Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Целлюлазы в биотехнологии 9
ГЛАВА 2. Грибные и бактериальные целлюлазные системы. продуценты «нейтральных» целлюлаз 11
ГЛАВА 3. Общая характеристика целлюлолитических ферментов 14
3.1. Компонентный состав целлюлазных комплексов 14
3.2. Механизм действия целлюлаз 20
3.3. Доменная структура целлюлаз 25
3.4. Современные представления о классификации целлюлаз 26
ГЛАВА 4. Получение рекомбинантных целлюлаз и регулирование их свойств с помощью генно-инженерных методов 29
Экспериментальная часть 34
ГЛАВА 5. Объекты исследования и методика эксперимента 34
5.1. Исходные вещества 34
5.2. Аналитические методы 36
5.3. Методы определения активности 37
5.4. Определение активности ферментов с помощью окрашенных субстратов 38
5.5. Определение тополитической активности целлюлаз 38
5.6. Проведение ферментативного гидролиза микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозы 39
5.7. Определение состава продуктов реакции гидролиза МУФ-целлобиозида 39
5.8. Методы изучения стабильности целлюлолитических ферментов 40
5.9. Методы изучения адсорбционных характеристик ферментов 40
5.10. Определение кинетических параметров ферментов 41
5.11. Выделение и очистка индивидуальных целлюлолитических ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum 41
5.12. Выделение рекомбинантной эндоглюканазы с молекулярной массой 25 кДа .42
5.13. Определение биохимических параметров очищенных ферментов 43
5.14. Определение молекулярно-массового распределения (3-глюкана ячменя 44
5.15. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго на целлюлозной матрице 44
ГЛАВА 6. Выделение и очистка основных компонентов целлюлазного комплекса chaetomium cellulolyticum. Исследование их специфичности 46
6.1. Схема очистки ферментов С. cellulolyticum 46
6.2. Субстратная специфичность выделенных ферментов 52
ГЛАВА 7. Зависимость активности и стабильности ферментов с. Cellulolyticum от температуры и Рн среды 56
7.1. рН- и температурные зависимости активности ферментов 56
7.2. Стабильность ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum 59
ГЛАВА 8. Кинетические свойства ферментов целлюлазного комплекса с. cellulolyticum 64
8.1. Определение типа действия белков С. cellulolyticum на основе полного ферментативного гидролиза карбоксиметилцеллюлозы и микрокристаллической целлюлозы 64
8.2. Изменение молекулярно-массового распределения |3-глюкана при действии целлюлаз С. cellulolyticum 66
8.3. Кинетические параметры ферментов 71
8.4. Ингибирование продуктом реакции целлобиогидролазы целлюлазного комплекса С. cellulolyticum 72
8.5. Адсорбционные характеристики ферментов 73
8.6. Синергизм между эндоглюканазами и целлобиогидролазой 73
ГЛАВА 9. Исследование возможности применения целлюлаз С. cellulolyticum 75
9.1. Тополитическая активность ферментов 75
9.2. Оценка влияния целлюлаз С. cellulolyticum на ресорбцию индиго 78
ГЛАВА 10. Получение и свойства рекомбинантной эндоглюканазы с молекулярной массой 25 кДа 81
10.1. Получение рекомбинантного фермента 81
10.2. Свойства рекомбинантной Эндо-25 87
Выводы 94
Список литературы 95
- Грибные и бактериальные целлюлазные системы. продуценты «нейтральных» целлюлаз
- Выделение и очистка индивидуальных целлюлолитических ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum
- Стабильность ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum
- Изменение молекулярно-массового распределения |3-глюкана при действии целлюлаз С. cellulolyticum
Введение к работе
История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазныи комплекс, считалась его способность к глубоким осахариванию и деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [1], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [2-4].
В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных катализировать реакцию на поверхности целлюлозного субстрата, не приводящей к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [5, 6]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации текстильных (джинсовых) изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных изделий с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. [7, 8, 9, 10]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.
Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны
ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения
процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и достаточно высокая температура [9, 11]. В связи с этим наиболее перспективными для использования в качестве тополитических ферментов являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, показывающие высокую активность и стабильность при нейтральных рН (рН 6-8) и температурах 50С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классической генетики или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств гомогенных ключевых тополитических ферментов, входящих в состав ферментных комплексов, продуцируемых перспективными штаммами-продуцентами.
В последнее десятилетие появилось еще одно прогрессивное направление развития энзимологии целлюлаз, основанное на создании монокомпонентных тополитических ферментных препаратов для обработки ткани, использования в составе моющих средств и других целей. Такие препараты получают клонированием генов специально подобранных индивидуальных тополитических ферментов в штаммы-суперпродуценты (Aspergillus, Trichoderma, Bacillus и др.), и они, в отличие от полных целлюлазных комплексов, дают возможность максимально эффективно обрабатывать текстильные изделия на основе природных волокон, не приводя к потери их прочности.
Ранее [12] нами совместно с ИБФМ РАН был осуществлен скрининг продуцентов «тополитических» целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных рН, в результате чего был найден обладающий такой способностью мицелиальный гриб Chaetomium cellulolyticum, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался Цель настоящей работы заключалась в выделении основных компонентов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum, выборе ключевого
фермента, обладающего наиболее высокой тополитической активностью и стабильностью при нейтральных и щелочных рН и создании на его основе монокомпонентного ферментного препарата.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Разработать схему выделения и очистки «мажорных» компонентов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum, обладающих тополитической активностью.
Исследовать биохимические и каталитические свойства выделенных компонентов.
Изучить влияние рН на активность и стабильность полученных гомогенных целлюлолитических ферментов С. cellulolyticum.
Исследовать тополитические свойства выделенных компонентов и выбрать из них наилучший (ключевой) с точки зрения высокой тополитической активности и стабильности при нейтральных и щелочных рН.
Изучить первичную аминокислотную последовательность и структуру гена, кодирующего ключевой фермент. Используя методы генной инженерии, получить на его основе рекомбинантный фермент.
Исследовать биохимические и физико-химические свойства рекомбинантного фермента и сравнить их со свойствами нативного фермента.
Грибные и бактериальные целлюлазные системы. продуценты «нейтральных» целлюлаз
В природе процесс деградации целлюлозы осуществляется, в основном, грибами и бактериями. Среди наиболее хорошо охарактеризованных целлюлазных систем можно выделить гриб белой гнили Phanerochaete chrysosporium (Sporotrichum pulverulentum); [58-59] и грибы мягкой гнили Fusarium solani [60], РепісіШит funiculosum [61-62], Talaromyces emersonii [63-65], Trichoderma koningii [66-69] и Т. reesei [70]. Среди анаэробных грибов можно выделить гриб Neocallimastix frontalis, обнаруженный в желудке быка, который продуцирует внеклеточную целлюлазную систему, эффективно катализирующую гидролиз кристаллической целлюлозы [71-72]. Среди аэробных целлюлолитических бактерий наиболее хорошо изучены Cellulomonas sp. [73], Cellvibrio sp. [74], Microbispora bispora [75] и Thermomonospora sp. [76-77]. Примерами анаэробных целлюлолитических бактерий являются Acetivibrio cellulolyticus [78-79], Bacteroides cellulosolvens [80], Bacter. succinogenes [81], Clostridium thermocellum [82-83], Ruminococcus albus [84-85] и Bacillus sp. [86-87].
Надо отметить, что бактерии, по сравнению с грибами, продуцируют гораздо меньшие количества целлюлолитических ферментов, и их целлюлазные системы отличаются друг от друга. Так, грибы секретируют три типа целлюлаз: эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы (целлобиазы), действующие в синергизме, но не ассоциированные друг с другом. Целлюлолитические бактерии секретируют, в основном, эндоглюканазы, большинство из которых проявляет низкую активность по отношению к кристаллической целлюлозе [88-96]. «Грибоподобные» прокариоты, такие как актиномицеты и относящиеся к ним коринобактерии {Cellulomonas), гидролизуют целлюлозу по механизму, схожему с грибным, когда их целлюлолитические ферменты не ассоциированы в культуральной жидкости [97]. Наоборот, для многих анаэробных бактерий было обнаружено, что их целлюлазные компоненты ассоциированы в мультимолекулярные комплексы (целлюлосомы), причем их четвертичная структура, по-видимому, является ключевым фактором, определяющим степень эффективности гидролиза кристаллической целлюлозы [98]. Конечным продуктом гидролиза целлюлозы является глюкоза, которая широко используется в различных отраслях промышленности (топливная, пищевая, химическая и т. д.). В связи с этим на протяжении нескольких десятилетий усилия исследователей были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы или, другими словами, обладающих высокой «осахаривающей» способностью. Целлюлазы, отвечающие этим требованиям, имели, как правило, кислый рН-оптимум (рН 4-5) и высокую адсорбционную способность на кристаллической целлюлозе [1-4]. Наиболее эффективными продуцентами таких ферментов являлись грибы родов Trichoderma, Penicillium, Aspergillus и Humicola [99-105].
В последние годы в связи с использованием целлюлазных препаратов для отбеливания бумаги, обработки текстильных изделий, производства моющих средств с биодобавками все более актуальной задачей становится получение целлюлаз с новыми технологическими свойствами, активных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН среды.
Известно, что у анаэробных и аэробных бактерий максимальная активность целлюлаз наблюдается в диапазоне рН 5,5-7,5, оптимум действия целлюлаз базидиомицетов - при рН 3,9-5,5, микромицеты наиболее активно проводят разрушение целюлозы при рН среды от 4,3 до 8 [106]. Среди микромицетов целлюлазы с оптимумом рН в нейтральной и щелочной областях обнаружены у представителей родов Humicola [107-108], Acremonium [109], Trichoderma [ПО], Aspergillus, Bipolaris, Neosartorya [108], Chaetomium [111]. Так, например, H. insolens продуцирует пять эндоглюканаз, показывающих оптимумы активности в диапазоне рН 7-8,5, и две целлобиогидролазы, имеющие рН-оптимумы 5,5 и 9,0 [107]; одна из эндоглюканаз Т. reesei с молекулярной массой 25 кДа (EG ІП) имеет рН-оптимум 5,8 [ПО]; СИ. ihermophile var. coprophile продуцирует две целлобиогидролазы, проявляющих максимальную активность при рН 5,8 и 6,4 [111].
У бактерий целлюлазы с нейтральным и щелочным рН-оптимумом найдены у представителей родов Bacillus [86-87], Thermotoga [112], Fibrobacter [94, 113-114], Ruminococcus [115], Clostridium [116, 117-122], Pseudomonas [123] и некоторых других [124]: например, В. subtilis продуцирует нейтральную эндоглюканазу с оптимумом активности при рН 6 [87]; Bacillus sp. N-4 продуцирует щелочную эндоглюканазу с широким оптимумом активности в диапазоне рН от 6 до 10,5 [87]; R. albus продуцирует целлобиогидролазу с рН-оптимумом, равным 6,8 [115]; Т. maritima секретирует целлобиогидролазу с оптимумом активности в диапазоне рН 6,0-7,5 [125].
Грибы и бактерии секретируют во внеклеточную среду комплекс целлюлолитических ферментов, осуществляющих превращение целлюлозы до растворимых продуктов, В состав целлюлазного комплекса входят ферменты, различающиеся по специфичности: эндо-1,4-(3-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74), целлобиазы (р-глюкозидазы) (КФ 3.2.1.21) [126-127].
Выделение и очистка индивидуальных целлюлолитических ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum
Для «улучшения» природных ферментов применяются различные подходы. Одним из традиционных методов для улучшения свойств является сайт-направленный мутагенез, который позволяет, например, увеличить активность фермента, улучшить его некоторые, в частности, технологические, свойства или придать совершенно новые, такие как избирательность по отношению к субстрату, устойчивость к изменениям рН среды и окружающей температуры, стабильность при хранении [189]. Так, например, в случае (5-1,4-эндоглюканазы, продуцируемой грибом Macrophomina phaseolina, применение этого подхода позволило получить модифицированную эндоглюканазу, для которой минимальный размер субстрата составлял шесть глюкозных единиц, а не пять, как в случае нативного фермента, что дает возможность использования этого фермента для гидролиза сложных (комплексных) субстратов, таких как (3-глюкан [190].
Большое количество исследований в этой области было проведено для эндоглюканазы V из Н. insolens (45 семья) [9, 49, 191]. Специфические мутации в последовательности ДНК, кодирующей данный фермент, позволили получить набор различных вариантов родительской целлюлазы, проявляющих улучшенные технологические свойства. Для этого проводились следующие операции: 1) замещение одной или нескольких аминокислот в ЦСД, КД или линкере; 2) присоединение одной или нескольких аминокислот к линкеру; 3) присоединение другого ЦСД с противоположной стороны от КД. Проведенные модификации приводили к повышению активности фермента при щелочных значениях рН, увеличению стабильности в присутствии различных эффекторов (катионные ПАВ, окислители и т.д.), улучшению способности к удалению загрязнений и отделке текстильных изделий. Более того, удалением или заменой в линкере аминокислотных остатков, чувствительных к гидролизу протеазами, были получены целлюлазы, устойчивые к протеолизу. Подобной заменой аминокислотных остатков, участвующих в связывании с целлюлозой, или изменением заряда ЦСД посредством введения, удаления или замещения гидрофильных или гидрофобных аминокислот можно модифицировать адсорбционные характеристики целлюлоз, чтобы достичь наиболее эффективного действия фермента на хлопчатобумажную ткань без изменения ее прочностных характеристик.
Упомянутые выше подходы, однако, незначительно влияют на уровень продуктивности микроорганизмов-продуцентов (как правило, уровень продуктивности, по сравнению с родительскими штаммами, увеличивается в 1,5-2 раза) [192].
В последнее десятилетие с развитием молекулярно-генетических технологий и систем по клонированию генов грибов появилось новое направление для улучшения свойств природных штаммов, основанное на применении генно-инженерных методов. На первом этапе этой работы проводят скрининг и выделение штамма, продуцирующего белок с необходимыми свойствами, на втором этапе выделяют ген, кодирующий данный белок, и клонируют его в клетку-хозяина. В качестве последнего используются, например, бактерии Bacillus, грибы Aspergillus [189], Penicillium, Trichodermct [193-195] и некоторые другие, которые отличаются быстрым ростом, высокопродуктивны и нетоксичны. И, наконец, на третьем этапе, получают штамм, несущий множество копий данного гена, проводят анализ количества необходимого белка в трансформантах и, при необходимости, применяют дополнительные методы по улучшению свойств штамма.
Данный подход был успешно применен для модификации целлюлазных комплексов, продуцируемых грибами рода Trichoderma. Например, было изменено соотношение различных типов целлюлаз, секретируемых гиперпродуцентом -мутантным штаммом Т. reesei, что дало возможность получить новые штаммы, секретирующие более высокие количества специфической эндоглюканазы I при отсутствии мажорной целлобиогидролазы I, присутствующей в родительском штамме, и наоборот [195].
Воздействие эндоглюканазы Ш из Т. longibrachiatum на хлопчатобумажную ткань при испытаниях в составе моющих средств было более эффективным по сравнению с другими эндоглюканазами из этого же целлюлазного комплекса [196]. Кроме того, этот фермент имел нейтральный рН-оптимум и проявлял относительно высокую активность при щелочных значения рН, что делало его применение в текстильных процессах полезным и выгодным. Таким образом, возникла потребность в применении индивидуально эндоглюканазы Ш и получении, соответственно, штаммов Trichoderma, секретирующих целлюлазный комплекс, существенно обогащенный данным компонентом. Применение методов генной инженерии позволило получить штамм Trichoderma sp., модифицированный таким образом, что все компоненты целлюлазного комплекса, за исключением эндоглюканазы III, отсутствовали [197]. Аналогичным образом, использование генно-инженерных подходов позволило получить штаммы Trichoderma и Saccharomyces, продуцирующие ферментные комплексы, обогащенные эндоглюканазой V из 7! reesei, которая имеет нейтральный рН-оптимум (рН 6,0-6,5), высокостабильна и может быть использована в целлюлозобумажной, текстильной промышленности, а также в качестве кормовых добавок [50].
Стабильность ферментов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum
В технологических процессах обработки текстильных изделий, таких как биодепигментация или биоотделка, требуются ферменты, не только высокоактивные, но и стабильные в нейтральной и щелочной среде (рН 7-9). Эксперименты по изучению стабильности белков из С. cellulolyticum проводились при значениях рН от 5 до 9,6 и 50С. Упомянутые выше технологические процессы осуществляются обычно в течение 1-2 часов, поэтому максимальное время инкубирования ферментов в заданных условиях было выбрано равным 3 ч (рис. 13). Эндо-25 сохраняла в течение 3 ч инкубирования 100% КМЦазной активности при всех исследованных значениях рН. Эндо-43 сохраняла 100% активности при рН 5 и 6 и 65-70% КМЦазной активности при рН 7-8 в течение 3 ч. Однако при рН 9,6 полностью инактивировалась уже через 30 мин, а при рН 8,8 КМЦазная активность падала до 20% за 30 мин инкубирования. Эндо-50 сохраняла через 3 ч инкубирования 100% активности в диапазоне рН 5-8, а при щелочных рН (рН 9,6) через 30 мин полностью теряла активность. ЦБГ-55 показывала после 3 ч инкубирования 100% активности при рН 5, 6 и 7, 90% активности - при рН 8, 70% - при рН 8,8 и 40% - при рН 9,6.
Таким образом, самым стабильным ферментом при всех значениях рН являлась Эндо-25. Эндо-50 и ЦБГ-55 были наиболее стабильны в диапазоне рН 5-8, а Эндо-43 сохраняла стабильность только при рН 5-6. Суммируя данные по рН-зависимостям и рН-стабильности для выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. celltdolyticum, можно заключить, что Эндо-25 и ЦБГ-55 сохраняли высокие активности и при этом были стабильны в диапазоне рН от 5 до 8.
Принимая во внимание уровень активности и стабильность исследуемых ферментов при нейтральных и щелочных значениях рН мы пришли к выводу, что они потенциально могут быть использованы в составе моющих средств. При применении целлюлолитических ферментов по этому направлению поверхностно-активные вещества (ПАВ), входящие в состав моющих средств, могут влиять на активность и стабильность ферментов. Поэтому важно, чтобы ферменты сохраняли свою активность в присутствии ПАВ в течение, по крайней мере, 1-2 часов. В связи с этим нам представлялось интересным изучить влияние ПАВ на стабильность выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. cellulolyticum. Наиболее часто используемыми в моющих средствах являются анионные ПАВ, примером которых могут служить линейные алкилбензолсульфонаты, алкильный радикал которых содержит от 10 до 18 углеродных атомов [204].
Нами была изучена стабильность выделенных белков в присутствии натриевой соли Сп-алкилбензолсульфоната (LAS). Эксперименты проводились при 50 С и диапазоне рН от 4,8 до 9,0, концентрация LAS составляла 2,5 г/л (рис. 14). Надо отметить, что для всех эндоглюканаз КМЦазная активность наиболее быстро падала как при самом кислом (рН 4,8), так и при самом щелочном из исследуемых значении рН (рН 9,0). Так, в случае Эндо-43 и Эндо-50, они полностью инактивировались, соответственно, уже через 30 и 15 мин инкубирования (рис 14). Эндо-25 через 1 ч сохраняла 97% активности при рН 6,6 и порядка 70-80% активности при рН 5,6, 7,2 и 7,8; а через 2 ч инкубирования - порядка 60-70% КМЦазной активности в диапазоне рН 5,6-7,2 и 50% активности при рН 7,8. КМЦазная активность Эндо-43 через 30 мин инкубирования достаточно резко падала до 60% при рН 6,6 и 50% при рН 5,6 и 7,2 и в течение последующих 2,5 часов сохранялась на прежнем уровне. При рН 7,8 Эндо-43 сохраняла 40% активности в течение 1,5 часов инкубирования, а через 3 ч практически полностью теряла активность. КМЦазная активность Эндо-50 в диапазоне рН 5,6-7,2 изменялась практически одинаковым образом: в течение первых 30 мин инкубирования сохранялось 100% активности, за последующие 30 мин активность уменьшалась до 85% и в течение последующих 2 ч сохраняла свое значение. При рН 7,8 Эндо-50 была нестабильна: через час активность падала до 45%, а через 3 ч инкубирования фермент проявлял лишь 15% от максимальной активности.
ЦБГ-55, по сравнению с эндоглюканазами, была более стабильна: сохраняла 100% КМЦазной активности через 30 мин инкубирования в диапазоне рН 5,6-7,8, и через 1 ч - в диапазоне рН 5,6-7,2. Через 2 ч инкубирования фермент проявлял порядка 85-95% максимальной активности в интервале рН 4,8-7,8 и 70% КМЦазной активности при рН 9,0. Через 3 ч ЦБГ-55 проявляла порядка 65-70% максимальной активности при рН 6,6 и 7,8 и около 50-60%о активности при всех остальных значениях рН.
Таким образом, сравнивая стабильность выделенных ферментов в отсутствие и в присутствии LAS, можно заключить, что наименее чувствительными к присутствию ПАВ в системе оказались ЦБГ-55 и Эндо-25, поэтому они потенциально могут быть применимы в составе моющих средств на основе анионных ПАВ.
На основе анализа активности по отношению к разным субстратам выделенные компоненты целлюлазного комплекса С. ceUulolyticum с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа были классифицированы как эндоглюканазы, а фермент с молекулярной массой 55 кДа был отнесен к целлобиогидролазам. Однако, чтобы с полной достоверностью отнести выделенные ферменты к классу эндо- или экзодеполимераз, необходимо было получить дополнительные сведения о характере действия ферментов на полимерный субстрат. Для этого был проведен анализ соотношения общего количества Сахаров (ВС) и глюкозы, образующихся при гидролизе растворимого (КМЦ) и нерастворимого (МКЦ) целлюлозных субстратов (рис. 15). Эндо-25 и Эндо-43 не обладали активностью по отношению к МКЦ, поэтому для них был проведен гидролиз только КМЦ. Как видно из рис. 15, при действии этих ферментов на КМЦ глюкоза практически не образовывалась (относительное содержание глюкозы составляло 1,9% для Эндо-25 и 1,6% для Эндо-43). При действии Эндо-50 на КМЦ образовывалось несколько большее количество глюкозы, чем в случае Эндо-25 и Эндо-43, но не очень значительное: относительное содержание глюкозы в продуктах составляло 5%; при гидролизе МКЦ относительное содержание глюкозы составило 3%.
Изменение молекулярно-массового распределения |3-глюкана при действии целлюлаз С. cellulolyticum
В последнее время в процессах обработки джинсовых изделий с целью частичного удаления индиго ферменты практически вытеснили использовавшиеся ранее пемзу и химические реагенты. Однако при ферментативной обработке джинсовой ткани возникает одна немаловажная проблема - это ресорбция индигового красителя на белых нитях ткани, что портит внешний вид изделий для потребителя [210]. В ряде работ [6, 212] было показано, что главным фактором, способствующим ресорбции красителя, является связывание целлюлаз с поверхностью джинсовой ткани (адсорбционная способность фермента) - именно с адсорбированными ферментами связывается индиго при ресорбции. При этом, чем больше фермента сорбируется на поверхности ткани, тем выше степень ресорбции красителя. Поскольку исследуемые нами белки не адсорбировались на МКЦ, то логично было предположить, что при их использовании будет наблюдаться низкая ресорбция индиго на поверхности джинсовой ткани. Это предположение было проверено нами экспериментально.
Изучение влияния индивидуальных целлюлаз С. cellulolyticum на ресорбцию индиго (индекс ресорбции индиго) проводили при нормировании их по одинаковой весовой концентрации. Индекс ресорбции индиго (ИРИ) выражали в условных единицах, соответствующих интенсивности синего цвета на цветовой гистограмме изображения, полученного после сканирования образца белой хлопковой ткани, обработанной ферментом и индиго. В качестве контроля использовали ферментные препараты Т. reesei (#210.27) и P. verruculosum (#3-55.1), имеющие [41], соответственно, высокий и средний ИРИ. Кроме того, оценивали влияние на ресорбцию индиго и исходного ферментного препарата С. cellulolyticum (исходный комплекс) (рис. 21). Как видно из приведенной диаграммы, все исследуемые ферменты, за исключением Эндо-43, имевшей среднее значение ИРИ, характеризовались низким значением ИРИ. Так, значение ИРИ для Эндо-25 и ЦБГ-55 было в полтора раза меньше среднего показателя, а для Эндо-50 - даже в 2 раза.
Таким образом, с одной стороны, нашла новое подтверждение точка зрения о влиянии адсорбционной способности целлюлаз на ресобцию индиго, а с другой стороны, мы установили, что ферменты С. celliilolyticum не оказывают большого влияния на усиление ресорбции индиго при ферментативной обработке хлопчатобумажной ткани. Обобщая результаты, представленные в этой главе, следует сказать, что мы установили возможность применения целлюлаз С. celliilolyticum для обработки текстильных изделий, поскольку они обладали способностью удалять индиго с поверхности джинсовой ткани не приводя к ресорбции красителя.
Резюмируя полученные данные, можно отметить, что среди выделенных компонентов целлюлазного комплекса С. celliilolyticum ферменты с молекулярными массами 25, 43 и 50 кДа являлись эндоглюканазами, а фермент с молекулярной массой 55 кДа - целлобиогидролазой. Эндо-25 и ЦБГ-55 проявляли высокую активность при нейтральных и щелочных рН. Эндо-25, Эндо-50 и ЦБГ-55 были устойчивы в широком диапазоне рН. Все исследованные компоненты целлюлазного комплекса С. cellulolyticum проявляли низкую способность к усилению ресорбции индиго при ферментативной обработке хлопчатобумажной ткани. Наибольшую тополитическую активность, оцененную по эффективности депигментации джинсовой ткани, проявляла Эндо-25. Таким образом, принимая во внимание высокую стабильность, активность и тополитическую способность этого фермента, его можно рассматривать как ключевую тополитическую эндоглюканазу целлюлазного комплекса С. cellulolyticum.
Создание монокомпонентных тополитических ферментных препаратов для обработки ткани является перспективным направлением развития «текстильной» энзимологии. Такие препараты, в отличие от полных целлюлазных комплексов, позволяют максимально эффективно обрабатывать текстильные изделия на основе природных волокон без потери их прочности. Основной подход, который используется для создания монокомпонентных ферментных систем, - это, как уже упоминалось в литературном обзоре (гл. 4), клонирование индивидуальных тополитических ферментов в штаммы-суперпродуценты. В настоящее время в мире существует всего несколько примеров таких препаратов - ферментные препараты фирмы «Genencor» (США) на основе эндоглюканазы III из Т. reesei [57] и препараты фирмы «NovoNordisk» (Дания) на основе эндоглюканазы V из N. insolens [49].
Как уже отмечалось выше, Эндо-25 из С. cellulolyticum является ключевым тополитическим ферментом этого комплекса. Поэтому крайне перспективным представлялось создание монокомпонентного «текстильного» целлюлазного препарата на основе именно этого фермента. Для этой цели необходимо было прежде всего получить достаточное количество гомогенной Эндо-25. Как было показано в главе 6, разработанная нами схема очистки Эндо-25, состоящая из первичной стадии ионообменной хроматографии на DEAEoyopearl с последующим хроматофокусированием на Mono Р, позволила эффективно решить эту задачу.
Далее предстояло изучить характерные консервативные аминокислотные участки белка с тем, чтобы на основе их структуры синтезировать праймеры для поиска гена в библиотеке генов С. cellulolyticum. Работы по выделению и клонированию гена Эндо-25 проводились совместно с Институтом биоорганической химии РАН, Университетом Страсбурга и фирмой «Cayla» (Франция).
Для изучения характерных консервативных аминокислотных участков Эндо-25 подвергали обработке трипсином и бромцианом для расщепления его на пептиды. Для дальнейшего анализа были взяты мажорные пептиды с номерами 7, 8 (расщепление BrCN) и I, II (расщепление трипсином). Состав пептидов изучался на автоматическом секвенаторе "Applied Biosystem 471" по методу Эдмана. Состав пептидов представлен на рис. 22.
Результаты пептидного анализа позволили приступить к поиску гомологов этого белка. В результате проведенного сравнения аминокислотных последовательностей пептидов 7, 8, I и II с первичными структурами эндоглюканаз, найденных в базах данных GeneBank Database и Swiss Protein Database, было обнаружено, что эти пептиды проявляют высокую гомологию (выше 70%) с отдельными аминокислотными последовательностями эндоглюканаз из семейства К (45 семейство гликаназ). Гомология с эндоглюканазами других семейств не наблюдалась.
