярными группами снаружи и жирнокислотными цепями внутри называют мицеллами (Геннис Р.Б., 1997; Барсуков А.И., 1998; Shaw A.W., et al., 2004).
Вышеперечисленные свойства определяют функции ФЛ в живой клетке, где они являются основными «строительными блоками» биомембран, основным матриксом, куда встроены многочисленные мембранные белки и ферментные системы. В зависимости от характера полярных групп различают основные классы ФЛ: фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозитол (ФИ), сфинголипиды (сфингомиелины и гликосфинголипиды) и др. ФЛ в мембране расположены в виде бислоя, образующего жидко-мозаичную матрицу со встроенными в нее белками (Singer S.J. et al., 1972; Но С. et al., 1995). Важнейшим фактором в реализации мембранных и трансмембранных процессов является структурная динамика липидного бислоя (фазовая асимметрия, текучесть, латеральная диффузия и др.). В основе структурной динамики бислоя лежат липид/липидные и липид/белковые взаимодействия (Killian J.A. et al., 2001; Ohvo-RekilaH., 2002; Lund-Katz S., 2003).
Для фосфолипидов мембран показана неравномерность локализации отдельных их классов (трансбислойная асимметрия) с преимущественным позиционированием холин-содержащих ФЛ (в первую очередь, ФХ) на наружной, а амино-содержащих (ФЭ, ФС) - на внутренней стороне бислоя. Это определяется как геометрией фосфолипидных молекул, характером электростатических и гидрофобных взаимодействий, так и действием белков-транспортеров. Хотя тканевое распределение и экспрессия некоторых из этих транспортеров ограничена, в целом липидная асимметрия поддерживается избирательным потоком аминофосфолипидов внутрь и холин- и сфинголипидов - наружу. Определенный вклад в поддержании асимметрии вносит спонтанная трансмембранная диффузия ФЛ. Жидкостность мембраны и возможность диффузии в ней фосфолипидов необходимы, в первую очередь, для сохранения ионной проницаемости, диффузии молекул субстратов и сохранения активной конформации белков (Jackowsky S.A., 1996; Murray N.R. et al., 1998).
В последние годы показана латеральная гетерогенность мембран, возникающая вследствие ассоциации молекул липидов согласно их физико-химическому соответствию (Varma R. et al., 1998). При этом в отдельных областях мембраны происходит образование участков плотно упакованных молекул с высоко упорядоченной фазой (представляющие собой, в основном, ФЛ с насыщенными жирными кислотами и холестерин), «плавающих» в жидко-неупорядоченной фазе основного липидного матрикса (Gargalovic Р. et al., 2003). Такие образования называются «рафтами», они играют немаловажную роль в осуществлении процессов клеточного метаболизма (Simons К. et al., 2000; Drevot P. et al., 2002). Основным и универсальным природным фосфолипидом, составляющим до 50% от суммы ФЛ во всех биомембранах и около 75% в липопротеинах, является фосфатидилхолин (ФХ). Потребность в ФХ особенно выражена и незаменима для быстро обновляющихся клеток (клеток крови, альвеолярных макрофагов и др.), а также для гепатоцитов. В гепатоцитах ФХ участвует в функционировании цитохрома Р450, система которого является важнейшим звеном в цепи метаболизма ксенобиотиков (Archakov A.I., Karuzina I.I. et al., 2002). В клетках мозга ФХ служит источником холина, необходимого для поддержания их нормального функционирования (Zeisel S.H., 2000). В легких ФХ входит в состав сурфактанта, выстилая поверхность альвеол и препятствуя их слипанию в момент выдоха (Veldhuizen R. et al., 2004).
Аминофосфолипиды - ФЭ и ФС - участвуют в регуляции свертываемости крови, клеточной адгезии, эндоцитозе и ряде других функций клетки (Devaux P.F., 1991; Farge Е., et al., 1999; Buckland A.G. et al., 2000).
Сфингомиелин (CM), с его длинноцепочечным основанием и насыщенными остатками жирных кислот, придает мембране жесткость, с чем связана его преимущественная локализация в наружном слое плазматической мембраны. СМ и его метаболиты участвуют в качестве ключевых сигнальных молекул в ряде важнейших клеточных процессов: апоптозе, миграции, клеточной адгезии, в регуляции тонуса сосудов, в ангиогенезе, в патогенезе атеросклероза и его осложнений и др. (Xia P. et al., 1999; Spiegel S. et al., 2002). Показано, что продукты метаболизма ФЛ в качестве сигнальных молекул функционируют как медиаторы важнейших клеточных ответов (Malagarie-Cazenave et al., 2002; Kagan V.E. et al., 2003).
«Фосфоглив» - лекарственная композиция на основе соевого фосфатидилхолина и глицирризиновой кислоты
Основной проблемой фосфолипидных лекарственных препаратов (мембранных лекарств), остается поиск оптимальных способов солюбилизации водонерастворимых фосфолипидов и стабилизации получаемых липосом (Senior J.H., 1987; Hwang K.J., 1987; Барсуков А.И., 1998; Aso Y., Yoshioka S,, 2005). Многочисленные данные о положительном эффекте воздействия полиненасыщенных фосфолипидов на биологические мембраны (Archakov A.L, Uvarov V.Yu., 1989; Tampo Y., 2000; Jaeschke H. et al., 2002; Lee A.G., 2004) позволяют со всей определенностью утверждать, что отмечаемое некоторыми авторами негативное действие такого широко распространенного препарата, как «Эссенциале», обусловлено не самим фосфолипидом, а именно способом (или веществом), применяемым для его солюбилизации (Дудниченко и др., 2001). Именно это и побуждает исследователей продолжать поиск новых, улучшенных способов солюбилизации, результатом чего явился ряд отечественных разработок в этой области, в которых для получения стабильных липосомальных наночастиц используется ультразвуковая обработка, а в качестве детергента -тринатриевая соль глицирризиновой кислоты (гликозид из корня солодки).
Сама по себе глицирризиновая кислота (ГК) обладает широким спектром биологической активности (Kimura М. et al., 1992; Nakajima N. et al., 1996; Арчаков А.И., Карузина И.И., 2000; Dai J.H., 2001; Utsunomiya Т., et al., 2001; Ploeger В., et al., 2001; Raphael T.J., Kuttan G., 2003; Dragland S. et al., 2003), проявляющимся в следующих основных эффектах: - иммуномодулирующий эффект: повышение фагоцитоза нейтрофилов и активности естественных киллеров; - индукция продукции гамма-интерферона. Хотя непосредственные данные о влиянии ГК на альфа-интерферон отсутствуют, предполагается, что глицирризин, подобно ряду других индукторов, способствует в условиях вирусной инфекции продукции смеси гамма- и альфа-интерферонов; - ингибирование активности фосфопротеинкиназы С, вызывающей в условиях патологии иммунную дисрегуляцию; - антиоксидантное действие; - стабилизация функциональной активности биомембран эндоплазматического ретикулума; - ингибирование проникновения вируса в клетку за счет блокирования углеводным фрагментом глицирризина рецепторных участков мембраны или увеличения продукции клеточных антигенов. Возможно также непосредственное действие на оболочку вируса. Таким образом глицирризин сам по себе начинает работать в качестве противовирусного средства. Такое свойство глицирризин проявляет по отношению ко многим инфицирующим агентам, включая риновирусы, коронавирусы и другие типы вирусов, обладающие тропностью к тканям респираторной системы; - повышение способности печени к выведению токсинов. На основе глицирризиновой кислоты созданы и широко используются в странах Азии многие лекарственные препараты для лечения болезней печени, атопического дерматита и др. (lino S., et al., 2001; Saeedi M., et al., 2003). Исследования по выяснению роли глицирризиновой кислоты и растительного фосфатидилхолина в репарации клеточных биомембран и восстановлении их функциональной активности были начаты в нашей стране в ФГУ «НИИ физико-химической медицины РОСЗДРАВА», а затем продолжены в ГУ НИИ БМХ РАМН (Лопухин Ю.М. и др., 1984). Впервые композиция, состоящая из глицирризиновой кислоты и соевого фосфатидилхолина, обладающая способностью репарировать биологические мембраны, была предложена в 1988 году и запатентована в 1998 году (Арчаков А.И. и др., 1998). Для коммерческого использования указанный препарат получил название «Фосфоглив». Таким образом, «Фосфоглив» представляет собой препарат, содержащий иммуномодулирующий компонент - глицирризиновую кислоту - и «мембранный клей» (фосфатидилхолин) в одной дозе. Препарат существует в двух формах - пероральной капсульной (250 мг сухого порошка) и инъекционной (2500 мг лиофилизата). Отсутствие токсичности «Фосфоглива» было доказано в экспериментах на острую и хроническую токсичность, мутагенность, канцерогенность и эмбриотоксичность. Эксперименты проводились согласно современным требованиям к фармацевтическим препаратам фирмой «Medical International System» (Германия) в лаборатории профессора Е.В. Арзамасцева. Острая токсичность определялась на мышах, крысах и собаках. Не наблюдалось побочных эффектов при применении высоких доз препарата, превышающих более чем в 300 раз соответствующую терапевтическую дозу для человека. Отсутствие хронической токсичности было показано при внутривенном введении собакам препарата в дозе 675 мг/кг. Наблюдались положительные метаболические эффекты — повышение экскреторной функции печени, снижение содержания холестерина и триглицеридов плазмы крови. Отсутствие мутагенности и канцерогенности было показано при внутриперитонеальном введении мышам, при этом: - не наблюдалось хромосомных аберраций в клетках костного мозга при дозе 325 мг/кг; - не обнаруживалось мутаций в штаммах сальмонеллы в пределах 25 мг на чашку Петри (тест Эймса); - - не обнаружено повреждений ДНК при «SOS -хромотесте»; - в пределах концентраций до 450 мг/кг не было влияния на доминантные летальные мутации в зародышевых клетках. Тератогенность и эмбриотоксичность - отсутствовали при внутриперитонеальном введении крысам в дозе 80 мг/кг Также не было выявлено аллергических и иммунотоксических реакций в дозе до 125 мг/кг. Полученные результаты по мембран-репарирующему действию «Фосфоглива» при экспериментальных гепатитах, а также отсутствию токсичности и негативных последствий на клетки, послужили основанием для получения разрешения Фармакологического Государственного Комитета РФ на его клинические испытания (протокол №11 от 04.07.96).
Методика ингаляционного введения препарата «Фосфоглив»
В настоящем исследовании впервые изучалось применение лекарственного препарата «Фосфоглив» в виде ингаляций для лечения бронхиальной астмы, поэтому одним из важных результатов следует считать разработку методики его ингаляционного введения с помощью небулайзера.
«Фосфоглив» выпускается в виде лиофилизата для приготовления раствора для внутривенного введения (регистрационный номер Р №002528/02), и именно эта лекарственная форма использовалась для проведения ингаляций (одобрено этическим комитетом ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА).
Согласно инструкции по эксплуатации, в каждый флакон «Фосфоглива», содержащего лиофилизат массой 2500 мг (700 мг препарата), добавлялось 10 мл воды для инъекций, после чего образовывался слегка опалесцирующий раствор желтоватого цвета. 5 мл раствора добавлялось в резервуар небулайзера, после чего тот подключался к компрессору. В связи с особенностями состава (наличие большого количества фосфолипидов), раствор обладал высокой способностью к омылению и образованию «пены», поэтому титрование дозы препарата проводилось экспериментальным путем. В ходе предварительных экспериментов было показано, что 5 мл раствора «Фосфоглива», содержащего 350 мг препарата, полностью расходуются за 20 минут работы компрессора (использовался компрессор PARI Boy N), при этом на стенках камеры небулайзера остается небольшое количество (не более 0,3 мл по объему) «пены», представляющей собой продукты омыления фосфолипидов. Вместе с тем детальный анализ состава оставшегося на стенках камеры небулайзера материала в данном исследовании не проводился, поэтому эквипотенциальность дозы препарата, попадающей в респираторный тракт у пациентов, достигалась путем соблюдения следующих требований: 1. Контроль объема раствора до начала ингаляции (строго 5 мл). 2. Использование однотипных компрессоров и небулайзеров, обладающих одинаковыми техническими данными (минимальный поток, максимальный поток, соответствующее рабочее давление). 3. Непрерывность ингаляции. 4. Одинаковое время ингаляции (20 мин). 5. Контроль объема раствора после окончания ингаляции (не более 0,3 мл). Несмотря на то, что вышеприведенные параметры являются только косвенными в определении дозы препарата, попадающего непосредственно в респираторный тракт, неукоснительное их соблюдение позволяет утверждать, что все пациенты получали одинаковую дозу «Фосфоглива». Изменения в дозировке если и были возможны, то, скорее всего, являлись незначительными, поскольку объем раствора, оставшегося после ингаляции в большинстве случаев был практически одинаков. Было показано, что разработанные критерии позволяют добиться качественного равенства дозы препарата при его ингаляционном введении. Точное определение количества препарата, попавшего в воздухоносные пути, равно как и изучение его фармакокинетики и фармакодинамики, не являлось задачей настоящего исследования и представляет собой актуальную проблему клинической фармакологии. Одним из важных параметров, оцениваемых при прохождении препарата через небулайзер, являлась его способность сохранять свою липосомальную наноструктуру. В ходе предварительных экспериментов было показано, что только при использовании небулайзеров компрессорного типа липосомы остаются в неизмененном виде, использование же ультразвуковых приборов приводит к разрушению структуры липосом и образованию незамкнутых бислойных образований, состоящих из фосфолипидов (ламелл). Вышеуказанные исследования были проведены в ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН в рамках программы доклинических испытаний «Фосфоглива». Учитывая изложенное выше, была разработана и внедрена в клиническую практику следующая методика ингаляционного введения препарата «Фосфоглив»: 1. Для ингаляционного введения используется препарат «Фосфоглив» в форме лиофилизата для приготовления раствора для внутривенного введения (регистрационный номер Р №002528/02). 2. В каждый флакон, содержащий лиофилизат, для растворения вводится 10 мл воды для инъекций (согласно инструкции по медицинскому применению препарата). 3. Получившийся раствор тщательно перемешивается путем взбалтывания и оценивается визуально: жидкость должна быть светло-желтого цвета, слегка опалесцирующая. 4. 5 мл раствора добавляется в резервуар небулайзера с помощью шприца или пипетки. 5. Используется небулайзер PARI LC Plus с рабочим потоком 3-6 л/мин, рабочим давлением 0,5-2 бар, подключенный к компрессору PARI Boy N. 6. Ингаляция производится через мундштук для взрослых с клапаном для выдоха, при спокойном дыхании, в течение 20 минут. Пациент находится в сидячем положении. Правила ингаляции препарата через небулайзер не отличаются от таковых для других растворов лекарственных средств для ингаляций через небулайзер. 7. После проведения ингаляции со стенок резервуара собирается оставшийся препарат в виде «пены» и измеряется его объем (объем остаточного материала не должен превышать 0,3 мл). 8. После этого производится санитарная обработка небулайзера в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Всем 112 пациентам, включенным в исследование, проводились ингаляции «Фосфоглива» по указанной выше методике под контролем медицинского персонала.
