Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Иммунобиологические свойства возбудителя сифилиса 13
1.2. Поражение центральной нервной системы при сифилисе 17
1.3. Исследование цереброспинальной жидкости при подозрении на нейросифилис 21
1.4. Механизмы образования, циркуляции, оттока цереброспинальной жидкости в норме 28
1.5. Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера 32
1.6. Интратекальный синтез иммуноглобулинов 34
1.7. Взаимосвязь локального и системного иммунного ответа при поражении ЦНС 44
CLASS ГЛАВА 2. Общая характеристика пациентов, методов исследования и групп сравнения CLASS 46
2.1. Характеристика обследованных пациентов 46
2.2. Лабораторное исследование цереброспинальной жидкости и сыворотки крови 48
2.2.1. Методы выявления и оценки интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера 48
2.2.2. Диагностические тесты 49
2.3. Статистические методы анализа 51
ГЛАВА 3. Характеристика интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера при сифилитической инфекции 53
3.1. Изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и его особенностей, ассоциированных с наличием в анамнезе противосифилитической терапии 53
3.2. Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического / гематоликворного барьера у больных сифилисом 63
ГЛАВА 4. Исследование влияния дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и интратекального синтеза иммуноглобулинов на иммуноглобулиновый состав цереброспинальной жидкости у серопозитивных по сифилису пациентов 68
4.1. Сравнительный анализ количественного и качественного состава общих иммуноглобулинов ЦСЖ 70
4.2. Выявление особенностей интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированных с активностью воспалительного процесса в ЦНС 74
4.3. Исследование взаимосвязи между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений
гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис» 76
ГЛАВА 5. Изучение взаимосвязи между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием общих и сифилис-ассоциированных иммуноглобулинов в системном кровотоке при сифилитической инфекции 92
Заключение 102
Выводы 111
Практические рекомендации 114
Список сокращений и условных обозначений 115
Список литературы 116
- Механизмы образования, циркуляции, оттока цереброспинальной жидкости в норме
- Методы выявления и оценки интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера
- Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического / гематоликворного барьера у больных сифилисом
- Выявление особенностей интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированных с активностью воспалительного процесса в ЦНС
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Сифилитическое поражение центральной нервной системы (ЦНС) является частой
причиной инвалидизирующих форм неврологических, психических, офтальмологических,
слуховых, вестибулярных и других нарушений. Несмотря на значительное снижение
заболеваемости сифилисом в Российской Федерации, по данным государственной
статистической отчетности за последнее десятилетие (2002-2011 гг) количество
зарегистрированных случаев нейросифилиса увеличилось в 2,1 раза (с 471 до 987 случаев). При
этом результаты анализа качества лабораторной диагностики нейросифилиса позволяют
предположить значительное превышение реальной распространенности нейросифилиса над
официально зарегистрированной (Катунин, Г.Л. и др. Анализ заболеваемости и качества
лабораторной диагностики нейросифилиса в Российской Федерации // Вестн. дерматол. и
венерол. 2011. №3. С. 18-26.). Широкое применение антибактериальных препаратов привело к
увеличению частоты случаев нейросифилиса с маловыраженной и неспецифической
клинической симптоматикой, при которых диагноз основывается только на результатах анализа
цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) (Красносельских, Т. В., Соколовский, Е. В.
Нейросифилис: нерешенные проблемы и невыученные уроки (часть 1) // Современные
проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2011. № 5. С. 5-11.;
Ghanem, K.G. Neurosyphilis : a historical perspective and review // CNS Neuroscience and
Therapeutics. 2010. № 16. Р. 157–168.). В тоже время лабораторная верификация
сифилитического поражения ЦНС до настоящего времени остается зоной общемировой
полемики: констатируется явная недостаточная диагностическая точность имеющихся
«классических» критериев (Красносельских, Т. В., Соколовский, Е. В. Нейросифилис:
нерешенные проблемы … С. 5-11.; Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенительными инфекциями : клинические рекомендации. Сифилис // Москва. 2012. С. 34-68.; Ghanem, K.G. Neurosyphilis: A Historical Perspective and Review // CNS Neuroscience and Therapeutics. 2010. №16. Р. 157–168.; Prange, H.W. Neurosyphilis. In: Sexually Transmitted Infections and Sexually Transmitted Diseases (Ed. Gross G, Tyring S.K.). Berlin.: Springer-Verlag, 2011. Р. 163-171.), дополнительно предложенные критерии признаются требующими обоснований и пока не рекомендованы для широкого применения (Ho, E. L., Marra, C.M. Treponemal Tests for Neurosyphilis—Less Accurate Than What We Thought? // Sexually Transmitted Diseases. 2012. Vol. 39, № 4. Р. 298 – 299.), появляются работы, подвергающие сомнению уже валидированные критерии (Harding, A. S., Ghanem, K. G. The Performance of Cerebrospinal Fluid Treponemal-Specific Antibody Tests in Neurosyphilis // A Systematic Review Sexually Transmitted Diseases. 2012. Vol. 39, №4. Р. 291-297.).
В основе ликвородиагностики лежит детекция иммунного ответа в забарьерном пространстве ЦНС. На настоящий момент главным инструментом являются диагностические тесты, выявляющие присутствие в ЦСЖ сифилис-ассоциированных антител. Трудность
интерпретации результатов тестов и спорность критериев обусловлена возможностью двоякого
происхождения детектируемых антител. Диагностическую значимость имеют только
иммуноглобулины, синтезированные интратекально плазматическими клетками
периваскулярных воспалительных инфильтратов в ЦНС. Однако теоретически существует
вероятность, что высокое содержание в ЦСЖ иммуноглобулинов, происходящих из системного
кровотока, способно имитировать интратекальный иммунный ответ. Это может быть
следствием высокого уровня антител в крови и/или так называемой «дисфункции
гематоэнцефалического/гематоликворного (ГЭБ/ГЛБ) барьера» (нарушение целостности
ГЭБ/ГЛБ и/или расстройства циркуляции ЦСЖ). В литературе отсутствуют сведения об
особенностях изменения иммуноглобулинового состава ЦСЖ вследствие влияния
интратекального иммунного ответа и дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ при сифилисе.
Своевременная диагностика вовлечения ЦНС в инфекционный процесс при сифилисе имеет определяющее значение для благоприятного исхода заболевания и предупреждения развития осложнений. Поиск прогностических критериев нейросифилиса, основанных на исследовании периферической крови, является актуальным. Опубликованы данные, свидетельствующие о наличии связи между уровнем специфических антител в системном кровотоке и фактом установления диагноза «нейросифилис» (De Silva, Y. et al. The value of serum TPHA titres in selecting patients for lumbar puncture // Genitourin Med. 1991. № 67. Р. 37-40.; Marra, C. M. et al.Cerebrospinal Fluid Abnormalities in Patients with Syphilis: Association with Clinical and Laboratory Features //The Journal of Infectious Diseases. 2004. № 189. Р. 369–376.). Однако отсутствуют работы, посвященные особенностям иммуноглобулинового состава периферической крови больных сифилисом, ассоциированным с наличием интратекального гуморального иммунного ответа.
Установление закономерностей формирования иммуноглобулинового состава ЦСЖ и крови углубит понимание иммунного ответа при сифилитической инфекции и будет способствовать совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.
Цель исследования: изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и
дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера как факторов влияния на
иммуноглобулиновый состав цереброспинальной жидкости и выявление особенностей
иммуноглобулинового состава крови, ассоциированных с наличием интратекального
иммунного ответа, при сифилитической инфекции.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать интратекальный синтез иммуноглобулинов и дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера у серопозитивных по сифилису пациентов с подозрением на нейросифилис, и их особенности, ассоциированные с наличием в анамнезе противосифилитической терапии.
-
Определить влияние дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и интратекального синтеза иммуноглобулинов на количественный и качественный состав общих иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости.
-
Выявить особенности интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированные с активностью воспалительного заболевания центральной нервной системы.
-
Изучить взаимосвязь между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис».
-
Исследовать взаимосвязь между пулами иммуноглобулинов системного кровотока и цереброспинальной жидкости, выявить особенности иммуноглобулинового состава крови, ассоциированные с наличием интратекального синтеза иммуноглобулинов.
Работа выполнена в рамках НИР ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт
дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России (номер гос. регистрации
01201371572).
Методология и методы исследования. В работе применен комплекс иммунологических
и общеклинических методов исследования цереброспинальной жидкости и крови при
сифилитической инфекции.
Исследование проведено в соответствии с принципами доказательной медицины и одобрено Локальным этическим комитетом ФГБУ «УрНИИДВиИ» Минздарава России (протокол № 2 от 03.09.2010 г.)
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.
Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных
теоретических позиций, достаточным количеством пациентов и формированием групп
сравнения, использованием адекватных и апробированных лабораторных методов,
соблюдением рекомендаций международного консенсуса неврологов и нейрохимиков для
лабораторного исследования протеинов ЦСЖ (Reiber, H. et al. Quality assurance for cerebrospinal
fluid protein analysis: international consensus by an Internet-based group discussion // Clin Chem Lab
Med. 2003. Vol. 41, № 3. P. 331-337.), использованием сертифицированных наборов реагентов, и
применением современной компьютерной программы для статистической обработки
полученных данных. О достоверности полученных результатов также свидетельствует их биологическая правдоподобность и непротиворечивость ранее проведенным исследованиям и наблюдениям, опубликованным в научной литературе.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на XI Всероссийском съезде
дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010 г.), региональной
междисциплинарной научно-практической конференции «Актуальные вопросы
дерматовенерологии» (Челябинск, 2010 г.), IX конференции иммунологов Урала (Челябинск,
2011 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Современные проблемы
дерматовенерологии. Качество и доступность специализированной медицинской помощи»
(Екатеринбург, 2011 г.), XII (Москва, 2012 г.) Всероссийском съезде дерматовенерологов и
косметологов, региональной междисциплинарной научно-практической конференции
«Дерматология: вопросы повышения качества и доступности специализированной медицинской помощи» (Екатеринбург, 2013 г.).
Автором лично проведен научно-информационный поиск, заполнены оригинальные анкеты на основании анализа историй болезни пациентов, создан банк биологических образцов (ЦСЖ, сыворотка крови) пациентов. Семьдесят семь процентов лабораторных исследований выполнены автором лично. Статистический анализ и оценка результатов, написание глав диссертации выполнены лично автором, публикации по материалам диссертации подготовлены в соавторстве.
Положения, выносимые на защиту
Интратекальный синтез иммуноглобулинов при сифилитической инфекции
характеризуется разнообразием изотипических вариантов с тенденцией к более низкой
распространенности продуцирования иммуноглобулинов G4, редкой встречаемости
изолированного синтеза иммуноглобулинов А и рестрикции изотипического спектра под влиянием специфической терапии.
При сифилитической инфекции интратекальный иммунный ответ оказывает существенно более значимое влияние на содержание иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости в сравнении с дисфункциональными нарушениями гематоэнцефалического/ гематоликворного барьера, которые характеризуются преобладанием форм незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.
Интратекальный синтез иммуноглобулинов, ассоциированный с активным
воспалительным процессом в центральной нервной системе, отличается более высокой
частотой синтеза иммуноглобулинов М и большей интенсивностью синтеза иммуноглобулинов G3, G2 и G1.
Современные лабораторные критерии диагностики нейросифилиса являются
различными инструментами оценки интратекального гуморального иммунного ответа:
результаты тестов, подтверждающие диагноз «нейросифилис», ассоциированы с наличием признаков интратекального синтеза иммуноглобулинов, а результаты тестов, исключающие нейросифилис - с их отсутствием.
Интратекальный гуморальный иммунный ответ ассоциирован с высоким уровнем
реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке; содержание
трепонемаспецифичных антител в крови в количестве превышающим титр реакции пассивной
гемагглютинации 1:40960, может рассматриваться в качестве дополнительного
прогностического критерия наличия поражения центральной нервной системы при сифилисе.
Научная новизна исследования
Впервые показана значительная изотипическая вариабельность интратекального гуморального иммунного ответа при сифилисе с более низкой вероятностью синтеза IgG4 и редкой встречаемостью изолированного синтеза IgА. Установлено, что интратекальный синтез иммуноглобулинов у пациентов, получавших терапию по поводу неневрологического сифилиса, отличается более узким спектром интратекально-синтезируемых изотипов.
Показано, что нарушения функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе носят невыраженный характер, с преобладанием дисфункций незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.
Впервые представлены данные, свидетельствующие о том, что содержание иммуноглобулинов в ЦСЖ значительно возрастает в результате их интратекального синтеза (особенно класса М) и умеренно увеличивается при дисфункции ГЭБ/ГЛБ.
Впервые показано, что при активной воспалительной реакции в ЦНС у серопозитивных по сифилису пациентов наблюдается повышенная частота интратекального синтеза IgM и значительное возрастание интенсивности интратекального синтеза IgG3, IgG2 и IgG1.
Впервые доказано, что наличие в ЦСЖ детектируемого количества реагиновых антител и высокой концентрации трепонемаспецифических антител ассоциировано с интратекальным гуморальным иммунным ответом и маловероятно в его отсутствие и при изолированной дисфункции ГЭБ/ГЛБ.
Впервые продемонстрировано, что интратекальный гуморальный иммунный ответ при сифилитической инфекции ассоциирован с более высоким содержанием реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили расширить представление об интратекальном иммунном ответе и нарушении функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе, установить закономерности изменения качественного и количественного состава иммуноглобулинов ЦСЖ в результате интратекального синтеза иммуноглобулинов и нарушенной функции ГЭБ/ГЛБ и выявить связь между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием общих и сифилис-ассоциированных антител в системном кровотоке. Полученные данные позволили уточнить иммунобиологическую основу существующих лабораторных критериев диагностики и прогнозирования нейросифилиса, привести аргументацию в отношении дискутабельных диагностических критериев и предложить новые прогностические критерии для дополнительного обоснования диагностической пункции (патент на изобретение №2449286, заявка на патент № 2013131721).
Полученные данные могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий и отделений венерологии, неврологии, психиатрии лечебных учреждений, а также в процессе последипломной подготовки врачей-дерматовенерологов, неврологов и врачей клинической лабораторной диагностики
Внедрение результатов исследования в практику: результаты исследования внедрены в практику работы ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России. Результаты работы включены в лекционный курс факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов по специальности «Дерматовенерология» ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, лекционный курс кафедры дерматовенерологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России.
Публикации. Автор имеет 18 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 9 научных работ общим объемом 1,7 печатных страниц, из них 6 статей в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России (5 статей в российских журналах, 1 статья в зарубежном научном журнале), 2 работы опубликованы в материалах всероссийского съезда и междисциплинарной научно-практической конференции, получен 1 патент на изобретение № 2449286 от 27.04.2012, оформлена заявка на изобретение № 2013131721 от 27.07.2013 года.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 26 таблиц и 2 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 145 источников (52 отечественных и 93 зарубежных авторов).
Механизмы образования, циркуляции, оттока цереброспинальной жидкости в норме
Цереброспинальная жидкость (син.: ликвор, спинномозговая жидкость) -биологическая жидкость, необходимая для правильного функционирования мозговой ткани и выполняющая защитную функцию [4]. ЦСЖ заполняет полости желудочков мозга, субарахноидальное пространство головного мозга и спинномозговой канал, периваскулярные и перицеллюлярные пространства в ткани мозга, омывая элементы паренхимы мозга и глии. Ликвор находится в состоянии непрерывной циркуляции, его состав формируется в процессе обмена веществ между мозгом, кровью и тканевой жидкостью, что позволяет рассматривать данную биологическую жидкость как среду, отражающую состояние ЦНС и процессов, происходящих на ее территории с тем ограничением, что примерно половина ткани головного мозга, особенно кора, не контактируют с ЦСЖ, поэтому патология этих областей не отражается на составе ЦСЖ [4].
Система ликворообращения мозга включает три основных звена: ликворопродукцию, ликвороциркуляцию и отток ликвора [121, 125].
Продукция ЦСЖ осуществляется в основном сосудистыми сплетениями желудочков мозга путем ультрафильтрации плазмы крови и секреции некоторых компонентов в сосудистых сплетениях мозга. В образовании ЦСЖ также принимают участие структурные элементы мозга благодаря возможности диффузии межклеточной жидкости через эпендиму в желудочки головного мозга и через межклеточные пространства к поверхности мозга. В нормальных условиях экстраваскулярная продукция цереброспинальной жидкости весьма незначительна. Регуляция проникновения из крови в мозг биологически активных веществ, метаболитов, химических веществ, воздействующих на чувствительные структуры мозга, а также препятствие поступлению в мозг чужеродных веществ, микроорганизмов, токсинов осуществляется гемато-ЦНС барьерами. Барьерные функции осуществляются благодаря уникальным особенностям их анатомических структур: чрезвычайно плотные контакты клеток эндотелия капиллярного русла головного мозга, эпителия сосудистого сплетения, арахноидальных мембран, а также функциональные особенности этих клеток (высокая ферментативная активность, наличие транспортных белков, обеспечавающих избирательную проницаемость веществ), наличие астроцитарной оболочки капилляров мозга, наличие базальной мембраны, залегающей между эндотелиальными клетками капилляров и отростками астроцитов, наличие макрафагальных клеток (перициты, клетки Колмера), отсутствие способности к пиноцитозу эндотелиальных клеток мозга [14, 49, 56, 79, 131]. Выделяют следующие барьеры:
1) гематоэнцефалический (ГЭБ), локализован на уровне церебрально-васкулярного эндотелия посткапиллярных венул, разделяет кровь и интерстициальную жидкость ткани мозга;
2) гематоликворный барьер (ГЛБ) – локализован на уровне эпителия сосудистого сплетения, обеспечивающего секрецию ЦСЖ, избирательный транспорт веществ, разделяет кровь и вентрикулярную ЦСЖ;
3) арахноидальный барьер, локализован на уровне арахноидальной оболочки, обеспечивает отток ЦСЖ.
ГЭБ/ГЛБ обладает специфической проницаемостью для разных типов молекул: свободное проникновение (кислород и двуокись азота, вода и алкоголь), активный транспорт посредством транспорных белков (ионов органических кислот, щелочей, которые стабилизируют состав ЦСЖ и экстрацеллюлярной жидкости мозга, глюкозы), также описан механизм транцитоза. Несмотря на наличие FcRn-рецепторов иммуноглобулинов в эндотелии кровеносных сосудов хороидного сплетения не была подтверждена гипотеза трансцитозного механизма переноса антител из периферической крови в ЦСЖ [85]. Позже на моделях животных было показано, что данные рецепторы опосредуют "обратный трансцитоз" из ЦСЖ в кровь [146].Таким образом, на настоящий момент общепризнанным является мнение, что проницаемость иммуноглобулинов через барьерные структуры ЦНС объясняется в основном механизмом пассивной диффузии [49, 123]. При пассивной диффузии для многих молекул проницаемость почти обратно пропорциональна их молекулярной массе и пропорциональна градиенту концентраций в кровеносном русле и ЦСЖ. Различия в молекулярной массе иммуноглобулинов разных классов (IgG 150 кДа; IgA 170 кДа; IgM 900 кДа) определяет их различную проницаемость. Так, при прохождении через ГЭБ/ГЛБ в норме концентрация иммуноглобулина G уменьшается в 440, IgA в 800, IgM в 3400 раз, альбумин (67кДа) в 205 раз [123]. Циркуляция ЦСЖ определяется градиентом гидростатического давления в ликворных путях, пространствах мозга, обусловленного пульсацией внутричерепных кровеносных сосудов, изменениями венозного давления и положения тела в пространстве [125]. Нарушение ликвороносных путей (закрытие желудочковых отверстий опухолью, спайками, сгустками крови, гуммами; обструкция ячеек, ворсинок и пахионовых грануляций эритроцитами, фиброз оболочек после кровоизлияния или перенесенного менингита; окклюзия синусов) приводит к замедлению циркуляции ЦСЖ [125].
Отток ЦСЖ преимущественно (на 30 - 40%) происходит через арахноидальное пространство в продольный синус (часть венозной системы головного мозга). Движущим фактором такого перемещения ЦСЖ является градиент гидростатического давления ее и венозной крови. Около 10% жидкости оттекает через сосудистое сплетение желудочков мозга, от 5 до 30% — в лимфатическую систему через периневральные пространства черепных и спинномозговых нервов, а также через решетчатую пластинку и адвентиции церебральных артерий. Некоторое количество жидкости резорбируется эпендимой желудочков мозга и сосудистыми сплетениями [46, 125].
Общий объем ликвороносных пространств у взрослого человека в норме составляет 90—200 мл, в среднем 140 мл. В сутки вырабатывается около 500 мл цереброспинальной жидкости, обновление ее происходит примерно 4—8 раз в сутки. Значительные колебания в скорости обновления ЦСЖ зависят от суточного режима питания, водного режима, колебаний активности физиологических процессов в организме, физиологической нагрузки на ЦНС и др. Скорость образования ЦСЖ может значительно возрастать при развитии патологических процессов (воспалительные процессы, черепномозговые травмы, субарахноидальные кровоизлияния, операции по поводу опухоли мозга и т. д.) [46].
Методы выявления и оценки интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера
Оценка интратекального синтеза иммуноглобулинов проводилась по методологии, предложенной Н. Reiber [121], путем сравнения фактического коэффициента иммуноглобулинов (QIg) и расчетного предельного коэффициента иммуноглобулинов (Qlim), определяемого индивидуально для каждого пациента и отдельно для изотипов A, M, G1, G2, G3, G4: Наличие интратекального синтеза иммуноглобулинов констатировали, если фактический коэффициент иммуноглобулинов данного изотипа превышал соответствующий показатель, характеризующий предельный уровень диффузии (QIg Qlim). Оценка интенсивности интратекального синтеза производилась путем расчета значений минимальной интратекально-синтезируемой фракции иммуноглобулинов (ИСФ) в абсолютном (Igloc) и относительном (IgIF) значении: Igloc (мг/л)= [QIg-Qlim] Igсыворотка IgIF (%)=[ Igloc /IgЦСЖ] 100%
Состояние ГЭБ/ГЛБ оценивалось с помощью коэффициента альбумина (Qalb), равного отношению концентрации альбумина в ЦСЖ (мг/л) к концентрации альбумина в сыворотке (мг/л). Значения Qalb, превышающие возрастные нормы [Qalb = (4 + возраст/15) 10-3], были расценены как дисфункция ГЭБ/ГЛБ [121] При выявлении дисфункции ГЭБ/ГЛБ, величину Qаlb (10-3) дополнительно оценивали на основании критериев Schliepand-Felgenhauer [91]: Qalb10 менее 9,0 – несущественные нарушения, 9,0-14,3 – небольшие нарушения, 14,3-33,3 –умеренные нарушения, 33,3-100,0 – тяжелые нарушения; больше 100,0 – «катастрофическое повреждение», также для характеристики дисфункции использовали показатель величины превышения индивидуального значения Qаlb над возрастной нормой (%), равный [(Qфактический-Qнорма)/Qнорма].
Определение содержание альбумина проводили турбидиметрическим методом (DiaSys, Германия), общих иммуноглобулинов различных изотипов (G1, G2, G3, G4, M, A,) - методом ИФА (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для повышения надежности и точности соотношения концентраций альбумина и иммуноглобулинов образцы ЦСЖ и сыворотки были проанализированы в дублях, в рамках одной аналитической серии, подбирая соответствующее разведение биологических жидкостей.
Наличие трепонемаспецифических антител в ЦСЖ и сыворотке крови определяли в тестах:
- иммуноферментного анализа (ИФА) - качественное определение антител класса G (ЗАО «Вектор-Бест», Россия); - реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) - количественная оценка суммарных антител (результаты РПГА для образцов ЦСЖ считались положительными в разведении 1:4 и больше, для сыворотки крови 1:80 и больше)(BIO-RAD, Франция);
- реакции иммунофлюоресценции в двух модификациях: с цельным ликвором (РИФц) и с абсорбцией антител к культуральным непатогенным трепонемам (штаммы V, VII, VIII, IX, Рейтерa) (РИФабс) (положительными считались образцы, которые давали свечение интенсивностью больше 1+ (трепонемы окрашены чуть интенсивнее фона), (ЗАО «Вектор-Бест», Россия); Наличие антикардиолипиновых (реагиновых) антител в ЦСЖ и сыворотке крови определяли в тестах:
- реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП): качественный и количественный варианты определения суммарных антител (НПО «Диагностическиесистемы», Россия), результаты выражались в титрах, при позитивации реакции только с неразведенным (цельным) образцом титр указывался 1:0;
- реакции связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк) (методика постановки реакции Вассермана с ЦСЖ [25]) – качественное определение суммарных антител;
-VDRL (по названию лаборатории разработчика Venereal Disease
Research Laboratory) - качественное определение суммарных антител в ЦСЖ, (ЗАО «ЭКОлаб», Россия);
- RPR (Rapid Plasma Reagin) тест - качественное определение суммарных антител в ЦСЖ, (Human, Германия).
Для проведения всех вышеуказанных исследований использовались зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы и тест-системы.
Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического / гематоликворного барьера у больных сифилисом
В результате анализа индивидуальных показателей Qаlb превышение над возрастной нормой было выявлено у 36 (6 женщин и 30 мужчин) из 126 обследованных пациентов. Согласно анамнестическим данным, большинство пациентов (24) имели специфическую терапию неневрологического сифилиса, один пациент поступил для контроля лечения нейросифилиса.
Анализ частоты встречаемости повышенных значений Qаlb в зависимости от наличия/отсутствия специфической терапии в анамнезе выявил статистически значимые ассоциации (таблица 3.2.1). В присутствии факта специфической терапии нормальные значения Qаlb встречались в 2,7 раза чаще, чем повышенные. У пациентов, получивших терапию по схемам лечения нейросифилиса (высокие дозы пенициллина), данное различие было еще более выраженным: из 15 человек только у 1 пациента было выявлено легкое нарушение ГЭБ/ГБЛ (93% и 7%, p=0,001). У пациентов, не получавших ранее терапии по поводу сифилиса, достоверных отличий в частоте нормальных и повышенных значений Qаlb не было выявлено.
Для анализа выраженности дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ величину Qаlb оценивали в соответствии с классификацией Schliepand Felgenhauer и проводили сравнительный анализ удельного веса случаев с той или иной степенью нарушения в группах. Кроме того, чтобы учесть различия по возрасту пациентов, дополнительно был рассчитан процент превышения Qаlb над возрастной нормой. Результаты представлены в таблице 3.2.2. В целом преобладали незначимые и легкие нарушения, умеренные нарушения встречались реже. Более тяжелые нарушения не были выявлены в обследованной группе, их вероятность с учетом доверительного интервала не превышала 10%. Максимальное значение Qаlb не превышало 21,1. Сам факт наличия в анамнезе терапии по поводу неневрологического сифилиса на степень выраженности дисфункциональных нарушений не оказывал статистически значимого влияния. В нашем исследовании мы выявили частоту дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ статистически значимо превышающую популяционную частоту дисфункций ГЭБ/ГЛБ, не связанных с заболеваниями нервной системы [95] (29% против 15%, р 0,0001). Также полученные результаты не противоречат литературным данным о частоте дисфункции ГЭБ/ГЛБ при сифилитической инфекции [8, 22, 43, 68, 78, 102]. Некоторые различия в частоте дисфункций у обследованных пациентов, по нашему мнению, обусловлены различным удельным весом больных с выраженной «классической» неврологической симптоматикой нейросифилиса. Пациенты в нашем исследовании в основном имели малосимптомные формы. Кроме того, различия в частоте дисфункций, вероятно, обусловлены различной точкой разделения нормальных и повышенных значений Qаlb. В литературных источниках за основу брались значения 7,4 и 7,9, тогда как в нашей работе использовалась граница возрастной нормы [121], которая в ряде случаев была ниже указанных значений.
Наши исследования показали, что функциональные нарушения ГЭБ/ГЛБ в основном варьируют в диапазоне от незначительных до умеренных, и их интенсивность существенно не различается у пациентов в зависимости от наличия в анамнезе специфической терапии. На относительную редкость тяжелых нарушений указывают также сведения, показанные при описании случаев в других исследованиях [75, 127]. Относительная интактность ГЭБ/ГЛБ (невысокие частота и степень нарушений) отмечается и при других инфекциях ЦНС (малярия, сонная болезнь) [57, 83].
Таким образом, по совокупности данных можно констатировать, что поражение ЦНС при сифилитической инфекции может сопровождаться нарушениями функционирования ГЭБ/ГЛБ, которые наблюдаются примерно у каждого третьего пациента, носят невыраженный характер. Проведенные исследования не выявили статистически значимого влияния противосифилитической терапии в анамнезе на выраженность дисфункции ГЭБ/ГЛБ. Следует отметить, что данные наблюдения имеют некоторые ограничения. Так большинство обследованных нами пациентов в основном были с поздними формами сифилиса, тогда как ранние формы могут иметь другие особенности. Кроме того, в исследованиях (собственном и процитированных) Qаlb оценивалась с точки зрения среднестатистических норм, тогда как индивидуальная норма может быть ниже, и среди значений Qаlb расцененных как нормальные, могут быть индивидуально повышенные. Требуется дальнейшее изучение влияния индивидуальных особенностей функционирования ГЭБ/ГЛБ у больных сифилисом на результаты лечения.
Выявление особенностей интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированных с активностью воспалительного процесса в ЦНС
Для решения третьей задачи был проведен сравнительный анализ показателей, характеризующих интратекальный синтез Ig в зависимости от наличия признаков активности воспалительного процесса в ЦНС. Результаты приведены в таблице 4.2.1.
Статистически значимые отличия в частоте интратекального синтеза различных изотипов иммуноглобулинов были получены только в отношении IgM. В группе с признаками активности воспалительного процесса удельный вес случаев выявления интратекального синтеза данного изотипа был в 1,9 раза выше (р=0,044).
Хотя частота интратекального синтеза Ig класса G в сравниваемых группах достоверно не отличалась, при наличии признаков активности воспаления интенсивность интратекального антителообразования изотипов G1, G2, G3 была значимо выше. Медиана данных, характеризующих минимальную интратекально-синтезированную фракцию Ig, была выше для изотипа G3 в 8,0 раз, G2 – в 7,0 раз, G1- в 2,8 раза по сравнению с группой без признаков активности воспалительного процесса.
При этом в наибольшей степени увеличивалась интратекальная продукция изотипа G3, что подтверждается достоверно большей относительной долей данного изотипа в общей интатекально-синтезируемой фракции при воспалении (17 (8-27)% против 44 (18-57)% соответственно, р=0,016).
Соответственно, была значимо выше и общая концентрация в ЦСЖ этих изотипов Ig. Кроме того, наблюдались отличия в отношении Ig класса А. При наличии признаков воспаления концентрация IgА в ЦСЖ была достоверно выше, несмотря на отсутствие различий в интенсивности интратекального синтеза. Таким образом, были установлены особенности интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированные с признаками активности воспалительного процесса, заключающиеся в более высокой частоте синтеза иммуноглобулинов класса М, большей интенсивности синтеза IgG3, IgG2, IgG1 с преимущественным приростом IgG3. Полученные данные могут быть объяснены с иммунобиологических позиций следующим образом. Возбудитель сифилиса T. pallidum является внеклеточным паразитом и, соответственно, основными иммунными эффекторными механизмами являются антителообразование и комплементзависимая цитотоксичность. Именно изотипы иммуноглобулинов IgG3 и IgМ обладают наибольшей комплементактивирующей активностью, что запускает каскад комплементзависимых эффекторных реакций и приводит к реализации воспалительного потенциала. Наличие дополнительных стимулов в виде различных цитокинов, продуцируемых при воспалении, приводит к усилению продукции иммуноглобулинов класса G, особенно изотипов IgG3, IgG2, IgG1, которые в большей степени, чем IgG4, связаны с противоинфекционным иммунным ответом [51,52].
Исследование взаимосвязи между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис» Для решения четвертой задачи были изучены результаты нетрепонемных (VDRL, RPR, РМП, РСКк) и трепонемных (РИФабс, РИФц, РПГА, ИФА, РСКт) тестов в ЦСЖ в группах «норма», «ДФ ГЭБ/ГЛБ», «ИТС Ig», и при интратекальном синтезе Ig в зависимости от наличия признаков воспалительного процесса. Выполнено сравнительное исследование и проанализировано соответствие результатов критериям, используемым в настоящее для подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис».
Был составлен полный перечень комбинаций результатов, полученных по каждому из анализируемых тестов для каждой из проб ЦСЖ. Данные представлены в таблице 4.3.1. Всего было выявлено двадцать семь различных вариантов сочетаний. отрицательные результаты всех тестов 15 0 0 Общепринятыми критериями подтверждения диагноза «нейросифилис» являются положительные результаты нетрепонемных тестов в ЦСЖ [32, 64,96].
В таблице 4.3.2 приведены данные сравнительного анализа частоты позитивации отдельных нетрепонемных тестов и их комбинаций в зависимости от наличия интратекального синтеза Ig и дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ.
Между группами «норма» и «ДФ ГЭБ/ГЛБ» удельный вес проб, позитивных в каком-либо из нетрепонемных тестов статистически не различался и составил 2% и 10% соответственно.
В группе «ИТС Ig» доля положительных результатов всех нетрепонемных тестов была достоверно выше и составила: для VDRL– 41%, для RPR – 39%, для РМП – 51%, для РСКк – 51%. Чаще встречались пробы ЦСЖ, позитивные по всем четырем нетрепонемным тестам, либо позитивные по двум-трем тестам. В целом по группе «ИТС Ig» позитивация какого-либо (каких-либо) из нетрепонемных тестов была выявлена у 41 из 55 человек (75%), что было достоверно чаще в сравнении с группами «норма» и «ДФ ГЭБ/ГЛБ» (р 0,0001).
Удельный вес позитивации различных нетрепонемных тестов внутри групп статистически не различался.
