Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Меланома.
1.1.1. Эпидемиология, факторы риска развития меланомы .
1.1.2. Роль молекулярно-биологических факторов в развитии меланомы.
1.2. Метастазирование.
1.2.1. Экспериментальные модели метастазирования.
1.2.2. Этапы и механизмы развития метастазов.
1.3. Коннексины — белки межклеточных щелевых контактов .
1.3.1. Молекулярная структура межклеточных щелевых каналов.
1.3.2. Функциональная значимость межклеточных щелевых контактов.
1.3.3. Роль коннексинов в опухолевом процессе.
1.3.4. Олеамид и блокирование функции межклеточных щелевых контактов.
2. Материалы и методы
2.1. Введение
2.2. Животные
2.3. Экспериментальная модель
2.4. Воздействие олеамидом
2.5. Группы животных
2.6. Морфологическая оценка
2.7. Статистическая обработка результатов.
Результаты собственных исследований
3.1. Влияние олеамида на развитие первичных опухолей и метастазов меланомы
3.2. Исследование влияния блокирования МЩК на распределение коннексина в клетках меланомы
3.3. Пролиферативная активность клеток меланомы
Обсуждение результатов собственных исследований
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Эпидемиология, факторы риска развития меланомы
- Коннексины — белки межклеточных щелевых контактов
- Группы животных
- Исследование влияния блокирования МЩК на распределение коннексина в клетках меланомы
Введение к работе
Проблема метастазирования злокачественных опухолей всегда привлекала к себе неослабевающее внимание исследователей и клиницистов. Актуальность вопроса о поиске мер, предотвращающих возникновение и развитие метастазов трудно переоценить. При этом важнейшие данные о механизмах, лежащих в основе данного явления, могут быть получены преимущественно при анализе результатов экспериментальных исследований (Stracke M.L., Liotta L.A., 1992).
Меланома - злокачественная опухоль кожи с высоким метастатическим потенциалом. Каждый год во всем мире регистрируется 160000 новых случаев заболевания меланомой (Ries L.A.G. и соавт., 2003). Наиболее часто она диагностируется у мужчин европеоидной расы в популяциях, проживающих в солнечном климате (Markovic S.N. и соавт., 2007). По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно регистрируется около 48000 смертей от меланомы (Lucas R. и соавт., 2006). Большинство смертей обусловлено метастатическим поражением удаленных органов (Miller A.J., Mihm М.С. Jr., 2006).
При стадировании меланомы критическим является вопрос наличия метастазов в другие органы и ткани. В случае нераспространенного заболевания важным критерием эффективности лечения является хирургическое удаление первичной опухоли до достижения меланомой толщины в 1 мм (Swanson N.A. и соавт., 2002). При метастазировании меланомы в лимфоузлы прогностическим фактором является количество лимфоузлов, пораженных опухолью (Homsi J. и соавт., 2005). Также должна учитываться степень распространения злокачественного процесса в пределах лимфоузла: в случае наличия микрометастазов прогноз лучше, чем при макро метастазах (Markovic S.N. и соавт., 2007). Однако, если меланома распространилась за пределы лимфоузлов в отдаленные органы, заболевание в большинстве случаев считается инкурабельным, и 5-ти летняя выживаемость составляет менее 10% (Vantyghem S.A. и соавт., 2003).
Формирование метастазов меланомы является многокомпонентным процессом, который включает генетические изменения, нарушение взаимодействия эпидермальных меланоцитов с кератиноцитами, эндотелиоцитами, изменения ангиогенеза (Chin L., 2003; Haass N.K. и соавт., 2005). Метастазирование опухолей проходит через серию последовательных и перекрывающихся этапов, каждый из которых является лимитирующим (Chambers A.F. и соавт., 2002). Эти этапы включают: 1) инвазию опухолевых клеток в лимфатические или кровеносные сосуды с переносом их в лимфоузлы и отдаленные органы; 2) экстравазацию клеток в паренхиму органа; 3) пролиферацию клеток с формированием вторичных очагов; 4) формирование новых кровеносных сосудов для поддержания продолженного роста.
Обязательным этапом образования метастатического очага является проникновение клеток первичной опухоли из клеточного эмбола через стенку сосудов в окружающие нормальные ткани с последующим формированием вторичных опухолевых узлов. Одним из ключевых моментов данного процесса является формирование межклеточных контактов опухолевых клеток с эндотелиоцитами (Pollmann М.А. и соавт., 2005).
В создании информационных связей между клетками важнейшая и не всегда однозначная роль принадлежит коннексинам. Коннексины представляют собой семейство, по крайней мере, 12 белков, формирующих каналы щелевых контактов. Полуканалы щелевых контактов, именуемые коннексонами, построены из гомомерных или гетеромерных гексамеров коннексинов и обеспечивают путь для прямого пассажа ионов и низкомолекулярных молекул, включая вторичные посредники, между образующими этот тип связи клетками (Kumar N.M., Gilula N.B., 1996; Simon A.M., 1999). Данный тип межклеточных коммуникаций является обязательным в прямом, основанном на контактах, контроле роста клетки и важным для таких процессов, как дифференцировка клеток, регулирование объема клетки (Quist А.Р. и соавт., 2000), клеточный рост (Moorby С, Patel М., 2001).
В ряде работ показано, что межклеточное взаимодействие посредством щелевых контактов нарушается при канцерогенезе (Jamieson S. с соавт., 1998; Holden P.R. и соавт., 1997). С другой стороны, роль коннексинов в приобретении метастатического потенциала недостаточно изучена, и имеющиеся по этому вопросу данные противоречивы.
Олеамид — вещество, выделенное из спинно-мозговой жидкости кошек, находящихся в состоянии сонной депривации. Этот препарат неспецифически и обратимо блокирует межклеточную коммуникацию, опосредованную щелевыми контактами (Xiaojun G. и соавт., 1997). Известно об антипролиферативном (Bisogno Т. и соавт., 1998; Langstein J. с соавт., 1996) и вазорелаксирующем эффектах олеамида (Hoi P.M., Hiley C.R., 2006).
Таким образом, изучение механизмов возможного влияния на функциональные свойства межклеточных контактов является перспективным в решении проблемы предупреждения метастазирования.
Цель исследования.
Изучение роли межклеточных щелевых контактов в метастазировании меланомы В16 у мышей С57В1.
Задачи исследования.
1. Оценить влияние олеамида как неспецифического ингибитора межклеточной коммуникации, опосредованной межклеточными щелевыми контактами, на метастазирование меланомы В16 у мышей С57В1.
2. Исследовать дозозависимость эффекта олеамида на межклеточную коммуникацию в метастазах меланомы В16 у мышей С57В1.
3. Исследовать влияние режима введения олеамида до и после операции на межклеточную коммуникацию в метастазах меланомы В16 у мышей С57В1.
4. Выявить зависимость изменений пролиферативной активности клеток меланомы В16 в метастазах от функциональной активности межклеточных щелевых контактов.
Научная новизна.
Впервые исследовано влияние неспецифического блокирования межклеточной коммуникации, опосредованной межклеточными щелевыми контактами, на метастазирование in vivo.
Доказано влияние блокирования межклеточных щелевых контактов олеамидом на площадь и число формирующихся метастазов.
Получены новые данные об изменении пролиферативной активности клеток меланомы в метастазах на фоне блокирования межклеточной коммуникации.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные о влиянии функционального состояния межклеточных щелевых контактов на процесс метастазирования меланомы В16 расширяют представления о молекулярных механизмах прогрессирования злокачественных опухолей. Показано, что неспецифическое ингибирование функции межклеточных щелевых контактов приводит к прогрессированию злокачественного процесса и влияет на все стадии развития меланомы В16 in vivo. Результаты исследования могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс на кафедрах патофизиологии и онкологии медицинских вузов при рассмотрении опухолевого процесса.
Новые данные являются перспективными для разработки мер по профилактике, диагностике и лечению метастазов меланомы в клинической практике.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Ингибирование функции межклеточных щелевых контактов оказывает влияние на формирование и рост метастазов меланомы мышей.
2. Эффекты олеамида на развитие метастазов меланомы определяются дозой и режимами введения препарата.
3. Функциональное состояние межклеточной коммуникации в клетках метастазов меланомы определяет уровень пролиферативной активности и общую площадь метастазов.
Реализация работы
По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 в центральном научном журнале.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 101 странице, иллюстрирована 1 таблицей, 3 фотографиями и 8 рисунками. Библиографический указатель включает в себя 310 источников, в том числе 307 на иностранных языках.
Эпидемиология, факторы риска развития меланомы
Несмотря на то, что к настоящему времени достигнут значительный прогресс в диагностике и лечении меланомы кожи, основанный на четких онкологических принципах идентификации, классификации и лечения этих опухолей, остаются весьма актуальными поиски более действенных методов предупреждения образования вторичных опухолевых очагов.
Согласно принятому представлению, меланома развивается из подвергшихся злокачественной трансформации меланоцитов - пигмент-продуцирующих клеток, расположенных в эпидермисе кожи человека (Chih L., 2003). Меланома характеризуется тем, что уже на начальных стадиях развития вследствие высоких инвазивных свойств ее клетки проникают за пределы собственно кожи и способны к метастазированию (Haass N.K. и соавт., 2005).
Меланома известна во врачебной практике очень давно. Первое описание меланомы обнаружено в записях Гиппократа, в которых он описывает «смертельные черные опухоли с метастазами». Палеопатологи описывали рассеянные костные метастазы и круглые меланотические массы в коже перуанских мумий 4 века до н. э. (Urteaga О., Pack G.T., 1966). Однако до 1806 года не существовало детального определения и названия болезни. Рене Лаэннек упоминал «la melanose» в лекциях на медицинском факультете в Париже (Laennec R., 1806). Врач Вильям Норрис в 1820 году описал семью с многочисленными родимыми пятнами и нескольких членов этой семьи с метастатическими поражениями (Norris W., 1820). Молекулярные исследования последних 20 лет подтвердили предположение Норриса о значительном вкладе наследственных факторов в этиологию меланомы (Lynch Н.Т. и соавт., 2004; Debniak Т. и соавт., 2004; Geffrotin С. и соавт., 2004; de Snoo, F.A. и соавт., 2003). В России ежегодно меланомой кожи заболевают свыше 5700 человек и более 2200 человек умирают от нее. В 1998 г. стандартизованный показатель заболеваемости меланомой кожи у мужчин был 2,9%ооо У женщин - 3,2%0оо-За 10 лет (1989-1998) прирост данного показателя у мужчин составил 45%, у женщин - 41%, при среднегодовом темпе прироста 4,2% и 3,5% соответственно. Стандартизованный показатель смертности от меланомы кожи у мужчин стал 1,2%0оо у женщин - 1Д%0оо (Лемехов В.Г., 2001).
Частота возникновения меланомы в США за последние 40 лет увеличилась в 15 раз. Ее рост опережает темпы роста какой-либо другой описанной злокачественной опухоли (Greenlee S.H. и соавт., 2000, 2001). Согласно статистике США за 1973-1997 годы, показатель роста смертности от меланомы у людей 65 лет и старше, особенно мужчин, второй по частоте среди всех злокачественных опухолей (Edwood J.M., Gallagher R.P., 1983).
Как при других злокачественных опухолях, факторами риска развития меланомы являются генетическая предрасположенность и воздействие факторов окружающей среды (Chin L., 2003; Лемехов В.Г., 2001).
Исследования методом «случай-контроль» выявили несколько факторов риска в популяциях с высокой вероятностью развития меланомы (Dubin N. и соавт., 1989; MacKie R.M. и соавт., 1989). Меланома прежде всего поражает светловолосых и светлокожих людей, имеющих в анамнезе случаи солнечного ожога.
Ультрафиолетовый компонент солнечного света вызывает повреждение кожи и увеличивает риск развития меланомы (Lee J.A., 1985; Longstreth J., 1988). Показано, что риск развития меланомы более связан с периодическим интенсивным воздействием солнечного света, нежели с кумуляцией его воздействия (Dubin N. и соавт., 1989). Точный механизм воздействия и длины волн ультрафиолетового излучения, являющиеся критическими, остаются спорными, но доказано влияние как УФ-А (320-400 нм), так и УФ-В (290-320 нм) (Nestle М., Carol Н., 2003; Greenlee R.T. и соавт., 2001; Weinstock М.А., 2001; MacKie R.M. и соавт., 1989; Jhappan С. и соавт., 2003).
У людей со светлой кожей опухоли более часто возникают на участках кожи, подвергающихся воздействию солнечного света периодически (на туловище и конечностях), чем на участках, облучаемых более часто (лицо). Было показано, что люди, работающие в помещениях, имеют более высокий риск заболевания меланомой, чем работающие на открытых пространствах (Vagero D. и соавт., 1986). Небольшая доля меланом развивается без явного воздействия ультрафиолетовых лучей - на ладонях, подошвах стоп и слизистых оболочках. В генах BRAF и N-ras, в которых при меланоме наиболее часто обнаруживают аберрации, не типичны мутации под воздействием ультрафиолетового облучения (Albino А.Р. и соавт., 1989; Davies Н. и соавт., 2002).
В настоящее время продолжается обсуждение возможности подобных различий вследствие существования различных типов меланомы. Основываясь на гистологических формах роста, ранее были описаны четыре «гистогенетических» типа меланомы: поверхностно-распространяющаяся меланома, злокачественная лентиго-меланома, нодулярная меланома и лентигинозная меланома (Clark W.H. Jr. и соавт., 1969; McGovern V.J. и соавт., 1973). Высказано мнение о противоречивости данной классификации и об ограниченности ее применения в клинической практике из-за существования значительного количества неклассифицируемых с ее помощью опухолей. Кроме того, гистогенетический тип опухоли не является независимым прогностическим фактором (Balch СМ., 1992). Существуют предложения о классификации меланомы в зависимости от патогенетических механизмов, поскольку у пациентов с меланомой головы и шеи определяются более высокие уровни экспрессии белка ТР53, более высокая частота возникновения других злокачественных опухолей кожи, меньшее число меланотических невусов (Whiteman D.C. и соавт., 2003; Rivers J.K., 2004).
Были проведены исследования, подтверждающие гипотезу двойного патогенеза для меланомы открытых участков тела. Мутации BRAF являются частыми только в случае меланомы кожи, периодически подвергающейся воздействию солнечного света, и редки при меланоме кожи, подвергающейся хроническому облучению и кожи конечностей и меланомы слизистых оболочек (Maldonado J.L. и соавт., 2003). Показано, что при меланоме кожи ладоней и подошв и слизистых оболочек хромосомные аберрации отличны от таковых при опухолях других локализаций (Bastian B.C. и соавт., 2000; van Dijk М. и соавт., 2003).
Коннексины — белки межклеточных щелевых контактов
Получены убедительные данные о вовлечении МЩК в канцерогенез (Eghbali В.и соавт., 1991; Zhu D. и соавт., 1992; Mesnil М. и соавт., 1995). Показано снижение содержания гомологичных МЩК в гепатоцитах и кератиноцитах, способных к автономной пролиферации (Sakamoto Н. и соавт., 1992; Kamibayashi Y. и соавт., 1995). Таким образом, несмотря на достоверную связь функциональных нарушений межклеточных взаимодействий и злокачественных свойств опухолей, молекулярно-генетические механизмы нарушений щелевых контактов, а также возможность использования данных об их изменениях в диагностике опухолевой прогрессии в целом и метастазирования в частности, остаются недостаточно изученными (Nicolson G.L., 1998; Hamada J. и соавт., 1998; Ren J. и соавт., 1990).
Молекулярные механизмы, регулирующие проникновение опухолевых клеток через эндотелий сосудов (диапедез), остаются мало изученными, но могут основываться на МЩК между клетками опухоли и эндотелия. Для проверки данной гипотезы Pollmann М.А. и соавт. (2005) добились экспрессии Сх43 в клетках опухоли молочной железы с исходно сниженной экспрессией МЩК (HBL100) и исследовали их способность к формированию щелевых контактов, установлению гетероцеллюлярных связей и миграции через монослой эндотелиальных клеток микрососудов человека (HMVEC -human microvascular endothelial cells). Было выявлено, что клетки HBL100, экспрессирующие Сх43, формировали функционально-активные гетероцеллюлярные щелевые контакты в монослое HMVEC в течение 30 минут. Методами иммуногистохимии показано, что Сх43 локализуется в областях контакта клеток опухоли, экспрессирующих Сх43, с клетками эндотелия. При количественном анализе диапедеза выявлено двукратное увеличение диапедеза клеток, экспрессирующих Сх43 по сравнению с клетками контроля, несущими пустой вектор.
Была исследована экспрессия Сх26 в физиологических и патологических условиях в гепатоцитах и клетках плоскоклеточного эпителия (Saitoh М. и соавт., 1997; Matesic D.F. и соавт., 1994). Уровень экспрессии Сх26 уменьшается по мере приобретения гепатоцитами и кератиноцитами способности к автономной пролиферации (Kamibayashi Y. и соавт., 1995; Sakamoto Н. и соавт., 1992). Авторы доложили, что трансфекция Сх26 в клетки плоскоклеточного рака HeLa приводит к подавлению их роста in vitro и in vivo (Mesnil M. и соавт., 1995).
lto А. и соавт. (2000) показали, что Сх26 задействован в регуляции метастатического фенотипа клеток меланомы BL6. Была выявлена разница в уровне экспрессии Сх26 в двух линиях клеток меланомы мышей В16 с разным метастатическим потенциалом — F10 и BL6 (lto А. и соавт., 2000). С использованием методики анализа переноса красителя (dye-coupling transfer assay) было установлено, что Сх26 участвует в образовании не гомологичных, а гетерологичных МЩК между клетками меланомы BL6 и эндотелиальными клетками. Известно, что в эндотелиальных клетках представлены и являются критически важными для развития сосудов Сх37 и Сх40 (Simon A.M., McWhorter A.R., 2002, 2003), поэтому наиболее вероятным представляется формирование гетерологичных щелевых контактов с участием этих коннексинов. Проведенный анализ спонтанного метастазирования показал, что формирование подобных гетерологичных щелевых контактов Сх26 способствует метастазированию клеток F10 и BL6 (По А. с соавт., 2000). Авторами было показано, что эктопическая гиперэкспрессия гена Сх26 в клетках меланомы мышей F10 приводит к формированию этими клетками спонтанных метастазов, подобно этому процессу в клетках BL6. Ингибирование Сх26, вызванное введением его доминантно-негативной формы в клетки BL6, подавляло их способность к спонтанному метастазированию. Было высказано предположение, что при неспецифическом обратимом блокировании функции МЩК олеамидом или его производными на фоне подавления Сх26 будет уменьшаться спонтанное метастазирование клеток BL6.
Ito А. и соавт. (2002) провели иммуногистохимическое исследование экспрессии Сх26 в пигментных новообразованиях с целью определения клинического значения Сх26 в развитии и прогрессировании меланомы. Было установлено, что экспрессия Сх26 снижена в меланоцитах, клетках невуса и клетках меланомы, расположенных в пределах базального слоя эпидермиса. Однако в клетках меланомы в процессе инвазии в дерму экспрессия Сх26 значительно возрастает. Исходя из полученных результатов, авторы сделали вывод: в момент приобретения опухолевыми клетками способности к автономному росту повышенная экспрессия Сх26 обеспечивает инвазию и метастазирование.
В следующей работе Ito А. и соавт. (2004) установили, что ежедневное внутрибрюшинное введение олеамида с целью блокирования функции МЩК в дозе 25 мг/кг слабо подавляло спонтанное метастазирование клеток меланомы BL6. Для получения более эффективного препарата были химически синтезированы и тестированы на способность к подавлению межклеточной коммуникации, опосредованной щелевыми контактами, 19 производных олеамида. Один из них, обозначенный как Ml-18, избирательно ингибировал межклеточную коммуникацию, опосредованную Сх26, но не Сх43. По наблюдениям авторов ежедневное внутрибрюшинное введение MI-18 приводит к уменьшению спонтанного метастазирования клеток меланомы BL6 на 15% по сравнению с животными группы контроля.
Группы животных
Целью нашей работы было изучение in vivo роли межклеточных щелевых контактов в метастазировании меланомы. Наиболее полно требованиям, предъявляемым к экспериментальной модели, отвечала модель, разработанная Poste G. и Fidler I.J. (1980). Полученный в ходе экспериментальной части исследования материал использовали для макро- и микроскопического морфологического анализа метастатического процесса. Для специфичной оценки роли коннексинов в метастазировании меланомы был проведен иммуногистохимический анализ препаратов метастазов.
Исследования проводили на мышах-самцах С57В1 (питомник «Рапполово» РАМН, Санкт-Петербург) 3-4-х недельного возраста. Животные (п=204) получали стандартный комбикорм и питьевую воду без ограничений. Животных содержали в полипропиленовых клетках при температуре 22±2 С. Для устранения влияния естественного освещения на опухолевый процесс (Анисимов В.Н., Жукова О.В., 1994; Bartsch С. с соавт., 2001) в виварии был обеспечен искусственный режим с 12-ти часовой сменой света и темноты. Все животные проходили двухнедельный период адаптации перед началом экспериментов.
В качестве экспериментальной была использована модель метастазирования меланомы В16 у мышей С57В1, разработанная G. Poste и соавт. (1980). В работе использовали культуру клеток меланомы В16, поддерживаемую в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. С целью усиления злокачественного фенотипа и увеличения количества клеток меланомы перед проведением исследований проводили две последовательные трансплатации опухолевых клеток под кожу аксиллярной области мышам линии С57В1.
При достижении опухолью размеров 1,0-1,5 см ее резецировали и диспергировали в растворе натрия хлорида 0,9%. Полученные клетки меланомы в количестве 2 106 вводили подкожно в подошву правой задней лапы мыши экспериментальной группы. Период времени от момента перевивки клеток меланомы до формирования на лапе у животных опухоли размером 8-10 мм составлял 3 недели.
На 21-22 день всем животным, у которых развились опухоли, выполняли ампутацию голени по методике, использованной Ito А. и соавт. (2004). Для наркоза во время операции использовали тиопентал натрия (Ферейн, Россия) в дозе 50 мг/кг подкожно. Ампутированные конечности с опухолями помещали в жидкий азот для последующего морфологического исследования. Через 28 дней после операции всех животных умерщвляли в парах эфира и выполняли аутопсию. Препараты легких помещали между двумя предметными стеклами (расстояние между стеклами - 0,5 мм) и сканировали аппаратом (Epson Perfection 2480, Япония) для получения цифрового изображения (фото 1). Затем препараты замораживали в жидком азоте для последующего гистологического исследования. Общая продолжительность эксперимента от перевивки опухоли до аутопсии составляла 7 недель.
В результате эксперимента было получено 53 препарата первичных опухолей и 24 препарата легких с метастазами меланомы. Данные о животных, погибших ранее 7-ми недельного срока, в настоящей работе не представлены.
Исследование влияния блокирования МЩК на распределение коннексина в клетках меланомы
Было установлено, что применение олеамида, приводит к прогрессированию опухолевого процесса на стадии метастазирования, не оказывая выраженного влияния на первичную опухоль.
В нашем исследовании меньшее количество первичных опухолей, развившихся в группах, получавших 10 мг/кг олеамида, по сравнению с группами, получавшими 1 мг/кг препарата, может свидетельствовать об антипролиферативном действии. Механизм данного эффекта олеамида изучен недостаточно, но нельзя исключить влияния блокирования функции щелевых контактов на деление клеток меланомы. Анализируя полученные данные, можно предположить, что введение олеамида в использованных нами режимах и дозах, не оказывает выраженного влияния на развитие первичной опухоли.
Можно предположить, что незначительная разница в количестве развившихся опухолей на фоне введения различных доз олеамида, определяется меньшей зависимостью опухолевых клеток первичной опухоли от коммуникации на уровне щелевых контактов. Подобная закономерность отмечена в работах Haass N.K. и соавт. (2004, 2006), описавших прекращение экспрессии нескольких типов коннексинов в клетках меланомы. Авторами также было показано, что уровень экспрессии Сх26 уменьшался по мере приобретения гепатоцитами и кератиноцитами способности к автономной пролиферации (Kamibayashi Y. и соавт., 1995). Напротив, трансфекция Сх26 в клетки плоскоклеточного рака HeLa приводила к подавлению клеточного роста in vitro и in vivo (Mesnil M. и соавт., 1995).
На моделях с мышами было показано, что ген супрессор метастазирования рака молочной железы-1 (breast cancer metastasis suppressor 1, BRMS1) подавляет метастазирование, не влияя на рост первичной опухоли (Meehan W.J., Welch D.R., 2003). Данное явление было описано при раке молочной железы, меланоме и раке яичников. Механизм антиметастатического эффекта BRMS1 остается неясным. Rivera J. и соавт. (2007) при изучении этого механизма для определения экспрессии белков использовали анализ 2D-DIGE: на линиях клеток меланомы оценивали повышение экспрессии (Mel-BRMSl) или сайленсинг BRMS1 (sh635). При сравнении протеиновых профилей линий клеток WT, Mel-BRMSl, и sh635 было выявлено, что 79 протеинов экспрессируются различно. При масс-спектрометрическом анализе были выделены 55 полипептидов, соответствующие 43 различным белкам. Интересно, что 75% идентифицированных белков в клеточной линии Mel-BRMSl имели пониженную экспрессию по сравнению с линией клеток WT. Напротив, все идентифицированные белки в линии клеток sh635 имели повышенную по сравнению с линией WT экспрессию. Большинство белков со сниженной экспрессией отвечают за клеточный рост и передачу сигналов. Шесть белков с различной степенью экспрессии были подвергнуты иммуноблоттингу. Была выявлена высокая степень корреляции между данными анализа DIGE и иммуноблоттинга, что подтверждает достоверность полученных данных. Полученные авторами данные подтверждают важную роль BRMS1 как негативного регулятора метастазирования.
Ингибирование функции щелевых контактов становится заметным и значимым при метастазировании, после того как клетки опухоли преодолевают тканевые барьеры, формируя информационные каналы с различными типами клеток хозяина. Мы выявили дозозависимый эффект олеамида на развитие метастазов меланомы. При введении олеамида в дозе 1 мг/кг выявлено увеличение частоты развития вторичных опухолей в легких. На фоне введения 10 мг/кг отмечено снижение числа метастазов по сравнению с контролем. Результаты наших исследований соответствуют данным, полученным Ко А. и соавт. (2004), которые при введении 25 мг/кг олеамида наблюдали снижение количества метастазов меланомы BL6 на 34-37%. Авторы связывали данный эффект с нарушением формирования гетерологичных щелевых контактов между клетками меланомы с эндотелиоцитами. Ингибирование Сх26, вызванное введением его доминантно-негативной формы в клетки мышиной меланомы BL6, подавляло способность этих клеток к спонтанному метастазированию (Ito А. и соавт., 2000).
При сравнении площади метастазов нами была показана зависимость роста вторичных опухолей в легких мышей от дозы препарата. Введение олеамида до операции на стадии роста первичной опухоли и индукции метастазирования, независимо от дозы препарата, приводит к увеличению площади формирующихся метастазов по сравнению с контролем. Мы предполагаем, что блокирование межклеточных щелевых контактов на ранних стадиях развития вторичной опухоли ограничивает влияние соседних клеток на клетки меланомы и стимулирует их деление, несмотря на антипролиферативный эффект олеамида. С другой стороны, неспецифическое подавление функции щелевых контактов олеамидом в дозе 1 мг/кг в послеоперационном периоде приводило к уменьшению размеров метастазов, а доза 10 мг/кг, напротив, стимулировала их рост.
Ранее с использованием методики анализа переноса красителя было установлено, что в процессе метастазирования клеток меланомы Сх26 участвует в образовании гетерологичных межклеточных щелевых контактов с эндотелиальными клетками (Но А. и соавт., 2004). Известно, что в эндотелиальных клетках представлены и являются важными для развития сосудов Сх37 и Сх40 (Simon A.M., McWhorter A.R., 2003), поэтому наиболее вероятным представляется формирование гетерологичных щелевых контактов с участием этих коннексинов. Применение производного олеамида - MI-18 - специфического блокатора Сх26 - за счет нарушения коммуникации с эндотелиоцитами приводило к снижению количества метастазов меланомы BL6 без побочных эффектов, свойственных олеамиду (Ito А. и соавт., 2004). Коннексины, являющиеся структурными единицами межклеточных щелевых контактов, в клетке могут располагаться как в цитоплазматической мембране, так и в цитоплазме (Kumar N.M., Gilula N.B., 1996; Simon A.M., 1999). Нами проведено исследование цитоплазматического распределения Сх26.
В группах животных, получавших олеамид до операции, отмечено увеличение содержания Сх26 в цитоплазме. Данное явление можно связать с включением механизма обратной связи — увеличением синтеза коннексинов в ответ на блокирование работы МЩК.
Известно, что при опухолевом процессе происходит изменение распределения коннексинов в клетке — значительное их количество обнаруживается в цитоплазме (Saito Т. и соавт., 2001; Kanczuga-Koda L. и соавт., 2005). Omori Y. и соавт. (2007) исследовали влияние аберрантной цитоплазматической локализации Сх32 на степень злокачественности клеток гепатомы человека НиН7. Повышение нормальной экспрессии Сх32 приводило к повышению содержания Сх32 в цитоплазме, увеличению мобильности клеток, инвазивных свойств и метастатического потенциала.
