Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Опиоидные пептиды являются важными факторами регуляции целого ряда функций и систем организма (Bodnar, R.J. Endogenous opiates and behavior: 2010 / R.J. Bodnar II Peptides. 2011. V. 32. P. 2522-2552.; Verburg-van Kemenade, B.M.L. Neuroendocrine-immune interaction: Regulation of inflammation via G-protein coupled receptors I Verburg-van Kemenade B.M.L., L.M. Van der Aa, M. Chadzinska II General and Comparative Endocrinology. 2013. V.188. P. 94-101.). Данное семейство биорегуляторов было впервые описано во второй половине 70-х годов XX века (Dalayeun, J.F. Physiology of P-endorphins. A close-up view and a review of the literature I J.F. Dalayeun, J.M. Nores, S. Bergal II Biomed & Pharmacorher. 1993. V. 47. P. 311-320.). Тогда были выделены и описаны три основных семейства эндогенных опиоидных пептидов: эндорфины, энкефалины и динорфины, образующиеся в результате расщепления крупных молекул-предшественников проопиомеланокортина, проэнкефалина и продинорфина соотвественно. Опиоидные пептиды реализуют свои эффекты через связывание с опиатными рецепторами трех основных типов (|д, 8, к), экспрессия которых на клетках иммунной системы доказана методами радиолигандного связывания и детекции соответствующей РНК (Bidlack, J. М. Detection and Funktion of Opioids Receptor on Cells from the Immune System I J. M. Bidlack II Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 2000. V. 7. P.719 - 723.). Опиоидные пептиды широко представлены как в ЦНС, так и на периферии. Первоначально продукты расщепления проопиомеланокортина, проэнкефалина и продинорфина были идентифицированы в центральной нервной системе, гипоталамусе, гипофизе, однако впоследствии они были обнаружены в эпидермальных клетках различного происхождения, периферических нервных окончаниях, желудочно-кишечном тракте, сердце, легких, щитовидной железе, половых железах, плаценте, в экстрактах тимуса, селезенки и костного мозга, а также в стимулированных и не стимулированных клетках иммунной системы (Madden, К. Experimental basis for neural-immune interactions I K. Madden, D. Felten II Physiol. Rev. 1995. V.75. P.77-105.; Pepe, S. Cross-talk of opioid peptide receptor and P-adrenergic receptor signalling in the heart I S. Pepe, O. van den Brinka, E.G. Lakattab et al. II Cardiovascular Research. 2004. Vol. 63. P. 414- 422.; Salzet, M. Neuroimmunology of opioids from invertebrates to human I M. Salzet II Neuroendocrinol. Lett. 2001. V. 22. P. 467-474.). В очаге воспаления под воздействием антигена или высоких концентраций провоспалительных цитокинов опиоидные пептиды всех семейств продуцируется в непрогнозируемых соотношениях, обусловливая широкий спектр иммунорегуляторных эффектов, реализуемых по пара- и аутокринному механизму и купируя в очаге воспаления боль (Stein С. Peripheral mechanisms
4 of opioid analgesia I С Stein, L.J. Lang II Current Opinion in Pharmacology. 2009. V. 9. P. 3-8.). Выделение эндогенных опиоидных пептидов в организме носит импульсный характер и наблюдается при различных стрессах, травмах, психоэмоциональных состояниях и физических нагрузках (Корнева, Е.А. Гормоны и иммунная система / Е.А. Корнева, Э.К. Шхинек. - Л.: Наука, 1988. 251с; Корнева, Е.А. Ведение в иммунофизиологию / Корнева, Е.А. - Элби-Санкт-Петербург, 2003. 48 с; Корнева, Е.А. Взаимодействие нервной и иммунной систем. Молекулярно-клеточные аспекты / Е.А. Корнева, Н.С. Новикова, К.З. Шаинидзе, СВ. Перекрест. - Санкт-Петербург: «Наука», 2012. 173 с; Абрамов, В.В. Взаимодействие иммунной и нервной систем / В.В.Абрамов - Новосибирск: Наука, 1988. -163с; Абрамов, В.В. Интеграция иммунной и нервной систем / В.В.Абрамов - Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1991. 166 с; Besedovsky, Н.О. Immune-neuro-endocrine interactions: facts and hypotheses/ Н.О. Besedovsky, A. Rey II Endocr. Rev. 1996. V.17. P. 64-102.; Рыбакина, Е.Г. Интерлейкин-1 в молекулярных механизмах нейроиммунных взаимодействий / Е.Г. Рыбакина. Автореф. дис д-ра биол. наук. СПб, 2001. 44с; McEwen, B.S. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactionse / B.S. McEwen, C.A. Biron, K.W. Brunson et al. II Brain Research Reviews. 1997. V.23. P.79-133.; Elenkov, I.J. Stress hormones, Thl/Th2 patterns, pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease I I.J. Elenkov, G.P. Chrousos II Trends Endocrinol. Metabol. 1999. V. 10. P. 359-368.; Elenkov, I.J. Systemic stress-induced Th2 shift and its clinical implications I I.J. Elenkov II Neurobiology of the Immune System (Series: International Review of Neurobiology). 2002. V. 52. P. 163-186.; Igarashi, H. Age and stage dependency of estrogen receptor expression by lymphocyte precursors I H. Igarashi, T. Kouro, T. Yokota et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. P.15131-15136.; Tracey, K.J. The inflammatory reflex I K.J. Tracey II Nature. 2002. V. 420. P. 853-859.). Одним из основных показателей стресса является повышение содержания бета-эндорфина в плазме крови (Hale K.D. Effects of rotational stress of different duration on NK cell activity, proinflammatory cytokines, and POMC-derived peptides in mice I K.D. Hale, V.K. Ghanta, D.K. Gauthier et al. II Neuroimmunomodul. -2001. V.9. P.34-40.; Iwai, K. Immobilization stress inhibits intimal fibromuscular proliferation in the process of arterial remodeling in rats I K. Iwai, T. Takahashi, T. Nakahashi et al. II Hypertens Res. 2008. V. 31. P. 977-986.). В настоящее время известно, что секреция бета-эндорфина, в частности, его продукция лимфоцитами в норме и при стрессе существенно изменяется в течение жизни, при этом изменений его концентрации в периферической крови с возрастом не отмечено (Dalayeun, J.F. Physiology of P-endorphins. A close-up view and a review of the literature I J.F. Dalayeun, J.M. Nores, S. Bergal II Biomed & Pharmacorher. 1993. V. 47. P. 311-320.). У возрастных субъектов повышена концентрация бета-эндорфина в
5 нестимулированных мононуклеарах периферической крови, и в условиях стимуляции клеток лектинами, концентрация внутриклеточного бета-эндорфина у возрастных субъектов снижается более выражено, нежели у молодых (Panerai, А.Е. Beta-endorphin in the immune system: A role at last I A.E. Panerai, P. Sacerdote II Trends Immunol. Today. 1997. V.18. P.317-319.). Помимо этого, в процессе старения организма наблюдаются нарушения механизмов адаптации к внешним воздействиям (Фрольксис, В.В. Старение и увеличение продолжительности жизни / В.В.Фрольксис. - Л: «Наука», 1988. 239 с). Другим важным фактором, определяющим иммунологическую реактивность организма, является пол (Kovaiou, R.D. Age-associated changes within CD4+ T cells I R.D. Kovaiou, B. Grubeck-Loebenstein II Immunology Letters. 2006. V.107. P. 8-14.), что, в свою очередь, определяет возникновение и течение различных заболеваний (Drackmann, R. Female sex hormones, autoimmune diseases and immune Response IR. Drackmann II Gynecol. Endocrinol. 2001. V.15. P. 69-76.), а также различную продолжительность жизни мужчин и женщин (Hall, J.E. Neuroendocrine changes with reproductive aging in women I J.E. Hall II Semin Reprod Med. Review. 2007. V.25. P.344-351.).
Цель исследования
Исследовать влияние эндогенных опиоидных пептидов на отдельные функции клеток врожденного и адаптивного иммунитета у здоровых доноров - добровольцев мужского и женского пола различных возрастных групп.
Задачи исследования
-
Исследовать влияние бета - эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.
-
Исследовать влияние мет- и лей-энкефалинов на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.
-
Исследовать влияние бета - эндорфина, мет- и лей-энкефалинов на фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.
-
Исследовать влияние бета-эндорфина на продукцию активных форм кислорода фракцией лейкоцитов периферической крови доноров мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.
Методология и методы исследования
Работа выполнена в лаборатории развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН г.Пермь.
Объектом исследования в опытах in vitro служили лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 82-х соматически здоровых людей - добровольцев 20-59 лет, при отсутствии клинических и лабораторных признаков острого воспаления или обострения хронического воспалительного процесса. У доноров-женщин 20-49 лет забор крови производился в первую фазу овуляторного цикла. Все исследования проводились в соответствии с этическими нормами, с согласия доноров-добровольцев после ознакомления их с условиями и задачами эксперимента.
Таблица 1 - Распределение доноров-добровольцев по возрасту и полу
Фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов оценивали по результатам модифицированного метода Каплина. В микропробирках с антиадгезивным покрытием смешивали 25 мкл гепаринизированной крови и 25 мкл бета-эндорфина («Skytek laboratories», США), мет- и лей-энкефалины в концентрациях 10" - 10" М, пробы инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 С. После инкубации к пробам добавляли 25 мкл суспензии формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ) (100x10 /мл в среде 199 с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ Z-глутамина). В качестве объектов фагоцитоза ФЭБ были выбраны по следующим причинам: они имеют более крупные размеры в сравнении с бактериальными клетками, окрашиваются азур 2-эозином в отличие от собственных эритроцитов в синий цвет, что значительно повышает объективность микроскопического учета результатов в данном методе. Кроме того, фагоцитоз осуществляется при участии тех же молекул клеточной адгезии и опсонизирующих факторов плазмы, что и естественных объектов, а так же при использовании данной модификации используется цельная кровь, что позволяет избежать изменения функциональной активности фагоцитирующих клеток в процессе их выделения. Помимо этого метод позволяет работать с микроколичествами крови (Шилов, Ю.И. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей / Ю.И. Шилов, В.П. Владыкина, А.Т. Атнагузина // Перм. мед. журн. 1998. Т. 15, № 2. С. 3-9.). Пробы инкубировали 20 минут при 37 С, после чего готовили
7 мазки, которые после фиксации окрашивали по Романовскому. Активность фагоцитарной функции оценивали по фагоцитарному числу (количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 300 подсчитанных фагоцитов) и активности фагоцитоза (количество клеток, захвативших объекты фагоцитоза, из 100 подсчитанных фагоцитов), всего просчитано 1100 мазков. Дифференцированный подсчёт клеток проводился по морфологическим признакам биомикроскопическим методом.
Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по результатам РБТЛ. Гепаринизированную кровь перемешивали и помещали в термостат при температуре 37 С на 60-90 мин. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. После центрифугирования верхний слой плазмы снимали, а осадок ресуспендировали в 2 мл полной культуральной среде, которую готовили ex tempore, на основе питательной среды 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина (Reanal, Венгрия), 10 мМ HEPES (]ЧГ-2-гидроксиэтилпиперазин-]ЧР-2-этансульфоновая кислота, «Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина сульфата. Использовали микрометод культивирования лимфоцитов в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах (завод "Медполимер", Санкт-Петербург). Каждая культура содержала 2*10 клеток в 0,2 мл полной культуральной среде, 10% ЭТС («Биолот», С-Петербург), фитогемагглютинин П (ФГА, «Sigma») в концентрациях 2,5 и 20 мкг/мл. Культивирование
9 О
осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО при 37 С в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи Н-метилтимидина в объеме 10 мкл. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» («Wallac», Финляндия). При подсчете использовали сцинтиляционную жидкость ЖС-107. В экспериментах in vitro использовали бета-эндорфин («Skytek laboratories», США) в концентрациях 10" - 10" М, мет-энкефалин и лей-энкефалин («Skytek laboratories», США) в тех же концентрациях.
Оценку кислородзависимой микробоцидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 15 мкг/мл и 150 мкг/мл. Агонист ц/8-опиатных рецепторов бета-эндорфин человека («Sigma», США) вносили
в культуры одновременно с индуктором в концентрации 10" М. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол (10" М). Регистрация результатов проводилась в течение часа с помощью многофункционального спектрофотометра TEC AN (Австрия).
Полученные результаты были обработаны статистически с помощью однофакторного дисперсионного анализа для парных данных и LSD-критерия Фишера для межгруппового
8 сравнения. Результаты, полученные в опытах с ЛЗХЛ, обрабатывали с помощью парного t-критерия Стьюдента.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Вся экспериментальная работа проведена соискателем лично на всех этапах получения исходных данных, научных экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Подготовка основных публикаций по выполненной работе производилась автором при непосредственной консультативной помощи научного руководителя. Основные положения диссертационной работы представлены на X Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2011 г.), IX конференция иммунологов Урала (г. Челябинск, 2011г.), XI Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2012 г.).
Положения, выносимые на защиту
1. Установлено, что модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-
эндорфином у доноров мужского пола наблюдается преимущественно в более молодом
возрасте в группах 20-29 и 30-39 лет и с его увеличением снижается, фактически исчезая в
группе доноров 50-59 лет. В то же время у женщин модулирующий эффект пептида на
пролиферацию лимфоцитов сохраняется более длительное время. Мет- и лей-энкефалины
модулировали пролиферативный ответ лимфоцитов преимущественно у доноров мужского
пола только в возрастной группе 30-39 лет. Мет-энкефалин модулировал пролиферативный
ответ у женщин в группе 50-59 лет.
2. У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную
способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает - в группе доноров 50-59 лет. У
доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на
фагоцитарную активность нейтрофилов зарегистрировано не было. Лей- и мет-энкефалины в
высоких концентрациях в группе доноров женского пола 30-39 лет угнетают фагоцитарную
активность нейтрофилов. В то же время, на поглотительную активность моноцитов
опиоидные пептиды не оказывают влияния во всех возрастных группах независимо от пола.
3. Продукцию активных форм кислорода лейкоцитами бета-эндорфин угнетает с
различной выраженностью во всех исследуемых нами возрастных группах независимо от
пола.
Научная новизна
В работе впервые проанализировано влияние опиоидных пептидов на реакции адаптивного и врождённого иммунитета в зависимости от пола и возраста. В работе установлено, что модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-эндорфином у
9 доноров мужского пола наблюдается преимущественно в молодом возрасте в группах 20-29 и 30-39 лет и с его увеличением снижается, фактически исчезая в группе доноров 50-60 лет.
8 то же время у женщин модулирующий эффект пептида на пролиферацию лимфоцитов
сохраняется более длительное время. Мет- и лей-энкефалины модулировали
пролиферативный ответ лимфоцитов у доноров мужского пола только в возрастной группе
30-39 лет. В группах доноров женского пола модулирующих эффектов лей-энкефалина не
зарегистрировано, а мет-энкефалин модулировал пролиферативный ответ у женщин в группе
50-59 лет.
У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает - в группе доноров 50-59 лет. У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на фагоцитарную активность нейтрофилов зарегистрировано не было. Продукцию активных форм кислорода бета-эндорфин угнетал во всех возрастных группах независимо от пола.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты существенно расширяют существующие представления о роли эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной регуляции иммунных реакций. В работе доказано, что способность опиоидных пептидов модулировать пролиферативную активность лимфоцитов и фагоцитарную функцию гранулоцитов существенно зависит от пола и возраста. В то же время, регуляция микробоцидной активности лейкоцитов опиоидными пептидами от пола и возраста не зависит. Бета-эндорфин снижает продукцию активных форм кислорода у доноров обоих полов во всех возрастных группах.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).
Публикации
Соискатель имеет 9 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано
9 научных работ, общим объёмом 1,34 печатных листов, в том числе 6 статей в научных
журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных
журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также
3 работы, опубликованные в виде тезисов в материалах Российских научно-практических
конференциях.
Объем и структура диссертации
