Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы
Глава 1. Биологические свойства TLR — структура, специфичность, внутриклеточный каскад, гены-мишени 13
Глава 2. Вклад кишечного эпителия в естественноый иммунитет слизистой кишечника 21
Глава 3. Экспрессия и функции TLR в эпителии кишечника 26
ЧАСТЬ II. Собственные исследования
Глава 4. Материалы и методы 29
4.1. Клеточные культуры и реагенты для их культивирования.
4.2. Векторы эскспрессии и последовательности кДНК.
4.3. Гены-репортеры.
4.4. Транзиторная экспрессия генов в клеточных культурах, стимуляция клеток и анализ клеточной активации .
4.5. Бактериальные штаммы и их культивирование.
4.6. Бактериальная инфекция клеточных культур.
4.7. Метод коиммунопреципитации и Western blot.
4.8. Метод иммуногистохимии и иммунофлюоресции.
4.9. Метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR).
4.10. Определение уровня продукции цитокинов методом ELISA.
4.11. Статистическая обработка данных.
Глава 5. Результаты.
5.1. Экспрессия TLR в эпителии тонкого и толстого кишечника человека
5.1.1. Субпопуляция. кишечного эпителия ко-экспрессирует TLR1, TLR2HTLR4 46
5.1.2. Клетки кишечного эпителия, экспрессирующие TLR1, TLR2
и TLR4, морфологически однородны и принадлежат к энтероэндокринной линии 52
5.2. Функциональные взаимодействия между TLR1, TLR2 и TLR4 .
5.2.1. Совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к физическому взаимодействию двух молекул
5.2.2. Функциональная синергия между TLR1 и TLR2 67
5.3. Биологическая роль TLR в кишечном эпителии.
5.3.1. Модель функцональных рецепторных комплексов TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD4 на основе клеточной линии эпителия кишечника человека САСО-2 72
5.3.2. TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами 80
5.3.3. TLR4/MD2 и TLR1/TLR2 обладают специфичностью к разным составляющим грам-отрицательных бактерий 84
5.3.4. Кишечная микрофлора активирует TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 94
5.3.5. Стимуляция эпителиальных TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 ведет к продукции провоспалительных хемокинов 98
ЧАСТЬ III. Обсуждение результатов 105
Выводы 115
Список литературы
- Вклад кишечного эпителия в естественноый иммунитет слизистой кишечника
- Транзиторная экспрессия генов в клеточных культурах, стимуляция клеток и анализ клеточной активации
- Функциональные взаимодействия между TLR1, TLR2 и TLR4
- TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Все многоклеточные организмы колонизированы множеством микробов, формирующих так называемую микрофлору. Более 1013 бактериальных микроорганизмов населяют кишечник, играя жизненно важную роль в физиологической деятельности желудочно-кишечного тракта и обеспечивая организм множеством незаменимых факторов. Установление взаимовыгодных отношений между организмом-хозяином и паразитирующим микробом ведет к формированию симбиотического равновесия (Hooper and Gordon 2001). Метаболизм питательных веществ и органических молекул, поддержание роста кишечного эпителия, индукция процесса васкуляризации, развитие лимфоидной ткани, а также препятствие колонизации патогенных бактерий являются только некоторыми примерами полезного эффекта, оказываемого кишечной микрофлорой (Berg 1995).
Иммунная система в норме обладает свойством относительной толерантности к кишечной микрофлоре. После заселения тканей кишечника новорожденных нормальной бактериальной микрофлорой местная иммунная реакция ограничивается так называемым "физиологическим воспалением", проявляющимся в необратимой инфильтрации слизистой кишечника лейкоцитами, формировании лимфоидных фолликулов и создании эпителильного барьера в результате усиления межэпителиальных взаимодействий (Maaser and Kagnoff 2002). Вследствие установления биологического равновесия между бактерильной флорой и организмом хозяина жизнедеятельность кишечной микрофлоры ограничивается кишечным просветом.
В отличие от нормальной микрофлоры, большинство бактериальных патогенов, поражающих кишечный тракт, обладают способностью проникать в клетки кишечного эпителия, пересекать эпителиальный барьер и заселять подлежащие ткани, вызывая немедленную реакцию со стороны иммунной системы и развитие острого воспаления слизистой кишечника (Sansonetti 2002).
При наличии определенной генетической предрасположенности присутствие бактериальной микрофлоры играет критическую роль в инициации и развитии неспецифических воспалительных заболеваний кишечника, включающих болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (Podolsky 2002). Данная группа заболеваний характеризуется формированием хронического воспаления кишечника, главной причиной которого считается неадекватный ответ иммунной системы к кишечной микрофлоре (Farrell and LaMont 2002).
Понимание механизмов взаимодействия кишечной микрофлоры с иммунной системой хозяина представляет как высочайший научный, так и клинический интерес. Ключевые факторы, сдерживающие постоянный натиск бактериальной микрофлоры, но быстро реагирующие на инвазию бактериальных патогенов, остаются практически не изученными. Учитывая недавнее открытие семейства Толл-лайк Рецепторов (Toll-like Receptors - TLR), специализирующихся на распознавании бактериальных компонентов, целью исследования явилось изучение экспрессии и функций TLR на кишечном эпителии - клеточной популяции, первой вступающей в контакт с кишечными бактериями.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
-
охарактеризовать экспрессию TLR1 - TLR5 в эпителии кишечникачеловека;
-
базируясь на результатах экспрессии TLR в первичном эпителии, создать модель in vitro на основе клеточной линии эпителия кишечника, экспрессирующую функциональные TLR;
-
на базе созданной клеточной модели охарактеризовать специфичность эпителиальных TLR как к изолированным бактериальным компонентам, так и к интактным бактериальным энтеропатогенам.
-
на базе созданной клеточной модели оценить чувствительность эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре;
-
определить потенциальные гены-мишени для эпителиальных TLR
Научная новизна и практическая значимость
Дана характеристика экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 в кишечном эпителии.
Впервые выявлена дифференцированная субпопуляция клеточного эпителия, коэкспрессирующая TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащая к энтероэндокринной линии.
Впервые показано, что функциональная синергия между TLR1 и TLR2 базируется на физическом взаимодействии двух молекул.
Впервые при помощи экспериментальной модели in vitro, созданой на базе клеточной линии эпителия кишечника человека, определена специфичность TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к грам-положительным и грам-отрицательным кишечным патогенам.
Впервые с использованием той же экспериментальной модели проведена оценка чувствительности TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к кишечной микрофлоре.
Впервые охарактеризованы гены-мишени для экспрессированных в клеточной линии эпителия человека TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.
На основе полученных результатов была предложена новая концепция о роли эпителиальных TLR в иммунном ответе слизистых кишечника.
Апробация работы. Результаты работы доложены на международных конференциях Digestive Disease Week, Сан Диего, США, май 2000; CCFA Signal Transduction Workshop, Амилия айлэнд, Флорида, США; декабрь 2000, FASEB, Орландо, США, апрель 2001; Cytokines and Interferons, Турин, Италия, October 2002; Digestive Disease Week, Новый Орлеан, США, май 2004. Материалы диссертации обсуждены на научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамапеи РАМН 2 ноября 2004 года.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 работы.
Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, трёх глав обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (124 зарубежных и 2 отечественных источников). Работа изложена на 115 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и двумя схемами.
Вклад кишечного эпителия в естественноый иммунитет слизистой кишечника
Использование вышеперечисленных экспериментальных моделей, а в частности, анализ TLR-"knock out" мышей, позволило определить специфичность большинства членов семейства TLR. Так, TLR4 и TLR2 - одни из наиболее изученных членов семейства TLR -вовлечены в распознавание бактериальных РАМР. В частности, TLR4 является рецептором для ЛПС [19, 20]. Мыши линий S3H/HeJ и C57BL/10ScN, особенностью которых является неспособность развивать эндотоксинный шок в ответ на введение ЛПС, несут естественные мутации в гене TLR4. TLR2 узнает липопротеины, пептидогликан (ПГН), и другие компоненты грам-положительных бактерий, клеточную стенку дрожжей [14, 21-23]. В результате мыши с отсутствующим TLR4 проявляют повышенную чувствительность к грам-отрицательным патогенам Salmonella typhimurium, Neiserria meningitides и Haemophilus influenza, а мыши с "нокаутированным" TLR2 подверженны инфекции грам-положительным Staphylococcus aureus [24]. В результате ряда исследований было показано, что TLR2 может взаимодействовать с двумя другими членами семейства TLR: TLR1 и TLR6 [15, 16, 25]. Если взаимодействие с тем или иным корецептором отражается на специфичности TLR2, это объясняет высокое разнообразие лигандов, узнаваемых TLR2. При этом, способность TLR1 и TLR6 распознавать РАМР в отсутствии TLR2 остается под вопросом. TLR5 _и_TLRll также вовлечены в распознавание бактериальных компонентов: TLR5 узнает компонент бактериальных флагелл флагеллин [26], TLR11 экспрессируется в почках и активируется уропатогенной Е. coli, хотя химическая природа лиганда для TLR11 пока неизвестна [27]. Другая подгруппа семейства TLR включает TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, общим свойством которых является специфичность к нуклеиновым кислотам бактериального и вирусного происхождения. В частности, TLR3 узнает двух-цепочечную РНК, TLR7 и TLR8 активируются одноцепочными РНК, обогащенными гуанином и урацилом (TLR7) или содержащими polyU мотивы (TLR8), TLR9 взаимодействует с неметилированной CpG ДНК. Интересно, что TLR7, TLR8, TLR9 и в меньшей степени TLR3 активируются соответствующими лигандами во вігутриклеточньїх мембранных компартментах, что, по-видимому, является преднамеренной изоляцией этих TLR от возможного контакта с эндогенными нуклеиновыми кислотами [28]. Растущий список микробных компонентов, способных стимулировать TLR, отражает функциональную сложность данного семейства рецепторов.
Для эффективного взаимодействия с РАМР TLR могут нуждаться в присутствии дополнительных молекул. Например, совместная экспрессия TLR4 и CD 14, содержащего GPI-мотив И не способного передавать сигнал внутрь клетки, повышает чувствительность TLR4 к ЛПС [29]. Присутствие другой молекулы MD2, присоединяющейся к внеклеточной части TLR4, необходимо для полноценного функционирования TLR4 [30-33]. Способность к димеризации добавляет дополнительный уровень сложности в функционировании TLR [34]. TLR4 существует в виде гомодимера, в то время как _некоторые_члены_семейства TLR, а властности TLR1, TLR2 и TLR6, способны взаимодействовать друг с другом с формированием гетеродимерных пар [15,16, 25].
TLR представляют собой трансмембранные гликопротеины первого типа с одним трансмембранным доменом [35]. Внеклеточная часть молекулы TLR содержит 19-25 расположенных в виде цепочки аминокислотных последовательностей, обогащенных лейцином (LRR -leucine rich repeats). Считается, что LRR отвечают за непосредственное взаимодействие рецептора с РАМР. Внутриклеточная часть TLR содержит сигнальный домен TIR (Toll/IL-1 Receptor related), обладающий высокой степенью гомологии с сигнальным доменом рецептора для IL-1 (IL-1R) [36]. Взаимодействие внешней части рецептора с соответствующим лигандом ведет к конформационным изменениям в TIR-домене и привлечению соответствующих сигнальных молекул. Аналогично IL-1R, стимуляция TLR ведет к активации фактора транскрипции NF-кВ И продукции свойственных воспалительному процессу генов вследствие индукции MYD88-зависимого внутриклеточного сигнального каскада [37]. MYD88, существующий в виде гомодимера, содержит два важных элемента: TIR домен, взаимодействующий с TIR доменом TLR, и DD (Death domen - смертельный домен), связывающий следующий элемент сигнального МУБ88-зависимого сигнального каскада IRAK4. IRAK4 при посредничестве IRAKI связывается с TRAF6. Активация TRAF6, в свою очередь, ведет к активации факторов транскрипции NF-кВ И API при посредничестве ТАКІ, TABl, ТАВ2 и протеинового комплекса IKK. В неактивированной клетке NF-кВ аккумулируется в цитоплазме в комплексе с ингибирующими протеинами семейства 1-кВ. Фосфорилированпе протеинов 1-кВ посредством активированного IKK вызывает их деградацию и высвобождение NF-кВ, который, в свою очередь, мигрирует в ядро, связывается с NF-кВ-связывающими элементами генома и иницирует транскрипцию NF-кВ-зависимых генов.
Транзиторная экспрессия генов в клеточных культурах, стимуляция клеток и анализ клеточной активации
Результаты экспериментов in vitro поддерживают данное предположение. Так, внутриклеточная бактериальная инфекция эпнтелильного монослоя на основе клеточных линий эпителия кишечника_ведет_к_продукции _и_секреции_ряда_провоспалительных цитокинов, обладающих свойствами хемоатрактантов, а в частности IL-8, GRO-a, GRO-P, GRO-y и ENA-78 [52-55]. Эти цитокины принадлежат к семейству С-Х-С хемокинов и характеризуются способностью привлекать полиморфноядерные лейкоциты в очаг воспаления. Активированный эпителий также способен продуцировать С-С хемокины, включая МСР-1, MIP-loc, MIP-lp, RANTES [56, 57], которые отвечают за хемотаксис моноцитов/макрофагов, эозинофилов и некоторых субпопуляций Т-клеток. Эти данные предполагают, что во время воспалительного процесса эпителий не только может выступать в качестве инициатора воспалительной реакции, но и обладает способностью оркестрировать иммунный ответ с вовлечением различных клеточных популяций. Помимо хемокинов, активированный эпителий способен секретировать другие провоспалительные цитокины, такие как TNF-a, GM-CSF, IL-la и IL-P, хотя экспрессия этих цитокинов значительно ниже по сравнению с хемокинами [56, 58]. Интересно, что кишечный эпителий не способен синтезировать цитокины, характерные для адаптивного иммунного ответа, такие как IL-2, IL-4, IL-5 и INF-y [56]. Таким образом, секретируемые эпителием биологические факторы играют преимущественную роль в инициации и регуляции естественного иммунитета. В дополнение к секретируемым цитокинам, активированный кишечный эпителий способен продуцировать такие биологически активные вещества, как простогландины Е2 и F2a [59] и оксид азота N0 [60].
Помимо продукции секретируемых факторов, клетки кишечного зпителия экспрессируют антиген-презентирующие _ молекулы МНС class II и CD Id [61]. Кроме того, кишечный эпителий экспрессирует рецепторы для ряда цитокинов, включая INF-y, IL-1, TNF-a, TGF-pi, IL-12, IL-4, IL-7 и IL-9 [62], что свидетельствует о способности кишечного эпителия отвечать на стимулы, исходящие из подлежащей слизистой. Активация поляризованного эпителия вследствие внутриклеточной бактериальной инфекции или стимуляции провоспалительными цитокинами IL-lp или TNF-a ведет к экспрессии рецептора адгезии ICAM-1 [62-64], необходимого для трансэпителиальной миграции ПМЛ с целью предотвращения продолжающейся бактериальной инвазии.
Хотя вовлеченность эпителия в им\гунный ответ слизистых кишечника не оставляет никаких сомнений, механизмы эпителиально-бактериальных взаимодействий, ведущие к активации эпителиальных клеток, не известны. Возможные причины эпителиальной активации обсуждаются в обзорной статье [65] на примере Salmonella. Так, в роли активирующего фактора может выступать непосредственный процесс внедрения патогена внутрь клетки. На ранних этапах взаимодействия Salmonella с интактной эпителиальной клеткой происходит реорганизации клеточного цитоскелета при участии бактериальных протеинов гена SPI-1 системы третьего типа секреции (TTSS). В то же время, SPI-1 протеины способны стимулировать эпителиальные Rho GTP-азы, что ведет к активации МАРК-зависимых сигнальных каскадов (Erk, р38, JNK) и ядерной транслокации факторов транскрипции АР-1 и NF-KB, инициирующих транскрипцию провоспалительных цитокинов. Кроме SPI-1 протеинов, Salmonella содержит_целый_ряд.других_молекул_или_РАМР_(ЛПС,_липопротеин, флагеллин и т.д.), распознаваемых рецепторами естественного иммунитета TLR и Nod. Так, Nodi является внутриклеточным рецептором, распознающим мурамиловую кислоту грам-отрицательных бактерий [66]. Так как эпителиальные линии кишечника конституционально экспрессируют Nodi, было предложено, что стимуляция Nodi может быть одним из альтернативных механизмов активации инфицированных эпителиоцитов, хотя присутствие Nodi в первичном эпителии кишечника остается под вопросом [67]. Экспрессия кишечным эпителием другого семейства рецепторов естественного иммунитета TLR противоречива. Учитывая, что TLR способны распознавать внеклеточные лиганды, логично предположить, что с целью избежания контакта с бактериальной флорой экспрессия TLR на апикальной части эпителия отсутствует. Ослабление межэпителиальных контактов и повышение эпителиальной проницаемости вследствие бактериальной транслокации может вести к взаимодействию базально экспрессированных TLR с бактериальными лигандами и дополнительному усилению воспалительного ответа слизистых.
Функциональные взаимодействия между TLR1, TLR2 и TLR4
Культуры растущих в виде монослоя перевиваемых адгезивных клеточных линий человека 293Т (эмбриональный почечный эпителий) и САСО-2 (колоректальная аденокарцинома со свойствами эпителия толстого кишечника) поддерживались в инкубаторе при 37 С, 5% СОг в среде DMEM, содержащей 4.5 g/ml глюкозы и L-глутамина (Cellgro, Mediatech, Inc., США), с добавлением 10% эмбриональной бычей сыворотки (Sigma, США) и однократного раствора пеницилинна / стрептомицина (Cellgro, США). Клеточные линии были приобретены в American Tissue Culture Collection (АТСС), США.
Использованные в данной работе липополисахариды (ЛПС; Sigma, США) были выделены в промышленных условиях из Salmonella typhimurium (содержание протеина 3%) или S. enteritidis (содержание протеинов 1%; RNA 1%). Стандартный ЛПС (S. enteritidis), приобретенный в Sigma, был дополнительно очищен в лабораторных условиях методом модифицированной фенольной экстракции в соответствии с ранее опубликованным протоколом [77].
Плазмиды рМВ1, содержащие дикий тип генов TLR1 и TLR4 человека, содержащие HAag, были предоставленны Феликсом Рандоу (Felix Randow, Harvard Medical School, США). Дикий тип гена MD2 человека, включающего FlagHis6ag и клонированного в плазмиду pEF-BOS, был предоставлен Кенсуке Мияке (Kensuke Miyake, Saga Medical School, Япония). Дикий тип гена TLR2 человека, несущий gDag,„a также_доминантно-негативная _ форма гена TLR2 человека (dnTLR2), клонированные в плазмиду RKN, были предоставлены Полом Годовским (Paul Godowsky, Genentech, США). Дикий тип гена TLR6 человека, содержащий mycag и клонированный в плазмиду pEF-BOS, был предоставлен Шизуо Акира (Shizuo Akira, Osaka University, Япония).
Плазмидный вектор, несущий мультимеризованный элемент NF-кВ IgK, клонированный в непосредственной близости с геном люциферазы, был предоставлен Адрианом Тингом (Adrian Ting, Mount Sinai School of Medicine, США). Плазмида pCMVp, содержащая ген p-галактозидазы, была приобретена в Clontech, США. "Пустой" вектор pCDNA3 был приобретен в Promega, США.
Клеточные линии 293Т и САСО-2 культивировались в 24-х луночных плашках. В момент достижения неполного монослоя культивируемые клетки были подвержены транзиторной трансфекции при помощи коммерческого набора Lipofectamine PLUS (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом изготовителя. Для трансфекции клеточной линии 293Т были использованы следующие плазмиды в комбинациях, указанных в главе "Результаты": TLR1 - 0.085-0.00085 Ug/ml (оптимальная концентрация 0.085 Ug/ml), TLR2 - 0.005 ig/ml, TLR4 - 0.085-0.00085 p:g/ml; гены-репортеры pCMV-P-галактозидаза (0.01 Ug/ml) и NF-кВ-люцифераза (0.01 Hg/ml). Чтобы стандартизировать реакцию трансфекции, конечная концентрация плазмидной ДНК доводилась до 1 Ug/ml путем добавления "пустого" вектора pCDNA3. Клеточная линия САСО-2 была подвержена трансфекции плазмидами в следующих концентрациях: TLR1 - 0.15-0.0015 Ug/ml (оптимальная концентрация 0.015 pg/ml), TLR6 - 0.15-0.0015 jug/ml (оптимальная концентрация 0.015 ug/ml), TLR2 - 0.01-0.001 uVmg, dnTLR2 - 0.4 ug/ml, TLR4 - 0.01 ug/ml и MD2 - 0.05 ug/ml; гены-репортеры pCMV-P-галактозидаза (0.35 Ug/ml), NF-KB-luciferase (0.1 US/ml)» IL-8-люцифераза (0.1 Ug/ml); а также "пустой" вектор pCDNA3 (конечная концентрация плазмидной ДНК 1 Ug/ml) в комбинациях, указанных в главе "Результаты". Через 16 часов после окончания трансфекции в клеточные культуры были добавлены отдельные компоненты бактериальных клеточных стенок (ЛПС или ПГН) или бактериальные суспензии Salmonella paratyphi, Shigella flexnerii, Listeria monocytogenes, дикого (H44/76) и мутантого (pLAK33) штаммов Niesseria meningitides или кишечной микрофлоры. Через 8 часов после начала стимуляции/инфекции клетки были лизированы в 100 ці лизирующего буфера (Reporter Lysis Buffer, Promega, США), и люциферазная активность была измерена при помощи люминометра (Turner Designs Luminometer TD20/20, Promega, США) с применением соответствующего набора (Luciferase Assay System, Promega, США). Люциферазная активность была нормализована относительно отражающей эффективность трансфекции активности Р-галактозидазы в том же клеточном лизате [78]. Отношение двух параметров -люциферазной и Р-галактозидазной активностей - было использовано для статистического анализа. Одновременно проводилось 4-6 __ экспериметов (см. описания к рисункам). Каждый элсперимент повторялся четыре раза. На рисунках представлены результаты статистической обработки одного из четырех повторов.
TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами
Так как вышеописанная субпопуляция кишечного эпителия коэкспрессирует несколько членов семейства TLR: TLR1, TLR2 и TLR4, следующей задачей данного исследования явилось изучение функционального значения присутствия TLR1, TLR2 и TLR4 в одной клетке. Ранее было показано, что рецептор для IL-I, содержащий внутриклеточный домен TIR и эволюционно близкий к рецепторам семейства TLR, является гетеродимерной структурой, образованной двумя субьединицами - IL-1R и IL-1RP [34]. Таким образом, учитывая гомологию внутриклеточных доменов IL-1R и TLR, было сделано предоложение, что с целью расширения спектра распознаваемых антигенов члены семейства TLR могут взаимодействовать друг с другом с образованием различных гетеродимерных комбинаций. С целью изучения физического взаимодействия между TLR1, TLR2 и TLR4 была создана клеточная модель на базе недифференцированной эмбриональной клеточной линии человека 293Т, широко используемой для исследовний функций TLR [22, 87, 88]. Три возможные комбинации TLR1, TLR2 и TLR4 были экспрессированы в клеточной линии 293Т медом транзиторной трансфекции векторов экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 с последующим определением физических взаимодействий между TLR1 и TLR2, TLR1 и TLR4, TLR2 и TLR4 методом коиммуноприципитации клеточных лизатов с использованием специфических антител: анти-НА для преципитации и иммуноблотинга TLR1 и TLR4, содержащих HAag, и aimiLR2 для преципитации и иммуноблотинга TLR2. В клетках, трансфецированных комбинацией векторов экспрессии TLR1 и TLR2, взаимодействие между TLR1 и TLR2 было продемонстрировано путем иммунопреципитации трансгенного TLR1 антителами против НА с последующим иммуноблотом преципитата антителами против TLR2 (Рисунок 6А, справа), а также проведением реципрокного эксперимента — преципитации трансгенного TLR2 антителами против TLR2 и иммуноблота трансгенного TLR1 антителами против НА (Рисунок 6А, слева). Иммуноблот был отрицательным в случае замены специфических антител неспецифическими изотопическими иммуноглобулинами (IgG козы вместо антител против TLR2 и IgG мыши вместо антител против НА), одиночной экспрессии TLR1 и TLR2 (Рисунок 6А) или замены антител против TLR2 антителами против TLR4 (данные не показаны). Таким образом, данные результаты демонстрируют, что совместная эксрессия TLR1 и TLR2 ведет к связи двух молекул с формированием белкового комплекса TLR1/TLR2. Колокализация TLR1 и TLR2 в клетках кишечного эпителия методом иммунофлюоресценции и конфокальной микроскопии (Рисунок 6Г) подтверждает данное заключение.
Интересно, что преципитированный TLR1 обладает большей молекулярной массой по-сравнению с непреципитированным TLR1 (Рисунок 6А, слева). Чтобы определить, подвергается ли преципитированный TLR1 пост-трансляционным модификациям, а в частности, гликозилированию с присоединеним углеводных цепей к молекулам азота аналогично TLR2 [89], преципитированные иммуные комплексы были обработаны эндогликозидазой Н или пептид-N-гликаназой F и анализированы методом Western blot. В результате энзиматической реакции преципитированный TLR1 мигрировал в SDS-PAGE с той же скоростью, что и непреципитированный протеин (данные не показаны). Таким образом, гликозилирование TLR1 может быть необходимо для формирования гетеродимера TLR1/TLR2.
Эндогенная экспрессия TLR1, но не TLR2 и TLR4 в клеточной линии 293Т была зафиксиривана методом RT-PCR (Рисунок 6Б). Взаимодействие между эндогенным TLR1 и трансгенным TLR2 (293Т, трансфецированные вектором экспрессии TLR2) было подтверждено путем преципитации TLR1 антителами против TLR1 и иммуноблотом TLR2 антителами против TLR2. Антитела против TLR1, использованные в данной работе, не определяют денатурированный протеин, в связи с чем проведение реципрокного эксперимента — преципитации TLR2 и иммуноблотинга TLR1 - оказалось невозможным (Рисунок 6В).
В случае совместной экспрессии TLR1 и TLR4 или TLR2 и TLR4, иммуноблот был отрицателен как при преципитации TLR1 и детекции TLR4 или преципитации TLR2 и детекции TLR4, так и при реципрокном экспериментах, указывая на специфичность взаимодействий между TLR1 и TLR2.
