Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
Особенности системы гемостаза у детей. Онтогенез системы гемостаза - 10
Роль системы гемостаза в патогенезе осложнений инсулинзави симого сахарного диабета (ИЗСД). - 14
Состояние сосудистого звена гемостаза в норме и при ИЗСД 16
Коагуляционный гемостаз в норме и при ИЗСД 26
Клеточное звено гемостаза, компоненты и механизмы в норме и 33
при ИЗСД
Заключение 47
Материалы и методы 48
Характеристика обследованных групп больных . 48
Диагностика нарушений сосудистого звена гемостаза. 51
Количественное определение фактора Виллебранда.
Метод определения циркулирующих эндотелиоцитов. 52
Исследование показателей внутрисосудистой активации тромбо цитов.
Методы исследования агрегационной и адгезионной способности тромбоцитов.
Исследование агрегационной активности тромбоцитов.
Определение адгезивной способности тромбоцитов. 55
Метод определения циркулирующих иммунных комплексов. 56
Метод определения общей гемолитической активности системы комплемента.
CLASS Оценка состояния коагуляционного звена гемостаз CLASS а. 57
Активированное парциальное тромбопластиновое время, тест, характеризующий «внутренний» путь свертывания . 57
2. Протромбиновое время, тест характеризующий «внешний» путь свертывания крови. 59
3 Тромбиновое время, тест, характеризующий общий (конечный) путь свертывания крови.
Методы статистической обработки результатов. 59
Результаты собственных исследований.
Состояние эндотелия сосудов у детей с ИЗСД 60
Влияние ЦИК на состояние сосудистой стенки и активность тромбоцитов.
Состояние коагуологических свойств крови детей с ИЗСД 81
Состояние тромбоцитов у детей с ИЗСД 89
Спонтанная и индуцированная агрегационная и адгезионная способность тромбоцитов у детей с ИЗСД
Особенности внутрисосудистой активации тромбоцитов у детей 97
с ИЗСД
Заключение 11 1
Выводы 115
Список сокращений 117
Список цитированной литературы
- Особенности системы гемостаза у детей. Онтогенез системы гемостаза
- Роль системы гемостаза в патогенезе осложнений инсулинзави симого сахарного диабета (ИЗСД). -
- Характеристика обследованных групп больных
- Активированное парциальное тромбопластиновое время, тест, характеризующий «внутренний» путь свертывания
Введение к работе
Актуальность темы. Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) - Сахарный диабет 1 типа, является одной из актуальных медико-социальных проблем здравоохранения.
Этим заболеванием страдают около 20 млн. человек, причем более 5% от общего числа больных инсулинзависимым сахарным диабетом составляют дети и подростки [36, 37, 220]. В последние годы отмечается рост заболеваемости сахарным диабетом во всех странах мира. В России ежегодно регистрируется от 4 до 10 новых случаев ИЗСД на 100 000 детского населения, рост заболеваемости неуклонно увеличивается в среднем на 5% в год [13,30,36,167].
Особая значимость проблемы ИЗСД определяется не только тем, ччо он приводит к ранней инвалидизации молодых пациентов и снижению общей продолжительности жизни из-за развития тяжелых сосудистых осложнений, но и высокой смертностью, по которой инсулинзависимый сахарный диабет занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [11,15,36,38,42,74,82].
Как показывают исследования [16,65,167,175,215], более чем 80% больных детей и подростков с ИЗСД имеют специфические сосудистые осложнения глаз, почек и нервной системы - диабетические ангиопатии (ДА). Диабетические ангиопатии имеют генерализованный характер и играют значительную роль в генезе заболевания, его осложнений и исхода [15,42,149,164]. Диабетическую ангиопатию принято делить на диабетическую микроангиопатию и диабетическую макроангиопатию, при последней чаще поражаются сосуды сердца и нижних конечностей. Полагают, что ведущую роль в развитии ДА играют гормонально-метаболические нарушения, характерные для сахарного диабета [13,15,42].
5 К сожалению, даже на фоне стойкой компенсации инсулинзависимого сахарного диабета удается лишь снизить, а не полностью исключить возникновение сосудистых осложнений [11,13,15,40,224].
Важную роль в развитии диабетических микроангиопатий играет состояние иммунной системы, с которой тесно связана система гемостаза, и, в частности, ее сосудисто-тромбоцитарное звено, осуществляющее так называемый первичный гемостаз, ответственный за повреждение именно сосудов микроциркуляторного русла [15,64,80]. Имеются данные, позволяющие говорить о существовании факторов и групп риска, ассоциированных с развитием микроангиопатий [188,236], а также о связи частоты развития диабетической микроангиопатий с высокой агрегационной и адгезионной способностью тромбоцитов, определяемой на стадии клинических и морфологических проявлений [11,42].
Остается дискутабельным вопрос о первичности или вторичности патогенеза микроангиопатий по отношению к сахарному диабету, то есть, является ли микроангиопатия осложнением сахарного диабета, или же проявлением данного заболевания. Детальное изучение особенностей системы гемостаза у детей, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом позволило бы уточнить ранее неизвестные стороны патогенеза микроангиопатий, с новых патогенетических позиций подойти к ранней диагностике и коррекции сосудистых и тромбоцитарных дисфункций, вопросу прогнозирования развития осложнений со стороны почек, глаз, нервной системы и т.д. при сахарном диабете и наметить новые пути их профилактики.
Все вышеизложенное определило необходимость выполнения настоя
щей работы. ... -
Цель работы - выявить роль нарушении в системе гемостаза у детей, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом различной длительности и степени тяжести, в патогенезе диабетических микроангиопатий.
Задачи исследования:
Исследовать структурно-функциональные нарушения в системе гемостаза у детей с инсулинзависимым сахарным диабетом.
Выявить взаимосвязь нарушений системы гемостаза с изменениями показателей неспецифического иммунитета у детей больных инсулинзависимым сахарным диабетом.
Оценить функциональную активность нейтрофилов, содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и активность системы комплемента в крови детей с инсулинзависимым сахарным диабетом.
Выявить и обосновать лабораторные критерии, позволяющие прогнозировать развитие микроангиопатий у больных инсулинзависимым сахарным диабетом.
Научная новизна: Выявлено, что у детей с инсулинзависимым сахарным диабетом при стабильной компенсации гликемии имеются гемостазиологи-ческие расстройства, что проявляется повышением внутрисосудистой активности тромбоцитов, а при наличии диабетических микроангиопатий - рассеянным внутрисосудистым свертыванием.
Проведен расширенный корреляционный анализ связи между нарушениями в системе гемостаза и изменениями параметров иммунной системы у больных с инсулинзависимым сахарным диабетом, что позволило определить степень участия иммунитета в процессах внутрисосудистой активации тромбоцитов, направленных на пред- и постагрегационную активацию тромбоцитов, а также взаимодействие последних с компонентами коагуляционной системы и структурами сосудистой стенки в качестве вторичных мессенджеров.
7 Показано, что при наличии диабетических микроангиопатий тромбоци-тарная дисфункция выражена в наибольшей степени.
Практическая значимость. Полученные данные расширяют существующие представления о роли нарушений системы гемостаза и иммунитета в патогенезе сосудистых осложнений инсулинзависимого сахарного диабета у детей и дополняют имеющиеся сведения о влиянии ЦИК на процессы внутрисосу-дистой активации тромбоцитов и факторов свертывания крови.
Обнаруженные достоверные корреляционные связи между изменениями в системе гемостаза и иммунитета позволяют говорить о существенной роли нарушений в системе гемостаза в патогенезе диабетических микроангиопатий (ДМИАП).
Обоснована необходимость контроля и коррекции параметров внутрисо-судистой активации тромбоцитов у детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом с целью ранней профилактики развития диабетических микроангиопатий.
Личное участие автора. Все исследования, анализ результатов, статистическая обработка научных данных и оформление диссертации проведены автором лично. Определение маркеров тромбинемии и фибринолиза в крови обследуемых было проведено автором совместно с сотрудниками биохимической лаборатории СПбГУ им. Академика И.И. Павлова.
Апробация результатов исследования. .. Результаты работы и ее основные положения доложены и обсуждены на научной конференции «Педиатрия из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005), а также на научно-практической конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006, 2007).
8 Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования используются в учебной и научной работе кафедры патофизиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики СПбГПМА. Основные положения диссертации включены в лекционный курс по темам «Патофизиология системы гемостаза», «патофизиология углеводного обмена», «система комплемента: норма и патология».
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них две статьи в журналах рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и иллюстрирована 11 таблицами и 24 рисунками. Работа состоит из введения, обзора современной литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав с изложением собственных результатов исследования, заключения, выводов, и указателя используемой литературы, включающего 273 литературных источника, из них 128 - отечественных и 144 иностранных авторов.
Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Работа выполнена на кафедре патофизиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики СПбГПМА.
Автор выражает искреннюю благодарность своим учителям и научному руководителю за предложенную тему и определение основных направлений исследования, а также за неоценимую помощь в ходе работы над диссертацией.
9 Автор благодарит за помощь зав. гемостазиологической лаборатории НИИ гематологии г.Санкт-Петербурга д.м.н. проф. А.С. Шитикову и сотрудников лаборатории, врача отделения эндокринологии д.м.н. Л.В. Тыртову и персонал 1-го отделения хирургии СПбГПМА.
Основные положения, выносимые на защиту
У детей с инсулинзависимым сахарным диабетом вне зависимости от достижения стойкой компенсации углеводного обмена имеются серьезные нарушения в системе гемостаза.
Нарушения в системе гемостаза у детей с инсулинзависимым сахарным диабетом, включают изменения сосудистого, клеточного и коагуляционного звеньев системы гемостаза.
Течение заболевания сопровождается прогрессирующими нарушениями сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, которые развиваются раньше, чем нарушения в плазменно-коагуляционном компоненте гемостаза.
Усиленная внутрисосудистая активация тромбоцитов, как и повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов, является важным патогенетическим фактором повреждения эндотелия и значимым звеном патогенеза микроангиопатий при ИЗСД у детей.
Нарушения сосудисто-тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного компонентов системы гемостаза у детей с инсулинзависимым сахарным диабетом являются важными критериями, позволяющими прогнозировать развитие микроангиопатий.
Особенности системы гемостаза у детей. Онтогенез системы гемостаза
Остановка кровотечения или обеспечение условий поддержания непрерывности кровотока - это способность, относящаяся к защитным механизмам. Биологическая значимость данного механизма очевидна как в филогенетическом, так и в онтогенетическом развитии [18,142]. Система гемостаза закладьгеается и начинает формироваться наряду с другими системами в период эмбриогенеза и раннего онтогенеза.
Под системой гемостаза понимают совокупность компонентов кровеносных сосудов, крови и их взаимодействий, которая обеспечивает поддержание целостности кровеносных сосудов, жидкое состояние крови внутри сосудов и остановку кровотечения при повреждении сосуда [18,89,112,165]. Относительное постоянство или динамическое равновесие этих факторов поддерживается функциональным состоянием органов, их продуцирующих и утилизирующих, которое в свою очередь, определяется нейрогуморальным механизмом регуляции [113,142,178].
Процесс гемостаза обеспечивается тремя основными звеньями: -сосудистое -коагуляционное -клеточное.
Система гемостаза в течение жизни претерпевает определенные возрастные изменения. Большинство показателей гемостаза у детей в возрасте от 1 года до 14 лет существенно не отличаются между собой, а также от значений соответствующих показателей у взрослых. У детей до 1 года отдельные величины (время свертывания крови, содержание тромбоцитов и индекс тромбоцитарной активации, ряд других параметров гемостаза) могут незна чительно отличаться от таковых у детей старшего возраста, что отражает функциональные особенности периода новорожденности [33,50,77,100,119,163].
Сосудистое звено гемостаза морфологически заканчивает свое развитие к рождению ребенка. В первые дни после рождения ребенка система ге-маостазиологической защиты обусловлена адаптационными процессами новорожденного ребенка [111,163]. У детей первых дней жизни наблюдается повышенная ломкость и проницаемость капилляров, а также снижение сократительной функции прекапиляров [67,195,199]. Вероятно, за счет этих механизмов обеспечивается высокий обмен веществ у новорожденных детей. Уже к концу периода новорожденности, механическая резистентность сосудов достигает показателей, свойственных детям старшего возраста и взрослым.
Плазменно-коагулящюнное звено гемостаза, в состав которого входят различные факторы свертывания, отличается следующими особенностями: - скорость свертывания крови в течение первых дней жизни постепенно ускоряется и на 7-е сутки становится примерно равной скорости свертывания взрослого человека [119]. - время рекальцификации у детей от 4 до 7 лет равно 60-130 секундам [195]. - концентрация фибриногена увеличивается в течение первых дней жизни и достигает уровня содержания у взрослых к 14-му дню. - при рождении доношенного здорового ребенка имеет место низкий уровень контактного фактора ХП (Хагемана) до 0,33 - 0,73 ЕД /мл . Достижение уровня старшего возраста наступает в течение первых 6-12 месяцев жизни. - уровень фактора Флетчера (прекалликреина) и Фицжеральда Фложе (высоко молекулярного кининогена - ВМКГ) также снижен (до 0,53 - 0,21 ЕД /мл и 0,3 - 0,78 ЕД /мл, соответственно) по сравнению с их содержанием у детей первого года жизни ( 0,62 - 1,2 ЕД /мл. и взрослых 0,5 - 1,36 ЕД /мл.). Комплекс фактор XII - прекалликреин - ВМКГ является пусковым для всех плазменных протеолитических систем [169]. Наиболее интенсивно уровень факторов контактной фазы свертывания повышается в течение 6 месяцев, достигая значения в среднем для каждого из факторов 0,7 ЕД/мл, а в возрасте 1 года содержание перечисленных факторов не отличается от такового у взрослых [58,1 И]. - у большинства детей тромбопластин достигает нормальных значений взрослого на 3-ей неделе. - содержание проакцелерина, антигемофильного глобулина А и фиб-ринстабилизирующего фактора к моменту рождения такое же, как у взрослого - активность витамин-К-зависимых факторов у доношенных новорожденных в первые часы и дни жизни низкая, особенно на третий день жизни: уровень протромбина (II) составляет 0,37 - 0,59 ЕД/мл, проконвертина (VII) -0,47 - 0,85 ЕД/мл, фактора Кристмасса (IX) - 0,34 - 0,75 ЕД/мл, фактора Стюарта - Прауэра (X) - 0,26 - 0,54 ЕД/мл., затем активность витамин-К-зависимых факторов возрастает, что связано с достаточным поступлением витамина, синтезируемого бактериальной микрофлорой кишечника, и созреванием белковосинтетической функции гепатоцитов [163]. Последующие дни жизни концентрация этих факторов снижается. Физиологическая коагулопа-тия исчезает без специальной фармакологической коррекции к 5 - 7 дню. Уровень фактора VII к концу первой недели жизни достигает 0,62 - 1,16 ЕД/мл., его концентрация достигает нормы взрослых, по данным одних исследователей [111], на 3-ей неделе жизни, по данным других [50] - к 3-4 месяцам и даже к 9-12 [169].
Роль системы гемостаза в патогенезе осложнений инсулинзави симого сахарного диабета (ИЗСД). -
Проблема диабетических микроангиопатий (ДМИАП) важна не только актуальностью диабета в целом, но и тем, что механизмы их развития пока точно не известны [42,80]. В литературе последних лет имеются многочисленные данные о патогенезе и морфогенезе МИАП [11-13,23,65,82,106,122]. Однако эти данные хаотичны и подчас противоречивы. Кроме того, ни один из описанных механизмов не отражает в полной мере все многообразие изменений при данной патологии.
Появились эпидемиологические и экспериментальные данные, констатирующие наличие протромботических изменений в системе гемостаза при ИЗСД [79,122]. Однако роль дисфункции эндотелия и тромбоцитов в формировании этих изменений изучена недостаточно. В частности, до сих пор не установлено, являются ли дисфункция и повреждение эндотелия при инсулинзависимом сахарном диабете следствием [5,14,42] или патогенетическим фактором его развития [105,149,220]. Получение ответа на этот вопрос не только расширит представления о патогенезе МИАП, но и, возможно, позволит модифицировать подходы к её лечению.
Диабетическая микроангиопатия - это комплекс патологических изменений в сосудах микроциркуляции и перимикроваскулярных зонах, развивающихся при сахарном диабете и других нарушениях толерантности к глюкозе [106,149,164]. При ДМИАП изменяются все звенья цепи микроциркуляции: артериолы, капилляры, венулы, межмикрососудистые анастомозы [23,106]. Хотя есть мнение, что первично и наиболее выраженно, поражаются артериолы [121]. Патологические изменения развиваются во всех элементах сосудистой стенки: эндотелии, базальной и эластической мембранах, однако вопрос о механизмах поражения структур сосудистой стенки до сих пор дискутируется [105,149,164].
Все большее значение в возникновении и прогрессировании микроан-гиопатии в последнее время придаётся нарушениям в системе гемокоагуля-ции. У больных сахарным диабетом имеет место синдром хронического внутрисосудистого микросвертывания крови, который является важнейшим фактором микроциркуляторных расстройств, оказывающих влияние на развитие диабетических ангиопатий [129,164,220].
Получены новые факты, доказывающие сложный механизм развития диабетических ангиопатий, включающий метаболические, гормональные, гемореологические, аутоиммунные и другие нарушения [13,106,164,175,252].
По мнению большинства исследователей ДМИАП возникает в результате сложного нарушения взаимодействия свертывающей и противосвер-тывающей систем крови, их активаторов и ингибиторов, тромбоксан-простациклинового баланса, калликреин-кининовой системы, комплемента, а также нарушений тромбоцитарно-сосудистого звена системы гемостаза [149,164,182,252].
Все элементы сосудистой стенки, а именно - клетки эндотелия, су-бэндотелиальный слой, гладкомышечные клетки, участвуют совместно с тромбоцитами в процессе первичного гемостаза.
Известно, что при отсутствии каких-либо повреждений эндотелиоци-ты (ЭЦ) обладают тромборезистентными свойствами [18,88,194,234,257].
Неспособность интактного эндотелия активировать тромбоциты -тромборезистентность (Thromboresistant properties) или атромбогенность (nonthrombogenicity), связана со следующими его особенностями (свойствами):
1) отрицательным зарядом на поверхности, обращенной в сторону просвета сосуда (внешние мембраны тромбоцитов имеют такой же заряд);
2) наличием в нем фермента (АДФ-азы), вызывающего расщепление АДФ, сильного стимулятора агрегации тромбоцитов;
3) способностью синтезировать вещества, угнетающие функциональную активность тромбоцитов (простациклин , N0 и 13-гидрокси-9,11- окта-декадиеновая кислота);
4) наличием белка тромбомодулина, специфически связывающего и инактивирующего фермент тромбин;
5) активностью ингибиторов протеаз системы свертывания крови (антитромбин III и альфа2-макроглобулин) в эндотелиоцитах;
6) способностью синтезировать и высвобождать в кровоток активатор плазминогена (тканевой активатор плазминогена), инициирующий процессы растворения (лизиса) фибрина (фибринолиз);
7) наличием гепаринсодержащих протеогликанов на поверхности клеток, которые ускоряют зависимую от антитромбина Ш нейтрализацию многих сериновых протеиназ каскада свертывания крови [6,21,55,57,88];
В то же время эндотелиальные клетки способны проявлять и прокоа-гулянтные свойства. Эти свойства заключаются в их способности продуцировать фактор активации тромбоцитов (PAF - Platelet activating factor), ингибиторы активаторов плазминогена и тканевый фактор, который экспрессиру-ется на поверхности активированного эндотелия. Он стимулирует активацию внешнего и альтернативного механизмов свертывания крови. При физиологических состояниях организма баланс антикоагулянтных и прокоагулянтных свойств сдвинут в пользу его антикоагулянтного потенциала [6,20,112].
Развитие функциональных или морфологических повреждений сосудистой стенки приводит к смене тромборезистентных свойств ее люминаль-ной поверхности на прокоагулянтные, что может инициировать процесс тромбообразования [159,186,256,264]. В зависимости от природы повреждающего фактора эти изменения могут носить кратковременный характер (начальная стимуляция эндотелиоцитов опосредуется преимущественно тромбином) или приобретать признаки хронического процесса [66,170,205].
Среди веществ, способствующих тромбообразованию и синтезируемых в эндотелиоцитах, наибольшее значение имеют фибриноген, V, IX, X, ХЗ и XII факторы свертывания крови, калликреин, ингибиторы фибринолиза, блокаторы рецепторов плазминогена, тромбоксан А2 и эндотелии [21,47,49,89,133,212]. Гликозилирование захватывает преимущественно белковые элементы противосвертывающей системы, что является дополнительным фактором местного тромбообразования [6,108,216]. Коагулянты по каким-то причинам обладают относительной устойчивостью к метаболическому повреждению.
Характеристика обследованных групп больных
Объектом данного исследования явились 97 детей в возрасте от 4 до 14 лет. Первую группу исследования составили 14 детей с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом. Вторую - 22 ребенка с длительностью заболевания до пяти лет, без осложнений в виде диабетической мик-роангиопатии (ДМИАП). Третью группу составили 12 детей, имеющих ДМИАП, при этом у всех детей третей группы была диагностирована диабетическая нефропатия, а у четверых данное осложнение сочеталось с простой диабетической ретинопатией.
Четвертую (контрольную) группу составили клинически здоровые дети - 49 человек, не имеющих факторов риска по сахарному диабету, с нормальной толерантностью к глюкозе, без каких-либо нарушений системы гемостаза. Пациенты с инфекционными и соматическими заболеваниями, которые могут сопровождаться изменениями в системе гемостаза, не включались в исследование.
Взятие крови у каждого ребенка производилось однократно как часть диагностического обследования, с согласия пациента и его родителей: у детей 1-3 групп перед выпиской из стационара, при достижении компенсации и субкомпенсации сахарного диабета. Для оценки компенсации диабета использовались показатели суточной гликемии, гликозилированного гемоглобина, липопротеидов, холестерина, тесты на кетонурию. Из 48 обследуемых у 38 диабет был компенсирован, у 10 - субком-пенсирован. Критерии компенсации сахарного диабета 1 типа представлены в таблице 2.
Фактор Виллебранда (фВ) занимает узловое место во взаимодействии трех звеньев системы гемостаза — сосудистого, тромбоцитарного и коагуля-ционного. Фактор Виллебранда играет важнейшую роль, как в процессе адгезии тромбоцитов, так и активации свертывания крови. Поскольку фВ синтезируется в эндотелии сосудов, повышение его уровня в плазме является одним из маркеров повреждения сосудистой стенки при различных предтром-ботических состояниях, тромбозах, системных микротромбоваскулитах и ДВС-синдромах [28].
Определение фактора Виллебранда проводили методом Brinkhaus et al, Evans, Austen, в модификации Б. Ф. Архипова, Л. 3. Баркагана, Л. В. Марам-зиной 1982.
В ходе опыта определяли влияние содержащегося в плазме фактора Виллебранда на агглютинацию отмытых и формалинизированных донорских тромбоцитов под воздействием ристомицина. В основе метода лежит установленный факт, что тромбоциты, обработанные раствором формалина, сохраняют способность к ристомицинагглютинации в присутствии фактора Виллебранда, но не подвержены ни спонтанной агрегации, ни агрегации под влиянием физиологических индукторов процесса (АДФ, адреналина, тромбина и др.).
В предлагаемой модификации вместо венозной крови использовали 0,1 мл крови, взятой после прокола кожи пальца, в силиконированной пробирке смешивали с 0,01 мл раствора цитрата натрия. Затем отделяли плазму по методу Обута Т.А.
В силиконированной пробирке смешивали 0,25 мл взвеси тромбоцитов, 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,025 мл исследуемой плазмы. Полученную смесь и раствор ристомицина одновременно помещали в водяную баню при 37, через 2 мин инкубации 0,05 мл раствора ристомицина вносили в пробирку с исследуемой смесью, немедленно включали секундомер. Определяли время образования первых видимых глазом агтлюти-натов тромбоцитов. В таком же порядке определяли время агглютинации тромбоцитов исследуемой плазмы, разведенной в отношении 1:10. Результаты определения времени агглютинации фиксированных тромбоцитов в исследуемой цельной плазме и при разведении ее 1:10 откладывали на билога-рифмическую бумагу. Время агглютинации в секундах переводили в процентное содержание фактора Виллебранда по калибровочной кривой.
Активированное парциальное тромбопластиновое время, тест, характеризующий «внутренний» путь свертывания
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 в среде Windows"98 на базе PC Pentium. Рассчитывались показатели непараметрической статистики, осуществлялось сравнение полученных данных по методу Колмогорова-Смирнова, проводился дисперсионный и корреляционный анализы.
Программа Microsoft Exell 7.0 использовалась для математической обработки полученного материала с применением методов вариационной статистики и вычислением средней арифметической величины (М), среднего квадратичного отклонения (С), ошибки средней арифметической (т) и t-критерия Стьюдента. Достоверными считались результаты при коэффициенте достоверности р 0,05.
Повреждение эндотелия - важный фактор в патогенезе диабетической микроангиопатии. Наиболее часто используемые маркеры - это растворенные в плазме субстанции, такие как фактор Виллебранда, тромбомодулин, тканевой активатор плазминогена и адгезивные молекулы. В 70-е годы было предложено обнаружение в крови циркулирующих эндотелиоцитов в качестве маркера повреждения эндотелия. Нами было проведено исследование плазмы крови 48 пациентов с инсулинзависимым сахарным диабетом. Подробная характеристика обследованных групп описана в разделе "Материалы и методы исследования". Следует напомнить, что все больные были подразделены на три группы на основании длительности заболевания и наличия сосудистых осложнений: «1» - первая группа - 14 детей с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом, «2» - вторая - 22 ребенка с длительностью заболевания до пяти лет, без осложнений в виде диабетической микроангиопатии (ДМИАП), «3» - третья группа - 12 детей, имеющие диабетические микроангиопатии. Контрольную группу составили клинически здоровые дети - 49 человек.
Содержание циркулирующих эндотелиоцитов крови определяли по методу Hladovec et al (1973). Процентное содержание фактора Виллебранда в исследуемой плазме определяли по максимальной скорости ристомицин-индуцированной агглютинации (Evans), как описано в главе 2.2.
Количество циркулирующих эндотелиоцитов в крови больных инсулинзависимым сахарным диабетом было повышено по сравнению с клинически здоровыми детьми не зависимо от длительности и степени тяжести заболевания. При сравнении содержания циркулирующих эндотелиоцитов крови между обследуемыми группами выявлено статистически значимое повыше ниє уровня циркулирующих эндотелиоцитов крови во всех обследованных группах больных, составляя соответственно: 10,8 ±1,2 ед./мкл в группе с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом, 14,2 ±1,1 ед./мкл в группе с инсулинзависимым сахарным диабетом без осложнений, 22,3 ±1,6 ед./мкл в группе с инсулинзависимым сахарным диабетом с диабетической микроангиопатией (р. 0,012). Количество циркулирующих эндотелиоцитов крови в контрольной группе составило 6 ± 1 ед./мкл (табл. 4, рис 1).
Одним из важнейших маркеров повреждения эндотелия является фактор Виллебранда.
Как уже упоминалось в обзоре литературы, источниками продукции фактора Виллебранда (фВ) при инсулинзависимом сахарном диабете могут являться клетки, вовлеченные в иммунологические реакции, такие как эндо-телиальные, гладкомышечные, фибробласты [65], каждые из которых различным образом могут быть востребованы в патогенезе диабетической мик-роангиопатии.
Результаты наших исследований показали, что при развитии инсулин-зависимого сахарного диабета происходит увеличение содержания фактора Виллебранда - свидетельствующее о нарастании тромбогенного потенциала сосудистой стенки (таблица 5, рисунок 2). Следует отметить, что усиление продукции фактора Виллебранда было описано при ряде других заболеваний: при васкулитах у детей [68,70], при системной красной волчанке[64], при ишемической болезни сердца и атеросклерозе [57], при ревматоидном артрите [66]. Каждое из перечисленных патологических состояний, характеризуется выраженным воспалением, что применительно к диабетической микроан-гиопатии, и, на основании полученных нами данных, позволяет предположить наличие хронического характера аутоиммунного воспаления. Продолжающееся воспаление подразумевает активацию синтеза провоспалительных цитокинов, таких как TNFa and INFy, являющихся мощными потенциальными индукторами фактора Виллебранда. Поскольку было продемонстрировано, что при инсулинзависимом сахарном диабете резко повышено количество клеток, экспрессирующих адгезивные молекулы различных цитокинов в периферической циркуляции [69], представляется вероятным, что гиперпродукция фактора Виллебранда является следствием гиперпродукции цитокинов в ходе хронического аутоиммунного воспаления.
