Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные представления о системе гемостаза 13
1.1.1. Сосудисто-тромбоцитарное звено системы гемостаза 13-17
1.1.2. Коагуляционно-фибринолитическое звено системы гемостаза 17 - 20
1.1.3. Маркеры активации системы гемостаза 20 - 22
1.2. Возрастные особенности системы гемостаза 22 - 24
1.3. Состояние системы гемостаза при диабете 24
1.3.1. Сосудистые осложнения при диабете 24 - 29
1.3.2. Сосудисто-тромбоцитарное звено системы гемостаза при сахарном диабете 29
1.3.3. Коагуляционно - фибринолитическое звено системы гемостаза при сахарном диабете 31
1.3.4. Взаимосвязь между гемостазом и липидным обменом при сахарном диабете 33
1.3.5. Возрастные особенности гемостаза, их связь с длительностью заболевания 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Объем исследований 39-41
2.2. Характеристика материала 41
2.2.1. Клинико-лабораторная характеристика больных сахарным диабетом 41
2.2.2. Клинико-лабораторная характеристика контрольных групп 46
2.3. Методы исследования 47-48
2.3.1. Методы исследования коагуляционного звена системы гемостаза 48
2.3.2. Методы исследования сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза 51
2.3.3. Определение маркеров внутрисосудистой активации системы гемостаза 52
2.3.4. Исследование липидного обмена 53 - 54
2.3.5. Исследование углеводного обмена 54 - 55
2.3.6. Определение содержания альбумина в моче 55
2.3.7. Методы статистического анализа данных 55-56
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Характеристика гемостаза практически здоровых лиц 57-59
3.2. Характеристика гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа 60
3.2.1. Возрастные изменения гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа 60
3.2.2. Система гемостаза у мужчин и женщин больных сахарным диабетом 1 типа 65
3.2.3. Характеристика гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа в зависимости от клинически значимых показателей 72
3.3. Характеристика гемостаза больных сахарным диабетом 2 типа 82
3.3.1. Возрастные изменения гемостаза больных сахарным диабетом 2 типа 82
3.3.2. Зависимость показателей гемостаза от клинически значимых показателей у больных сахарным диабетом 2 типа 87
Заключение 94 - 111
Выводы 112
Список литературы 113-138
Приложение 139-156
- Коагуляционно-фибринолитическое звено системы гемостаза
- Взаимосвязь между гемостазом и липидным обменом при сахарном диабете
- Определение маркеров внутрисосудистой активации системы гемостаза
- Характеристика гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа в зависимости от клинически значимых показателей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизмов нарушений гемостаза при сахарном диабете 1 и 2 типов является одним из важных аспектов проблемы профилактики и лечения осложнений, ограничивающих срок жизни больных [Балаболкин М.И., 2001; Сунцов, Ю.И., 2005; ВОЗ, 2005; Дедов И.И., 2007; Nacag-Icindic E., 2007]. По современным представлениям патогенез осложнений сахарного диабета рассматривается с позиций теории глюкозотоксичности, согласно которой хронически повышенный уровень глюкозы крови является ведущим фактором, инициирующим многообразные биохимические и структурные изменения в клетках и тканях [DCCT; UKPDS, 2000; Атаманов В.М., 2003; Khaw K.T. et al., 2004]. Показано, что при сахарном диабете главным патогенетическим механизмом развития микроангиопатий является гликозилирование сосудистой стенки [Falsom A.R., 2000; Терещенко И.В., 2005; Дедов, И.И, 2006].
При сахарном диабете 1 и 2 типов наблюдается активация практически всех звеньев гемостаза, а также состояния клеток крови и плазменных ферментных систем [Carr M.E., 2001; Баркаган З.С., 2006; Балаболкин М.И., 2000; Киричук, В.Ф., 2006; Бондарь И.А., 2007]. По классификации З.С. Баркагана сахарный диабет входит в VIII группу гематогенных тромбофилий, связанных с нарушениями различных компонентов системы гемостаза, вследствие изменения обмена веществ и биохимического состава крови [Баркаган З.С., 1995].
Одним из патогенетических факторов развития диабетической ангиопатии при сахарном диабете являются изменения в системе сосудисто –тромбоцитарного звена гемостаза [Carr M.E., 2000; Дихт Н.И., 2001; Rigla M., 2001; Киричук В.Ф., 2005; ., 2007]. Дисфункция систем коагуляции и фибринолиза на ранних стадиях заболевания приводит к появлению ретинопатии и нефропатии [Asakawa H., 2000; Schmidt A.M., 2000; Дедов И.И., 2006; ., 2007]. При увеличении длительности заболевания нарастает концентрация фибриногена, снижается фибринолитическая активность, что создает условия для повышенной возможности тромбообразования [Aso Y, 2000, Sobel B.E., 2002, Алексеева Р.И., 2002; Carr M.E., 2005; ., 2006].
Физиология гемостаза здоровых детей и взрослых хорошо изучена [Зубаиров Д.М., 2000; Matsuda M., 2000; Levy, G., 2001; McDonagh J., 2001; Neerman-Arbez M.,2001; Баркаган З.С., 2002; Киричук В.Ф. 2002; Бутенас С., 2002]. Установлена пониженная активность антикоагулянтов и системы фибринолиза у детей и подростков; показано повышение тромбообразования и содержания фибриногена с возрастом [В.А. Алмазов, 2001; Федоров А. В., 2004; Суворова А. В., 2004; , 2007; , 2007; ., 2007]. Однако закономерности изменений системы гемостаза у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов в возрастном аспекте изучены не в полном объеме, что затрудняет интерпретацию результатов лабораторных исследований системы гемостаза и мониторинг за лечением [Баркаган З.С., 2002; Sutor A. H., 2003; ., 2007].
Оценка половых различий состояния гемостаза также является существенной проблемой патогенеза сахарного диабета. С возрастом у женщин повышается содержание фибриногена [Баркаган З.С.], чаще чем у мужчин выявляется сердечно-сосудистая патология [Polac I., 2003; Almdal T., 2004; Asikainen, T.M., 2004].
Для развития осложнений сахарного диабета имеют значение показатели компенсации, содержания холестерола и микроальбуминурии. Патогенез микрососудистых осложнений сахарного диабета (нефропатии и ретинопатии), в последнее время, представляется единым и связанным с повреждающим действием на эндотелий сосудов [Дедов, И.И, 2006]. Данные литературы подтверждают наличие гиперкоагуляции у больных на фоне гиперхолестеролемии, декомпенсации углеводного обмена [Лютова Л.В., 2002; P. Gresele, 2003; Совалкин В.И., 2005; Berneis K., 2005].
Изучение возрастных нарушений системы гемостаза у лиц мужского и женского пола в патогенезе сахарного диабета, выявление их зависимости от уровня HbA1с, холестерола в крови и альбумина в моче позволит уточнить механизмы развития микроангиопатий и с новых патогенетических позиций подойти к выработке алгоритмов лабораторного исследования и адекватных мер профилактики и лечения.
Цель исследования: оценить возрастные и половые особенности нарушений системы гемостаза при сахарном диабете 1 и 2 типов с учетом клинически значимых лабораторных показателей.
Задачи исследования
1. Исследовать состояние сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев системы гемостаза практически здоровых лиц в зависимости от возраста и пола.
2. Изучить состояние коагуляционного звена системы гемостаза по показателям активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового и тромбинового времени, содержания фибриногена, растворимых фибринмономерных комплексов, D-димера, плазминогена, антитромбина III у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов в зависимости от возраста и пола.
3. Выявить изменения в сосудисто-тромбоцитарном звене системы гемостаза по показателям агрегации тромбоцитов с индукторами – аденозиндифосфатом, коллагеном, ристомицином, адреналином у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов в зависимости от возраста и пола.
4. Оценить влияние клинически значимых лабораторных показателей на параметры системы гемостаза с учетом длительности заболевания, наличия сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов.
Научная новизна. Впервые показано, что изменения показателей системы гемостаза при сахарном диабете 1 типа наблюдаются во всех возрастных группах от 11 до 50 лет и зависят от половой принадлежности. Получены новые данные о значительном повышении активности антикоагулянтного и фибринолитического звеньев системы гемостаза у лиц женского пола до 26 лет. У мужчин существенные нарушения гемостаза обнаружены после 26 лет - наблюдается сокращение протромбинового времени, повышение содержания фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов. Установлено, что сосудисто-тромбоцитарная дисфункция при сахарном диабете 1 типа сопровождается снижением содержания тромбоцитов и повышением их адгезивно-агрегационной способности, что наиболее выражено у подростков. Новыми являются данные о зависимости состояния системы гемостаза от уровня гликозилированного гемоглобина, холестерола в крови и альбумина в моче. Значительные изменения системы гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа отмечены при содержании гликозилиро-ванного гемоглобина выше 10%. При высоком содержании холестерола в крови и альбумина в моче появляются признаки тромбинемии с повышением уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов и D-димера.
У больных сахарным диабетом 2 типа выявлены изменения в системе гемостаза, заключающиеся в активации процессов свертывания крови, особенно после 50 лет. Гиперкоагуляция у женщин выражена в большей степени, чем у мужчин. Гиперхолестеролемия и микроальбуминурия оказывает большее влияние на гиперкоагуляцию и развитие эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете 2 типа. Влияние гипергликемии на состояние гемостаза является существенным при обоих типах диабета.
Теоретическая и практическая значимость. Представлены возрастные изменения сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев системы гемостаза у здоровых детей, подростков и взрослых г.Томска. Показано, что с возрастом снижается содержание тромбоцитов у здоровых лиц, после 40 лет возрастает фибринолитическая активность крови, усиливаются адгезивно-агрегационные свойства тромбоцитов.
Изменения системы гемостаза у больных сахарным диабетом 1 типа во всех возрастных группах определяют развитие микроангиопатий, что указывает на необходимость динамического наблюдения с определением параметров системы гемостаза. Состояние системы гемостаза при сахарном диабете 1 типа в большей мере определяется выраженностью хронической гипергликемии, чем длительностью патологического процесса и содержанием холестерола. Группами повышенного риска развития эндотелиальной дисфункции среди детей и подростков являются лица женского пола, а после 26 лет – мужского. Профилактика и терапия нарушений в системе гемостаза при сахарном диабете 1 типа должна проводиться путем строгого контроля гликемии и подбора адекватной инсулинотерапии, а при сахарном диабете 2 типа - назначением сахароснижающих и гиполипидемических препаратов.
Положения, выносимые на защиту
1. Активность сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев системы гемостаза здоровых лиц повышается после 40 лет и более выражена у мужчин. У больных сахарным диабетом нарушения гемостаза обнаруживаются во всех возрастных группах лиц мужского и женского пола.
2. Возрастные изменения у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов характеризуются сосудисто-тромбоцитарной дисфункцией и гиперкоагуляцией. При сахарном диабете 1 типа обнаружены более выраженные изменения в системе гемостаза у больных женского пола до 26 лет, у мужчин - старше 26 лет. При сахарном диабете 2 типа состояние гиперкоагуляции у женщин развивается чаще, чем у мужчин.
3. Изменения гемостаза при сахарном диабете 1 типа определяются глюкозотоксичностью, при сахарном диабете 2 типа существенное значение имеет нарушение толерантности к глюкозе. Более значительное влияние гипергликемии на активность системы гемостаза установлено при сахарном диабете 1 типа, гиперхолестеролемия вызывает более значимые изменения параметров системы гемостаза при сахарном диабете 2 типа.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации представлены на второй сибирской конференции эндокринологов (Красноярск, 2003); региональной конференции, посвященной 25-летию факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов (Томск, 2004); III Всероссийском диабетологическом конгрессе (Москва, 2004); научно-практической конференции, посвященной 60-летию педиатрического факультета (Томск, 2005); 1-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», посвященной памяти А.Ф. Родина (Родинские чтения, ЦМСЧ-81, НИИ гастроэнтерологии, г. Северск, 2005); на II-ой межрегиональной научно-практической конференции «Патология сосудов и гемостаз» (Омск, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов, приложения, иллюстрирована 14 рисунками, 36 таблицами. Библиография включает 249 литературных источников.
Коагуляционно-фибринолитическое звено системы гемостаза
Свертывание крови и фибринолиз - многоступенчатый (каскадный) ферментный процесс, в котором участвуют белки-протеазы, субстратные белки, а также физиологические антикоагулянты и ингибиторы фибринолиза. Активация и взаимодействие факторов свертывания крови между собой и с физиологическим антикоагулянтами почти на всех этапах процесса происходят на свободных плазменных фосфолипидных мембранах [Зубаиров Д.М., 2000; Баркаган З.С., 2001; Офозу Ф.А., 2002; Папаян А.П., 2004]. Фактор I (фибриноген) - конечный субстрат процесса свертывания, превращающийся под влиянием тромбина (фактора На) в сгустки фибрина или тромбы [Зубаиров Д.М., 2000; McDonagh J., 2001]. Тромбин может ускорять свое образование, активируя тромбоциты, факторы V и VIII, а также, возможно, факторы VII и XI [Струкова СМ., 2002]. Фибриногену принадлежит главная кофакторная роль в процессах агрегации тромбоцитов, что связано с большой концентрацией его в плазме и высокой афинностью к рецепторам тромбоцитарной мембраны [Neerman-Arbez М., 2001; Bennet J.S., 2002; Луговской Э.В., 2003].
Конечный этап свертывания крови подразделяют на три этапа: ферментативный (отщепление от фибриногена фибринопептидов А и В) с образованием мономеров фибрина; неферментативный с образованием олигомеров фибрина - растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК); этап стабилизации фибрина под влиянием ХШа фактора с образованием нерастворимого в мочевине фибрина [Matsuda М., 2000; Зубаиров Д.М 2000; Neerman-Arbez М., 2001; Hanss M.M.L., 2001; Луговской Э.В., 2003].
В фибринолитической системе основным ферментом является плазмин, образующийся из плазминогена под влиянием tPA и других активаторов (урокиназы, активированных протеинов C+S, фактора XII и т. д.). Под действием плазмина фибрин лизируется до конечных продуктов - димеров D-D или тримеров D-E-D, а фибриноген расщепляется до фрагментов Д и Е. Степень нарастания в плазме крови димера D-D служит маркером как внутрисосудистого свертывания крови (тромбинемии), так и фибринолиза, а фрагментов D- фибриногенолиза [Баркаган З.С., 2001; Момот А.П., 2006].
Активация фибринолиза и коагуляции может происходить по внешнему и внутреннему пути [Ананьева Н., 2002]. Внешний путь активации в системе свертывания крови реализуется с помощью тканевого фактор, Vila, Ха факторов и Са++, а в плазминовой системе внешними активаторами являются tPA и урокиназа [Butenas S., 2002].
По внутреннему механизму обе системы активируются фактором ХІІа (фактором Хагемана) в комплексе с калликреином и высокомолекулярным кининогеном (ВМК), а также активированными антикоагулянтами протеинами C+S [Latacha М.Р., 2002; Папаян А.П., 2003; Баркаган З.С., 2004].
Некоторыми авторами участие фактора Хагемана в процессе гемостаза подвергается сомнению [Зубаиров Д.М., 2000., Макацария А. Д., Бицадзе В. О., 2001., Кузник Б.И., 2005]. Фактор XI способен активироваться, как минимум, тремя путями: активированным фактором Хагемана, фактором 1Ха и тромбином [Baglia F.A., 2000; Струкова СМ., 2002]. Даже в отсутствии кофакторов тромбин активирует фактор XI со скоростью, на порядок превышающей скорость стимуляции этого профермента под действием фактора ХІІа. В присутствии отрицательно заряженных поверхностей (а такими свойствами обладают активированные тромбоциты, микровезикулы кровяных пластинок и различных клеток, травмированные ткани) скорость активации фактора XI возрастает в 1000 раз, что обусловлено наличием аутоактивации фактором ХІа [Офозу Ф.А., 2002].
Свертыванию крови и фибринолизу противостоят их ингибиторы. Важнейшими компонентами ингибиторной системы являются ингибиторы ТПА (PAI-1, PAI-2), антиплазмины (альфа 2-антиплазмин) и ингибиторы трансформации плазминогена в плазмин (а2-макроглобулин, антитрипсин, CI-эстеразный ингибитор). AT III блокирует не только тромбин (фактор Па), но и почти все другие ферментные факторы свертывания, а отчасти и плазминоген. Второй группой физиологических антикоагулянтов является протеин С и его кофактор протеин S. Протеины Са + Sa инактивируют неферментные факторы свертывания Va и Villa. При дефиците протеина С и S, а также при аномалиях фактора Va, развивается тромбофилический статус [Берковский А.Л., 2001].
Торможение процесса свертывания крови и фибринолиза на ранних этапах более эффективно, поскольку функционируют силы обратной связи, усиливающие активацию предшествующих стадий.
Методы лабораторной диагностики для выявления внутрисосудистой активации системы гемостаза позволяют документировать склонность к тромбозам по увеличению содержания в крови маркеров сосудисто-тромбоцитарного и/или коагуляционного (тромбинемии) звеньев системы гемостаза.
Снижение тромборезистентности сосудов, сопровождающееся сосудистой тромбофилией, - одно из проявлений дисфункции эндотелия. Нарушение состояния эндотелия сосудов в клинических условиях можно диагностировать по изменению содержания в крови маркуров функциональной активности эндотелия. К наиболее значимым биохимическим маркерам, синтезируемым эндотелием или экспрессируемым на его поверхности, относятся vWf, эндотелии-1, молекулы адгезии (Е-селектин, Р-селектин, VCAM-I, ICAM-I и др.), tPA и PAI-1, тромбомодулин, фибронектин [Yang Z., 2002; Петрищев Н.Н., 2003; Ройтман А.П., 2004]. Косвенным методом оценки состояния эндотелия является исследование содержания в крови факторов, уровень которых коррелирует с эндотелиальной дисфункцией (ЛПНП, ЛПОНП, гомоцистеин, липопротеин (а), интерлейкин-1, фактор некроза опухоли, СРБ и др.) [Киричук В.Ф., 2000; Коломоец Н.М., 2001; Ben Hamda К., 2002; Berneis К, 2005; Баркаган З.С., 2006].
Взаимосвязь между гемостазом и липидным обменом при сахарном диабете
Данные литературы позволяют сделать заключение, что между состоянием гемостаза и липидным обменом существует определенная взаимосвязь [Frohlich, J., 2000; Савченко Р.П., 2000]. Нарушения в перечисленных системах способствуют развитию ангиопатий [Балаболкин М.И., 2000; De Cristofaro R., 2003]. Конечным продуктом перекисного окисления липидов является малоновый альдегид, который ингибирует простациклин, способствуя агрегации тромбоцитов и тромбообразованию, что и отмечается при СД особенно на фоне развития диабетической нефропатии [Sobel В., 2002]. При интенсификации липопероксидации ускоряется взаимодействие тромбин-фибриноген - процесс, осуществляющийся в физиологических условиях с малой скоростью, что провоцирует активацию гемостаза [Бышевский А.Ш., 2004]. A. Sagcan с соавт. обнаружили у больных СД положительную корреляцию между уровнем фактора VII, протеинов С и S, количеством холестерола и триглицеридов плазмы [Sagcan А., 2002]. Значимым атерогенным фактором являются ЛПОНП, синтезирующиеся главным образом в печени и в меньшем количестве - в стенке тонкой кишки. Они являются основной транспортной формой эндогенных ТТ. При гидролизе ТГ они трансформируются вначале в ЛППП (липопротеиды промежуточной плотности) и ЛПНП (липпопротеды низкой плотности), наиболее богатые холестеролом, являющимися наиболее атерогенными из всех классов ЛП [American Diabetes Association, 2000; Дедов И.И., 2000]. Значительным и независимым фактором риска развития атеросклероза и ИБС является липопротеид (а), или «малые плотные» ЛПНП. Будучи антагонистами плазминогена Лп(а) обладают повышенной способностью к тромбообразованию и окислению по сравнению с ЛПНП, обладают иммуногенными и антигенными свойствами и поэтому захватываются макрофагами, способствуя последующей их трансформации в «пенистые клетки» [Ben Hamda R., 2002]. Последние, как известно, являются основой образования атероматозной бляшки.
Известно, что при впервые выявленном и декомпенсированном СД 2 типа, как правило, повышена концентрация холестерола, триглицеридов, ЛПНП, ЛПОНП и снижен уровень ЛПВП, причем последний показатель имеет отрицательную корреляцию с массой тела и уровнем триглицеридов [Tuomilehto J., 2000]. В последние годы установлено, что антиатерогенный эффект ЛВП зависит не только от его участия в гомеостазе холестерола. ЛПВП оказывают протективное влияние на ЛПНП, защищая их от окисления и осуществляя, таким образом, антиоксидантное действие, а также снижают реакцию воспаления в эндотелиальных клетках, угнетают коагуляцию и способствуют осуществлению дилятирующего влияния NO на сосудистую стенку [Schulze. М.В., 2004].
Увеличение содержания в крови количества ЛПОНП и ЛПНП на фоне снижения уровня ЛПВП у больных СД приводит к повышению активности системы гемостаза [Berneis К., 2005]. В исследовании Aso Y. уровень PAI-1 достоверно коррелировал с ИМТ, содержанием триглицеридов, степенью инсулинорезистентности [Aso Y, 2005]. Показано, что инсулин повышает как синтез PAI-1 , так и его секрецию в печени. Известно, что источником PAI-1 являются адипоциты висцеральной жировой ткани. Поэтому количество PAI-1 повышается у больных с ожирением при СД 2 и остается в пределах нормы у худых больных СД 2 [Aso Y., 2005]. Отмеченную закономерность подтверждают исследования, выявившие наиболее выраженное угнетение фибринолиза у тучных больных СД по сравнению с больными СД без ожирения [Yudkin J.S., 2007]. При повышении уровня холестерола отмечается нарастание концентрации фибриногена [Лютова Л.В., 2002]. Данные литературы свидетельствуют о существовании положительной связи между фибриногеном и индексом массы тела [Баркаган З.С., 2002].
Исследования состояния гемостаза у женщин в постменопаузе подтверждают точку зрения, что на поверхности липопротеинов, богатых триглицеридами, могут активироваться и взаимодействовать между собой плазменные факторы свертывания и естественные антикоагулянты [Балаболкин М.И., 2005]. На фоне повышения содержания ТГ выше 1,05 ммоль/л риск развития венозного тромбоза увеличивается вдвое, а повышение уровня ЛПВП снижает риск развития тромбоэмболических осложнений.
Гипергликемия при СД может усугублять дислипидемию. Повышение концентрации глюкозы в крови способствует гликозилированию аполипопротеинов [Бышевский А.Ш., 2004]. Гликозилирование ЛПНП ведет к нарушению их взаимодействия с апоВ-рецепторами клетки, замедлению их катаболизма и развитию гиперлипидемии и гиперхолестеролемии. Гликозилирование же ЛПВП ведет к ускорению их катаболизма и развитию гипо-а-липопротеидемии [Cuchel М., 2002].
Вышеизложенное свидетельствует, что у больных СД имеется четко выраженная взаимосвязь между показателями углеводного и липидного обмена, гликозилирования белков, ПОЛ, активностью антиоксидантной системы, системой гемостаза. Дислипидемия прямо и опосредованно, (окисленные ЛНП, гликированные ЛНП и др.) участвует в патогенезе ангиопатий при СД [Бондарь И.А., 2000]. Поэтому в терапии СД, особенно 2 типа, остаются актуальными вопросы компенсации не только углеводного, но и липидного обмена.
Определение маркеров внутрисосудистой активации системы гемостаза
Определяли время свертывания разведенной цитратной плазмы избытком высокоактивного тромбина. Время свертывания зависело от концентрации фибриногена в плазме. Исследование проводилось с помощью набора «Фибриноген - тест» фирмы «Технология - Стандарт» (Барнаул) [Баркаган З.С., Момот А.П. 2001]. Перед началом определения плазма больного разводится в 10 раз (1 +9), для чего 0,2 мл плазмы смешивали с 1,8 мл буферного раствора. В кювету коагулометра вносили 0,2 мл разведенной плазмы и инкубировали ее при 37С в течение 1 мин, добавляли 0,1 мл раствора тромбина и определяли время свертывания. Концентрацию фибриногена рассчитывали по калибровочному графику, построенному с помощью калибровочной плазмы концентрацией 2,8 г/л. Аналогично определяли концентрацию фибриногена в контрольной нормальной плазме.
В норме концентрация фибриногена в плазме составляет 2,0 - 4,0 г/л. Определение содержания антитромбина III Исследование выполнялось на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi -911» (Берингер Мангейм, Германия) с помощью набора «Antitrombin III» (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) с использованием хромогенного субстрата [Lourenco D.M, 1995]. Плазменный антитромбин в присутствии гепарина быстро ингибирует альфа-тромбин. После внесения тромбин-гепаринового реагента в исследуемую плазму происходит быстрая инактивация тромбина. Скорость гидролиза нитроанилиновой связи хромогенного субстрата зависит от остаточной активности тромбина после инкубации с исследуемой плазмой. Регистрировали изменение оптической плотности при длине волны 405 нм. В нормальной плазме содержание AT III составляет 80 - 120% [Макаров В. А., 2002].
Определение количества тромбоцитов в крови Количество тромбоцитов определяли на агрегометре «Солар» (модель АР 2110, Беларусь). Референтные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют 170-350 х 10% [Шитикова А.С.,2000].
Путем разбавления обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) бедной тромбоцитами плазмой готовили пробы, содержащие необходимое для работы количество тромбоцитов. Это количество в исследуемой плазме составляло от 200х 109/л до 250 х 109/л, что соответствовало показанию прибора от 52,5% до 43,5%.
Исследование индуцированной агрегации тромбоцитов Индуцированную агрегацию тромбоцитов изучали на агрегометре «Солар», (модель АР 2110, Беларусь) турбидиметрический методом, предложенным Борном и О Брайеном [Born G.V.R. 1962., O Brien J.R. 1962]. Метод основан на регистрации изменений светопропускания обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Мерой агрегационного процесса является графически регистрируемое падение оптической плотности плазмы крови в результате потребления тромбоцитов в агрегатах, образующихся под воздействием индукторов агрегации. В качестве индукторов агрегации использовали АДФ в концентрации 10 мкг/мл, адреналин в концентрации 10 мкг/мл, ристомицин в концентрации 10 мг/мл, коллаген в концентрации 20 мг/мл [Шитикова А. С, 2003]. Подбор доз агрегирующих агентов был сделан по рекомендации Британской рабочей группы по гемостазу и тромбозам (1988).
При исследовании функций тромбоцитов индуктор агрегации добавляли к ОТП. В дальнейшем записывали первую фазу агрегации (первичная обратимая агрегация) и вторую необратимую агрегацию в виде двухволновой кривой. Для агониста-коллагена характерно после добавления к ОТП наличие фазы запаздывания (латентная фаза). В этот период на агрегатограмме пишется слегка отклоняющаяся от оси времени линия, и происходит скрытая активация тромбоцитов.
В нормальной плазме здоровых лиц была определена степень агрегации тромбоцитов: для АДФ - 75-95%, для коллагена - 75-95%, для ристомицина -60-130%, для адреналина - 85-105%.
Определение растворимого фибрина Растворимый фибрин является промежуточным продуктом трансформации фибриногена в фибрин. Использовали набор «РФМК-тест» фирмы «Технология - Стандарт» (Барнаул). Фенантролиновый тест основан на оценке времени появления в исследуемой бедной тромбоцитами цитратной плазме, содержащей растворимые фибринмономерные комплексы, хлопьев фибрина после добавления к ней орто-фенантролина [Момот А.П., Елыкомов В.А., Баркаган З.С., 1996]. При комнатной температуре к 0,1 мл исследуемой плазмы добавляли 0,1 мл раствора орто-фенантролина, регистрировали время от момента добавления реагента до начала появления первых хлопьев фибрина. Учет проводили на протяжении 150 секунд и по таблице, построенной на основе калибровочного графика, определяли количество РФМК в исследуемой плазме.
В норме уровень РФМК в плазме составляет 3,38 ± 0,02 мкг/100 мл, с пределами нормальных колебаний от 2,72 до 4,03 мкг/100 мл. Определение содержания Р-димера D-димер - маркер внутрисосудистой активации системы гемостаза, который образуется при расщеплении поперечно-сшитых фактором ХІПа волокон фибрина. Определение D-димера производили на биохимическом анализаторе «Хитачи 911» (Берингер Мангейм, Германия) с помощью набора «D-димер» (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) методом микролатексной агглютинации или иммунотурбидиметрическим методом [Chang-Liem G.S. et al., 1991]. При добавлении плазмы пациента, содержащей D-димер, к реагенту происходит увеличение оптической плотности последнего пропорционально концентрации D-димера в исследуемом образце. У здоровых людей концентрация D-димера не превышает 500 нг FFU (фибриноген эквивалентных единиц) /мл [Passing Н., 1983].
Характеристика гемостаза больных сахарным диабетом 1 типа в зависимости от клинически значимых показателей
Значительные изменения параметров гемостаза наблюдались в группах детей, подростков и взрослых пациентов при СД 1 типа. В таблице 4 приложения 1 приведены показатели гемостаза в группах 11-14 и 15-18- летних больных. Исследование показало, что у больных детей в возрасте от 11 до 14 лет и подростков 15-18 лет ТВ было достоверно короче такового в норме (р 0,001). В отличие от здоровых детей у подростков при СД 1 типа наблюдалось достоверное сокращение ПВ по сравнению с контролем и повышение уровня РФМК. Количество AT III в обеих группах достоверно превышало значения здоровых обследованных соответствующего возраста (р=0,004, р=0,047). Уровень D-димера у детей и подростков при диабете был также достоверно выше его содержания в контроле (р 0,001). Можно предположить, что выявленное повышение содержания AT III и уровня D-димера у больных детей и подростков является реакцией организма на снижение ТВ и увеличение содержания фибриногена, обусловленное повышением активности системы гемостаза.
Исследование сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза показало, что количество тромбоцитов у больных детей и подростков снижалось, но не выходило за пределы референтных значений. Видимо, хроническая гипергликемия у больных вызывает гликозилирование белковых компонентов клеточных мембран и приводит к снижению продолжительности жизни тромбоцитов [Дихт Н.И., 2001.; Киричук В.Ф., 2005]. Однако адгезивно-агрегационные свойства в тестах с адреналином и ристомицином у детей превышали норму (р=0,004 и р=0,003 соответственно). Усиление адгезии и агрегации тромбоцитов в тестах с АДФ (р=0,035), ристомицином (р=0,031) и коллагеном (р=0,041) по сравнению со здоровыми лицами соответствующего возраста было отмечено и у больных подростков. Повреждение сосудистой стенки, характерное для диабета, вероятно, приводит к высвобождению АДФ и обнажению коллагеновых волокон, что является одним из проявлений дисфункции эндотелия.
Таким образом, изменения в системе гемостаза в большей степени выражены у подростков, чем у детей больных СД 1 типа. Так, если у детей достоверно отличаются от контрольных величин 7 показателей, то у больных подростков их число составило 10. Обращает внимание на себя тот факт, что количество подростков, у которых зафиксирована микроальбуминурия, выше, чем детей в группе 11-14 лет (см. рис. 1.)
Результаты изучения показателей гемостаза взрослых больных СД 1 типа представлены в таблице 5. В этих группах обнаружены нарушения в коагуляционном звене гемостаза. При СД 1 типа у взрослых, объединенных в общую группу от 19 до 50 лет, сокращалось ПВ и ТВ (р 0,001) и повышалось количество фибриногена (р=0,029). Уровень РФМК у взрослых при СД 1 типа достоверно отличался от величины данного показателя здоровых пациентов (р 0,001). Содержание D-димера повысилось в 7 раз по сравнению с контролем. Изменения сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза состояли в увеличении показателей агрегации тромбоцитов с АДФ и коллагеном.
При сравнении показателей гемостаза по критерию Р выявлены более значительные изменения ПВ, РФМК и AT III у взрослых, чем у подростков. Так, если у больных подростков адгезивно-агрегационная способность в тестах с АДФ и коллагеном отличается от контрольных величин с достоверностью р = 0,035 и р = 0,041 соответственно, то в группе взрослых эти же показатели повышаются относительно нормы с достоверностью р 0,001. Уровни AT III и D-димера в общей группе взрослых при СД 1 типа были достоверно повышены по сравнению с показателями контрольной группы. Изменения параметров сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза наблюдались во всех возрастных группах, начиная с 11 лет (табл. 6).
Таким образом, в результате проведенного исследования выявлены признаки гиперкоагуляции у детей, подростков и взрослых больных СД 1 типа (рис. 3). При этом наиболее существенные изменения отмечались у взрослых. Нарушения в системе гемостаза у подростков обусловлены развитием эндотелиальной дисфункции, повышением адгезивных свойств тромбоцитов в тесте с коллагеном. У взрослых больных СД 1 типа наблюдается усиление активности прокоагулянтов на фоне угнетения активности антикоагулянтов. Возможно это связано с изменениями сосудистой стенки и повышенной адгезией тромбоцитов в тесте с коллагеном, а также нарушением синтеза AT III в печени на фоне возрастных и метаболических изменений.
В дальнейшем было проведено изучение возрастных особенностей гемостаза пациентов при СД 1 типа в возрастных группах от 11 до 50 лет (табл. П. 1.5,6). Нарушения параметров коагуляционного звена гемостаза при СД 1 типа наиболее выражены между детьми (1 группа) и взрослыми старше 26 лет (группы 4, 5; р1_4=:0,009, pi_5=0,045). При этом значительное сокращение ПВ у больных СД посравнению с группами здоровых лиц отмечалось уже с подросткового возраста (р=0,013).
