Содержание к диссертации
Введение
1.Введение 5
2. Литературный обзор 7
1. Физико-химические свойства ферржгротопорфирина IX 7
1.1 Спектры поглощения гемина 7
1.2 Агрегация металлопорфиринов в водных растворах. 9
1.3. Протолитические равновесия для феррипорфиринов в водных растворах 15
1.4. Солюбилизация гемина в мицеллах ПАВ 16
2. Гемин как модель каталазы и пероксидазы 20
2.1. Структура и механизм действия пероксидазы и каталазы 20
2.2 Кинетические закономерности разложения перекиси водорода на феррипорфиринах 23
2.3. Механизм реакции разложения перекиси водорода на феррипорфиринах 28
2.4. Пероксидазная активность железопорфиринов 33
3. Экспериментальная часть 39
1. Исходные вещества 39
2. Использованная литература 40
3. Приготовление рабочих растворов 41
4. Методики проведения экспериментов 41
4.Результаты и обсуздение 45
1. Физико-химические свойства гемина в водно-мицеллярных растворах 45
1.1. Измерение критической концентрации мицеллооб-разования в водных растворах ДСН и ЦТАБ 45
1.2. Влияние ПАВ на агрегационные свойства гемина 45
1.3. Зависимость степени мономеризации гемина от его концентрации в водно-мицеллярных растворах ПАВ 53
1.4. Определение константы димеризации в 5% ТХ-100, 8-Ю~2М ДСН и 6-10- ЦТАБ при фиксированном рН 55
1.5. Зависимость Щ от концентрации ПАВ 60
1.6. Кинетическое изучение димер-мономерного равновесия в водно- мицеллярных растворах 65
1.7. Протолитические равновесия гемина, солюбили-зованного в мицеллах ТХ-100, ЦТАБ и ДСН 68
1.8. Расчет констант равновесия между щелочной и кислой формами гемина, солюбилизованного в мицеллах различных ПАВ 72
2. Каталазная активность гемина в водно- мицеллярных растворах 77
2,1. Определение кинетических параїлетров каталазной реакции (анализ начальных скоростей) 77
2.2 Кинетическая схема реакции разложения перекиси водорода, катализируемой гемином 84
2.3. Кинетика каталазной реакции в растворах доде-цилсулъфата натрия 87
2.4. Кинетика каталазной реакции в воде, Тритоне Х-100 и цетилтриметиламмоний ацетате 92
2.5. Число каталитических циклов гемина в ходе каталазной реакции 97
2.6. Сопоставление кинетических параметров каталазной реакции в различных средах 103
3. Пероксидазная активность геміша и его комплексов в водных растворах ПАВ 108
3.1. Кинетические закономерности пероксидазной реакции в растворах гемина 108
3.2. Влияние природы гидроперекиси на пероксидаз-ную активность гемина 118
3.3. Влияние лигандного окружения гемина на перок-сидазную активность 127
Выводы 139
- Агрегация металлопорфиринов в водных растворах.
- Механизм реакции разложения перекиси водорода на феррипорфиринах
- Зависимость степени мономеризации гемина от его концентрации в водно-мицеллярных растворах ПАВ
- Расчет констант равновесия между щелочной и кислой формами гемина, солюбилизованного в мицеллах различных ПАВ
Введение к работе
'В последние годы все более широкое внедрение в практику получают биокатализаторы. Одним из способов их изучения является моделирование. В качестве модели гемсодержащих белков и ферментов широко исследуется феррипротолорфирин IX (гемин). Изучение модельной системы позволяет глубже понять механизм действия биологических катализаторов. Повышенный интерес многих исследователей к гемину и другим металлопорфиринам обусловлен также способностью этих катализаторов проводить с высокими скоростями и селективностью практически важные окислительно- восстановительные процессы. Кроме того, в последние годы гемин находит применение как метка в иммуноферментном анализе.
Большинство работ по изучению физико-химических и каталитических свойств гемина выполнено в воде или органических растворителях. При этом нередко исследователи ограничиваются измерением каталитической активности металлопорфиринов, не выявляя взаимосвязи между ее величиной и физико-химическими свойствами катализатора.
В последние годы интерес многих исследователей вызывают ме-таллопорфирины, включенные в мицеллы поверхностно-активных веществ (ПАВ). Интерес к этим системам обусловлен несколькими факторами. Водно-мицеллярные растворы нередко рассматриваются как модель микрогетерогенной среды - белковой глобулы. Использование водных растворов ПАВ позволяет значительно увеличить растворимость как металлопорфиринов, так и органических субстратов каталитической реакции, а также приводит к увеличению степени мо-номеризации металлопорфиринов. Солюбилизация гемина в мицеллах ПАВ защищает его от окислительной дестрродии под действием кислорода воздуха. В литературе имеется лишь небольшое число работ по
изучению физико-химических свойств гешша, включенного в мицеллы поверхностно- активных веществ, и отсутствуют сведения о каталитических свойствах гешша в этих системах.
В связи с этим в настоящей работе предпринято систематическое изучение физико-химических свойств и кинетических особенностей протекания каталазнои и пероксидазной реакций в одной из модельных систем - гемина в водно-мицеллярных растворах додецил-сульфата натрия(ДСН), бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ) и Тритона Х-ІОО (ТХ-100). Основными целями исследования были: I) изучение агрегационных свойств, в частности, димер-мономерного равновесия, гемина*, 2 ^становление закономерностей аксиального ли-гандирования на железо гемина присутствующих в растворе лигандов* 3)исследование протолитических равновесий в водно-мицеллярных растворах гемина; 4)выяснение кинетических закономерностей и определение кинетических параметров каталазнои реакции разложения перекиси водорода и окисления о-дианизидина перекисью водорода*, 5)изучение влияния на каталитическую активность гешша рН, природы субстратов и аксиальных лигандов.
Агрегация металлопорфиринов в водных растворах.
Спектры поглощения металлопорфиринов содержат полосу Сорэ при Х 400 нм с 5 10 М см и две полосы в видимой области с коэффициентами экстинкции на порядок ниже. Спектры поглощения мало чувствительны к инертным растворителям и высоко чувствительны к комплексообразующим и протонирующим реагентам /4/. Спектры мономерных форм гемина /в белках, органических растворителях/ характеризуются наличием острого пика в области Сорэ. Положение полос в видимой части спектра мономерного гемина в значительной степени зависит от лигандного окружения железа /4/. Обычно гемин используется в виде комплекса с С Г" /хлоргемин/. В апротонных органических растворителях хлоргемин может находиться в двух формах: форме мономерного катиона /ДМСО, диоксан/ или в виде комплекса хлоргемина /ДМФА, ДМА/. Спектры поглощения этих двух форм отличаются по величине коэффициента экстинкции полосы Сорэ и положению полос поглощения в видимой области /5/ /рис.2/. В водных растворах гемин в значительной степени димеризован /6/. Спектры поглощения димерного гемина и других металлопорфиринов характеризуются более низким значениемпоглощения в области Сорэ, чем мономерные формы / 6 5 10 М см/, полосы поглощения в видимой области размыты./7-9/,/рис. 5а,спектр I/. Анализ спектров поглощения гемина и других металлопорфиринов часто используется при изучении процессов агрегации, комплексообразования и протонирования. 1.2. Агрегация металлопорймринов в водных растворах. Процессы агрегации порфиринов и металлопорфиринов изучаются давно /10/. Образование димеров металлопорфиринов наблюдалось даже в органических растворителях /II/. Однако при концентрациях, обычно используемых в спектрофотометрическом анализе, ме- таллопорфирины в органических растворителях мономерны. Иная картина наблюдается в водных растворах металлопорфиринов.
Природные металлопорфирины (дейтеро-, копро-, протопорфирин) в значительной степени димеризованы даже в разбавленных растворах /6-9/. В работах /12-13/ методом седшлентации установлено наличие в водных растворах гемина в присутствии 0,01 М КОН ассоциатов с большим молекулярным весом. Однако наличие в водных растворах крупных ассоциатов отмечалось только в концентрированных раство рах гемина. При обычно используемых концентрациях гемина и других металлопорфиринов /10 -I0 4l/ процессы агрегации в воде. описыва ются схемой: КД / DlHHtf Для изучения процессов агрегации используются как кинетические, так и равновесные методы. К кинетическим методам относится метод температурного скачка, который позволяет определить индивидуальные константы скорости /I/ и, следовательно, величину константы димеризации Кд /7-9/. В равновесных условиях величина Кд определяется с помощью метода разбавления. Метод основан на изучении зависимости степени мономеризации от общей концентрации металло-порфирина. Из этой зависимости рассчитывается величина Кд. В эксперименте степень мономеризации определяется с помощью различных физических методов: спектрофотометрии, ЯМР- спектроскопии, потенциометрии и т.п. В любом случае степень мономеризации рассчитывается из изменения формы и положения сигнала при изменении концентрации металлопорфирина : в спектрофотометрии /6-9/, ширины линии и химического сдвига в ЯМР-снектроскопии /14,15/, формы и потенциала полуволны в потенциометрии /16/. Такими методагли величины Кд были определены для большой группы металлопорфиринов в различных условиях. Соответствующие величины собраны в /II/. Анализ этих данных показал, что константы димеризации металло-порфиринов зависят от следующих факторов: I/ природы металла в металлопорфиріше ; 2/ природы заместителя в порфириновом кольце ; 3/ величины рН раствора ; 4/ ионной силы раствора -Я ; 5/ природы буфера и природы соли, создающей ионную силу. Рассмотріш отдельно влияние каждого из перечисленных факторов на величину Кд. Процессы димеризации и агрегации характерны не только для водных растворов металлопорфиринов, но и для безметальных порфи-ринов /II/. Введение в порфириновую систему ионов металлов приводит, как правило, к значительному увеличению степени димеризации, т.е. величины Кд. В литературе не обсуждаются закономерности изменения величин Кд при варьировании природы металла.
Однако отмечается, что степень димеризации Ре-порфиринов выше, чем (k %nrtD/ ,Co-,ut - порфиринов, причем для е - порфиринов величина Кд выше, чем для соответствующих 5е -порфиринов /II/. общие закономерности. Во-первых, на величину Кд влияют электростатические факторы: наличие в кольце заряженных групп приводит к уменьшению величины Кд. Во-вторых, величина Кд возрастает при увеличении асимметрии --электронной системы порфири-на/9,14/: для Ре/1П/-протопорфирина величина Кд на 2 порядка выше, чем для других природных е/Ш/-порфиринов. В-третьих,степень мономеризации металлопорфиринов уменьшается при введении в порфириновое кольцо объемных заместителей, например, фенильных групп /17/. Влияние величины рН раствора на степень димеризации металлопорфиринов будет рассмотрено специально. Здесь можно отметить, что уменьшение величины рН раствора приводит к увеличению степени мономеризации металлопорфирина/6-9/. Степень мономеризации феррипорфиринов растет при увеличении ионной силы раствора /ji / /14,18/. По-видимому, роль ионной силы сводится к уменьшению электростатического отталкивания между мономерными единицами. Следует отметить, что двухвалентные катионы вызывают димеризацию металлопорфиринов в большей степени, чем одновалентные /18/. В литературе высказывались различные точки зрения на строение димеров металлопорфиринов и, в частности, железопорфиринов. Лемберг в 1949 г. предположил, что димеры железопорфиринов образуются за счет ионных взаимодействий пропионовокислой группы одного порфиринового кольца с е другого кольца /19/. Однако эта точка зрения оказалась несостоятельной, поскольку этерифи-кация карбоксильных групп пропионовокислых остатков порфиринового кольца не приводит к мономеризации железопорфиринов /20/. В работе /21/ выдвигалось предположение об образовании димеров феррипорфиринов за счет гидрофобных взаимодействий порфирино-вых колец. /Однако образование димеров металлопорфиринов связано, по-видимому, не только с этим фактором. Хоршо известно, что комплексы Ре с порфиринами характеризуются значительно более высокими величинами Кд, чем соответствующие порфирины/П/. Согласно предположению, выдвинутому Кларком,железопорфири-ны могут быть связаны в димер с помощью водных мостиков, подоб -но хлорофиллу, или кислородных мостиков /22/. К настоящему времени различными физико-химическими методами доказало, что мономерные единицы железопорфиринов связаны в димер посредством JL -оксо-мостика . Существование її -окео-мостиков в димерах железопорфиринов подтверждается методами Меабауэровской спектроскопии /23 / , ИК-спектроскопии по наличию полос колебаний связи Ре-0-Fe /24/, определением молекулярных весов /20/, а также теоретическими расчетами стоения димеров на основе данных рентгеноструктурного анализа/2 6/Согласно теоретическим расчетам строения димеров железопорфиринов угол Ре-0-Р-е составляет величину около 165 градусов для феррипротопорфирина IX. Ре/Ш/ в димерах железопорфиринов находится в высокоспиновом состоянии, при этом ионы Ре выходят из плоскости кольца в сторонурсислорода на 0,5 $../26,27/.
Механизм реакции разложения перекиси водорода на феррипорфиринах
Механизм взаимодействия феррипорфиринов с перекисью водорода близок к механизму ферментативной реакции. В работах /81,82/ сообщалось о получении промежуточного соединения в реакции дейтероферригема с перекисью водорода. Это соединение обладало как пероксидазной, так и каталазной активностью. При добавлении к дейтероферригему перекиси водорода наблюдалось изменение спектра поглощения, сопровождавшееся уменьшением поглощения в области Сорэ. При добавлении к этому производному дейтероферригема доноров водорода /гидрохинона, аскорбиновой кислоты/ наблюдалась быстрая регенерация исходного спектра. На основе этих данных был сделан вывод об образовании активного "пероксидазно-го" комплекса в реакции дейтероферригема с перекисью водорода. В остутствие донора водорода при использовании небольших избытков перекиси водорода также наблюдалась частичная регенерация исходного спектра, что было связано авторами с каталазной реакцией, протекающей через этот активный комплекс, в процессе которой регенерируется исходный гемин /81/. Реакция образования "пероксидазного" комплекса описывалась кинетикой псевдопервого порядка в условиях 100-1000-кратного избытка перекиси водорода по сравнению с дейтероферригемом. Изученная методом быстрой кинетики зависимость константы скорости от концентрации Н9О9 имела вид кривой с насыщением, на основании чего авторы предположили следующую схему образования активного комплекса: где ДФГ - дейтероферригем, ДФГ НрОр - комплекс Михаэлиса, Были рассчитаны величины 1 =10,5 с иК= 201 М /81/. Однако авторы этой работы не учитывали влияния димеризации дейтероферригема и рН на индивидуальные константы образования активного промежуточного комплекса. Эти факторы были учтены в работе /83/. В этой работе методом остановленной струи изуча лась зависимость скорости образования "пероксидазного" комплек са от концентрации дейтероферригема. Было показано, что скорость этой реакции пропорциональна концентрации мономерной формы дей тероферригема. Авторы предлагают следующую схему каталазной реакции : о о где М - мономерный дейтероферригем, M HpOg - комплекс Михаэ-лиса, М ""- активный "пероксидазный" комплекс.
Б работе /76/ из зависимости константы образования активного комплекса от рН авторы делают вывод об участии Н02 -ионов как в образовании комплекса Михаэлиса, так и в последней стадии взаимодействия активного комплекса М55 со второй молекулой Н202. Были рассчитаны величины Ъд&= 1,7" 10 IF с и %. -= 6-10--1, . Б реакции образования "пероксидазного" комплекса перекись водорода может быть заменена на другие окислители: С102-/84/, производные пероксибензойных кислот /85/. Авторами работы /85/ методом спектрофотометрического титрования ферригема производными пероксибензойных кислот с различными заместителями в бензольном кольце установлена стехиометрия реакции: [ферригема :[R00IIJ= 2:1. Пероксибензойная кислота обладает двумя окислительными эквивалентами, поэтому формальная степень окисления железа в промежуточном "пероксидазном" комплексе дейтеро- ферригема равна +4. Авторы объясняют этот факт двумя различными способами: либо " пероксидазный" комплес является аналогом соединения П пероксидазы, либо при взаимодействии HgOg с дейте-роферригемом образуется сначала аналог соединения I, который затем быстро реагирует с исходным мономерньм или димерным ферри-гемом, образуя спектрально регистрируемый димерный "пероксидазный" комплекс. Тагам образом,природа "пероксидазного" высокооки-сленного комплекса остается не ясной. Следует отметить, что промежуточный "пероксидазный" комплекс был зарегистрирован спектрально только для дейтероферригема. Для других железопорфиринов такой комплекс не зарегистрирован. Вопрос об изучении каталазной активности железопорфиринов тесно связан с вопросом об его окислении, поскольку в процессе каталазной реакции в этих системах происходит разрушение катализатора. Этот процесс сопровождается характерными спектральными изменениями: уменьшением интенсивности поглощения на полосе Сорэ, размыванием полос поглощения в видимой области/86/.Вследствие этого многие работы по изучению каталазной реакции с участием феррипорфиринов проводятся по оценке начальных скоростей реакции. Процесс окисления железопорфиринов протекает как под действием перекиси водорода, так и кислорода воздуха. В обоих случаях реакция протекает сложным образом через несколько промежуточных стадий, в ходе которых образуются бил ивер,цин и бесцветные бил-пигменты: биливердин бил-пигменты где М - CHg-группа, Р - СН2-СН2-С00"-группа, X- СН=СЇЇ2 для протоферригема,-Н - для дейтероферригема, -СЇЇ2-СНС для мезо-ферригема, -СН2-СН2-С00Н для копроферригема. Для протоферри-гема первой стадием окисления является , по-видимому, окисление винильных групп или , так называемое, "старение" гемина /87/. Влияние процесса окисления на кинетику каталазной реакции было изучено в работах /66,88/. Автор работы /88/ методом остановленной струп и методом масс спектрометрии изучил кинетику окисления дейтерошерригема 1000-кратными избытками перекиси водорода. Была зарегистрирована нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации дейтероферригема. Обработка этих данных с учетом степени мономеризации позволила автору сделать вывод об участии в реакции окисления только мономерной формы дейтероферригема. Из зависимости скорости реакции окисления от рН в работе делается вывод об участии в окислении Н02 -ионов.
Эффективные константы окисления для прото-, дейтеро-, копро-и мезопорфиринов Їе/Ш/ при различных значаниях рН и концентрациях катализатора были определены в работе /66/ методом численного решения системы дифференциальных уравнений, описывающих каталазную реакцию и окисление катализатора. Эти величины оказались близкими для различных железопорфиринов: На основе изложенных выше литературных данных можно сделать следующие выводы: 1. Общая активность железопорфиринов в реакции разложения пере- киси одорода меньше, чем активность ферментативной реакции 2. Механизм ферментативной и модельной реакции близки между собой. Лимитирующей стадией модельной реакции является стадия образования промежуточного высовоокисленного состояния. S. Константы скорости индивидуальных стадий каталитического разложения Н2О2 близки для мономерных железопорфиринов и ката-лаз ы. 4. рН-зависимость ферментативной и модельной реакций различны. Зто связано с тем, что перекись водорода принимает участие в этих процессах в форме HgCU - для ферментативной, и в форме НОр-- для модельной реакций. 5. В отличие от ферментативной, модельная реакция разложения перекиси водорода связана с окислением катализатора. Процесс окисления и каталазная реакция протекают через одни и теже промежуточные стадии. 2.4. Петюксидазная активность железопотзсбишнов. Окисление субстратов пероксидазы - ароматических аминов, фенолов, хинонов, аскорбиновой кислоты и т.п. - перекисью водорода может катализироваться не только ферментом пероксидазой, но и железопорфиринами. Скорость пероксидазнои реакции, катализируемой ферментом,на несколько порядков превосходит скорость реакции в присутствии железопорфирина. Несмотря на различия в скоростях этих реакций, в литературе сделан вывод о сходстве механизма модельной реакции с механизмом ферментативного процесса. Выше уже отмечалось, что при взаимодействии дейтерофер-ригема с перекисными соединениями наблюдалось образование спектрально регистрируемого пероксокомплекса, который назван в работе /81/"пероксидазным .1 Этот промежуточный пероксокомплекс вступает в реакции с донорами водорода или электронов. При этом происходит окисление субстратов пероксидазы и регенерация исходного катализатора.
Зависимость степени мономеризации гемина от его концентрации в водно-мицеллярных растворах ПАВ
При достаточно высоких концентрациях ПАВ наблюдается запреде-ливание спектральных изменений в области Сорэ /рис.8/, при этом конечный вид спектра поглощения гемина и значение коэффициента экстинкции в области Сорэ зависят от природы ПАВ. В литературном обзоре отмечалось, что автор работ /33,34,36/ на основе изучения взаимодействия гемина с ТХ-ЮО, ЦТАБ и ДСН делает вывод о полной мономеризации гемина при достаточно высоких концентрациях ПАВ и объясняет различие в спектрах поглощения в ДСН, ТХ-ЮО и ЦТАБ различием.в структуре мицелл и способе расположения мономерного гемина в мицелле. Для определения степени мономеризации гемина в концентрированных растворах ПАВ нами был использован метод разбавления. Концентрированный раствор гемина / л/ ЮМ / в 8 I0 М ДСН, 6 10 М ЦТАБ и Ъ% ТХ-ЮО при фиксированном рН разбавляли соответствующим раствором ПАВ такой же концентрации, регистрируя при этом спектры поглощения гемина. Если весь гемин, солю-билизованный в мицеллах различных ПАВ , мономерный, то спектры поглощения гемина, перестроенные в коэффициентах экстинкции, не должны зависеть от концентрации гемина. В противном случае, если гемин мономеризован лишь частично, в процессе разбавления раствора гемина должен происходить сдвиг димер-мономерного равновесия в сторону мономеризации. При условии спектрального различия димерной и мономерной форм гемина должна наблюдаться зависимость спектров поглощения, построенных в коэффициентах экстинкции, от концентрации гемина. Зависимость спектров погло- щения гемина в Ъ% ТХ-100 от концентрации гемина представлена на рис.9. Поскольку спектры поглощения гемина зависят от его концентрации, наїли был сделан вывод о существовании димерной и мономерной форм гемина в Ъ% ТХ-100. Представленные на рис.9 спектральные изменения гемина в Ъ% ТХ-100 при разбавлении его раствором Ъ% ТХ-100 могут быть связаны только с процессом моно-меризации, т.к. характер этих изменений и положения изобести-ческих точек совпадают с представленными на рис.56, которые отражают процесс мономеризации гемина при добавлении ПАВ к водному раствору гемина. Зависимость спектров поглощения от концентрации гемина наблюдается также в 8 Ю"2М ДСН и 6#І0 2М ЦТАБ /рис. 10/, что свидетельствует о существовании димер-мономерного равновесия и в этих системах.
Таким образом, I/ при добавлении ПАВ к раствору димерного гемина в воде образуются смешанные агрегаты гемин-ПАВ; 2/ при достижении критической концентрации мицелло-образования происходит резкое увеличение числа мицелл и, вследствие разбавления гемина в мицеллярной фазе, наблюдается его мономеризация; 3/ при высоких концентрациях ПАВ, когда объем мицеллярной фазы изменяется при дальнейшем добавлении ПАВ незначительно, процесс мономеризации практически прекращается; 4/ процесс мономеризации гемина в концентрированном растворе ПАВ можно продолжить путем разбавления раствора гемина. 1.4. Определение константы диметжзании в Ъ% ТХ-100. 8 10 М ДСНмономеризации. гемина; fMJ, [Д], и [TJ0- концентрации мономера, димера и общая концентрация гемина в растворе.,соответственно; ц, бттЖ - коэффициенты экстинкции при фиксированной длине волны мономера, димера и эффективная величина, отнесенная к общей концентрации гемина, соответственно; Кд - константа димеризации. Величина Ли Ктг может быть определена, если известны соотве тствующие величины 5од, 5тгИ 5. Величина д определялась двумя способами: I/ В 5$ ТХ-100 и 6 10 М ЦТАБ - из предельных спектров поглощения димерного гемина с измененньм по сравнению с водным раствором лигандным окружением /рис.5а/; 2/ Методом, предложенным в работе /6/ - из зависимости , полученной преобразованием уравнения /4/ при условии, что концентрация димера много больше концентрации мономера, т.е. /«1. Экспериментальная зависимость 400 от —— для гемина в Ъ% ТХ-100 представлена на рис.11. Величины S-n 400 » полненные для гемина в ПАВ двумя способами, совпадают в пределах ошибки эксперимента и составляют величины, приведенные в Табл.2. Величиныёэд 400 0ПРеДелялись из предельных спектров поглощения при разбавлении гемина в 8 НГ2М ДСН и 6 Ю-2 М Д. Для гемина в Ъ% ТХ-100 в исследуемом диап-азоне концентраций / 8 10 г 10" М / запределивания спектров не наблюдалось. Всвязи с этим для нахождения 400 и % в это сжстеме мы применили машинную обработку экспериментальных данных. Зная величины Sir 400 и Г Из Табл.2 следует, что м близки для гемина, солюбили-зованного в мицеллах различных ПАВ. Более того, при разбавлении гемина в Ъ% ТХ-ЮО и 6.10"2м ЦТАБ появляются полосы поглощения. присутствующие в спектре поглощения мономерной формы гемина в 8 10 М ДСН /рис.12/. На основании этих данных нами был сделан вывод о независимости спектров поглощения мономерных форм гемина, солюбилизованного в шщеллах, от природы ПАБ при рНг»7,0, Однако величина Кд для гемина зависит от природы ПАВ /Табл.2/, т.е. при фиксированной концентрации гемина степень его моно-меризации падает в ряду ДСН ЦТАБ ТХ-Ю0. Возможно., такая зависимость величин Кд от природы ПАБ связана с размерами мицелл. Согласно /107/ размеры мицелл последовательно растут в ряду ДСН ЦТАБ ТХ-100.
Вероятно, в небольшой по размеру мицелле ДСН / ее диаметр 30 & / оказывается энергетически выгодной солюбилизация гемина в мономерной форме. Отметим, что диаметр мономерной молекулы гемина составляет І0 І./80/. 1.5. Зависимость Кд от концентрации ПАВ. Степень мономеризации гемина и,следовательно,величина Кд зависят от концентрации ПАВ. Используя величины оо М 400 / Табл.2/ и (5 400» получешне РІЗ зависимостей, представленных на рис.6 и 10, можно рассчитать по уравнению /4/ величины Кд для гемина в растворах с различным содержанием ПАБ/Табл.З -: 5/. С увеличением концентации ПАВ величины Кд уменьша готся на несколько порядков. агрегатах или мицеллах/. Для гемина в водных растворах ТХ-100 в предмицеллярной области концентраций ПАВ происходит только смена лигандов димерного гемина, тогда как при концентрациях вцше ККМ начинается процесс мономеризации. В этой системе моно- меризация гемина происходит в результате его разбавления в мицел- лярной фазе. Нетрудно показать, что " С - ККМ кд = кд " тш—, где С - концентрация ТХ-100 в объемных процентах, —JQQ - объемная доля мицеллярной фазы. Величины К, рассчитанные для гемина в растворах ТХ-100 различной концентрации, представлены в Табл.3. Величина Щ ,как и следовало ожидать, мало зависит от концентрации ТХ-100. Некоторый рост Кд наблюдается при высоких концентрациях ТХ-100. Это может быть связано с изменением структуры мицелл, что не учитывает наша "двухфазная"модель. Полученное значение ЇЙ OL З ЮТ позволяет предсказать степень мономеризации гемина при любой общей концентрации гемина, если конценрация ТХ-100 находится в интервале от 0,5 до 3 об.% /именно этот интервал концентраций ТХ-100 используется наиболее часто/. Для водных растворов гемина в ДСН и ЦТАБ процесс мономеризации начинается уже в предмицеллярной области / в агрегатах ПАВ - гемин/ и продолжается далее при концентрациях ПАВ выше ККМ. Для нахождения концентраций Д и М в "органической" фазе в этих двух системах необходимо знать объемную долю агрегатов в предмицеллярной области. Однако мы не располагаем данными о составе этих агрегатов и распределении поверхностно-активного вещества между агрегатами и раствором. В связи с этим для водного раствора геминавДСН и ЦТАБ величины К рассчитаны не были. 1.6. Кинетическое изучение димер-мономерного равновесия в водно-миделляшых растворах. Выше было показано, что гемин в водных растворах ТХ-100, ЦТАБ и ДСН при рН 7 существует в двух равновесных формах Д и М. і Степень мономеризации гемина определяется величиной Кд= g/fej.
Расчет констант равновесия между щелочной и кислой формами гемина, солюбилизованного в мицеллах различных ПАВ
Гемин в Ъ% ТХ-ЮО при рН 6,0 находится в двух равновесных формах - димерной и мономерной /Д и М/. Величина Кд такова, что при концентрации л,1СГ% практически весь гемин находится в димерной форме. При рН 3,0 весь гемин переходит в форму мономерного катиона /МН/. Диссоциация димеров гемина с образованием протонированных мономеров может быть описана схемой: Эффективные константы, очевидно, имеют сложную структуру. Входящие в них константы индивидуальных равновесий из эксперимента определить не удается. Тем не менее полученные величины Kg в ЦТАБ и ДСН можно использовать для вычисления концентраций основных форм гемина в этих системах. 2. Каталазная активность гемина в водно-мицеллярных растворах. 2.1. Определение кинетических параметров каталазной реакции /анализ начальных скоростей/. Скорость каталазной реакции в присутствии гемина измерялась по колическтву выделившегося кислорода. Каталазная реакция была изучена для гемина в 5-10- ДСН, 6 10 2М ЦТААц, Ъ% ТХ-ЮО и для сравнения в буферном растворе. Типичные кинетические кривые накопления кислорода представлены на рис 20. Анализ зависимости начальной скорости каталазной реакции /ь / от концентраций HgOg, катализатора и рН показал следующее. Порядок реакции по перекиси водорода равен I для гемина в ДСН и ТХ-ЮО. Зависимость t& от H Og для гемина в воде и ЦТААц имеет вид кривой с насыщением /рис.21/. Это согласуется с литературными данными, из которых следует, что для гемина в воде порядок каталазной реакции по Н2О2 изменяется от I до 0 /69/. Завсимость 1Х0 от концентрации гемина /Г/ линейна в ДСН и нелинейна в присутствии других ПАВ /рис.22/. Это связано с тем, что в ДСН практически весь гемин мономерен в той области концентраций, в которой мы работаем. В воде, ЦТААц и ТХ-ЮО наблюдаемая нелинейность связана с димер-мономерным равновесием в этих средах. Используя полученные нами ранее величины Кд=1.3 ТО Гдля ТХ-ЮО и Кд = 2,5 Ю5 М для 6#Ю 2М ЦТААц, а также радоитанную из литературных данных /6/ величину Кд = 4,5 10 М для гемина в воде при рН=Ю,0, мы построили зависимость начальной скорости реакции от концентрации мономерного гемина в растворе, /рис. 22/. Полученная линейная зависимость показывает, что активной является мономерная форма гемина во всех четырех системах. Зависимость начальной скорости реакции от рЫ представлена Рост скорости реакции при уменьшении рН согласуется с высказанным в литературе предположением об участии в реакции НС 2 -ионов.
В литературном обзоре отмечалось влияние компонент фосфатного буфера на скорость каталазной реакции, результатом чего является нелинейная зависимость скорости каталазной реакции от I/CH+J. Этот факт подтверждается в наших экспериментах. Вследствие этого анализ рН-зависимости каталазной реакции в наших системах затруднен. Кроме того,при обработке рН-зависимости необходимо учитывать влияние рН на лигандное окружение железа гемиыа, а также рН-зависимость констант индивидуальных стадий реакции. Информации об этих процессах в литературе явно недостаточно, поэтому мы не анализировали рН-зависимость реакции и проводили математическую обработку кривых накопления кислорода, полученных при постоянном рН. Из представленных выше данных следует, что для каталазной реакции гемина в растворах ПАВ справедливы качественные закономерности, установленные в литературе для водных растворов ферриге-мов: I/ участие в реакции мономерных форм катализатора; 2/ участие Н0р"-ионов и Э/ возможное изменение порядка реакции по %С 2 от I до 0. Величины #к и К являются эффективными и представляют собой комбинацию констант индивидуальных стадий. Некоторую информацию об этих константах можю получить из аналі іза полной кинетической кривой накопления кислорода, который будет проведен ниже. 2.2.Кинетическая схема реакции разложения перекиси водорода, катализируемой гемином. В литературном обзоре была приведена схема реакции разложения перекиси водорода на гемине, предложенная в работе/66//схема/3//. Согласно этой схеме, реакции разложения HgO и окисления гемина протекают через два различных промежуточных соединения. Однако в литературе нет каких-либо данных о существовании двух различных промежуточных форм гемина. Всвязи с этим мы будем считать, что обе эти реакции протекают через "пероксидазный" комплекс гемина, зарегистрированный как кинетически, так и спектрально/81/. Согласно литературным и полученным нами данным реакция разложения Н9О9 в воде, ДСН,ЦТААц и ТХ-100 катализируется мономерной формой гемина.В предложенной в литературе схеме/3/ не рассматривается стадия установления равновесия между димерной и мономерной формами гемина. Во всех известных в литературе работах по изучению каталазной активности ферригемов, в том числе и для протоферригема, авторы считали, что димер-мономерное равновесие устанавливается быстро. По-видимоглу, это справедливо для большинства ферригемов,но не для е/Ш/-протопорфирина.
В самом деле, для дейтеро-, гемато-, копроферригемов методом температурного скачка определялись величины %- и «2 и их зависимость от рН/7-9/. Согласно полученным данным в области рН7-9, где.обычно проводится изучение каталазной реакции,величина %т "10 IVT с Р Ю -гЮ с . Поскольку каталазная реакция идет втечение нескольких минут, действительно можно считать, что димер-мономерное равновесие устанавливается достаточно быстро, и процесс образования мономерной формы гемина из димерной не может лимитировать скорость реакции. Однако для протоферригема это условие, по-видимому не выполняется. При рН 10,0 для протоферригема 1 = / 2=4,5-101%-1. Даже если kj 108Ь/Г1с""1, то к2 2 Ю 3с Следовательно, димер-мономерное равновесие в водаых растворах протоферригема устанавлргвается за несколько минут. Выше приводилось также определение констант скорости мономеризации.гемина в ТХ-100 и ДСН, которые составили соответственно «2 =2,4 10"с и JL= 7,3. Из приведенных величин слелует, что димер-мономерное равновесие в водных и водно-мицеллярных растворах протоферригема устанавливается медленно. Зто надо учитывать в общей схеме каталазнои реакции. Из литературы известно, что обмен лигандов гемина происходит за времена несколько десятков или сотен миллисекунд /33-35/. Следовательно, можно считать, что между М и М НОр" устанавливается быстрое равновесие. Об этом же свидетельствуют литературные данные по получению промежуточного "пероксидазного"комплекса /81/. С учетом этого для описания изменения во времени концентраций всех веществ, участвующих в процессе каталазнои реакции, следует использовать следующую систему дифференциальных и алгебраических уравнений: Из уравнения /15/ видно, что кинетика накопления кислорода должна описываться экспонентой с показателем -I/B. Показатель экспоненты определяли по методу іуггенгейма /115/ /рис.24/. Количество циклов гемина в процессе каталазной реакции определялось из анализа начальных скоростей реакции по формуле /14/ с использованием найденных значений І/В. Таким способом анализировались три серии кинетических кривых накопления кислорода:1/при различных концентрациях гемина и постоянной концентрации В С , 2/при различных рН и постоянных концентрациях гемина и Нг ; В/при постоянной концентрации гемина и различных концентрациях Н9О9. Величины пи І/В, определенные из первой серии кривых, представлены на рис.25. Видно,что обе эти величины не зависят от концентрации гемина, что подтверждает .применимость уравнения /13/ для описания кинетики накопления кислорода в 5 10 М ДСН. Анализ количество циклов гемина в процессе каталазной реакции не зависит от величины рН раствора /рис.26/. Зависимость/г и І/В от концентрации Н202 представлена на рис.27. Проанализируем зависимости В от концентрации I Og.
